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Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

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DOI :

10.3791/52475

19 février 2015

Dans cet article

Résumé

Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.

Résumé

La dégénérescence des neurones dopaminergiques mésencéphaliques (mesDA) est la caractéristique pathologique de la maladie de Parkinson. L’étude des processus biologiques impliqués dans les fonctions physiologiques et la vulnérabilité et la mort de ces neurones est essentielle pour comprendre les causes sous-jacentes et découvrir le remède à cette maladie neurodégénérative courante. Les cultures primaires de neurones mesDA fournissent un outil pour l’étude des propriétés moléculaires, biochimiques et électrophysiologiques, afin de comprendre le développement, la survie à long terme et la dégénérescence de ces neurones au cours de la maladie. Nous présentons ici une méthode détaillée pour l’isolement, la culture et la maintenance des neurones dopaminergiques du mésencéphale à partir d’embryons de souris E12.5 (ou de rats E14.5). Les conditions de culture cellulaire optimisées dans ce protocole entraînent la présence de projections axonales et dendritiques, de connexions synaptiques et d’autres propriétés morphologiques neuronales, qui rendent les cultures appropriées pour l’étude des caractéristiques physiologiques, biologiques cellulaires et moléculaires de cette population neuronale.

Introduction

La perte de neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta conduit à des symptômes moteurs cardinal de la maladie de Parkinson (MP), le deuxième trouble neurodégénératif le plus répandu. La cause sous-jacente de la disparition de cette population neuronale mésencéphalique ne est pas connu. Pour étudier les voies biochimiques responsables du développement et de moduler les propriétés neurophysiologiques et la survie des neurones MESDA, plusieurs culture cellulaire et des systèmes de modèles animaux ont été utilisés. Les lignées cellulaires immortalisées, y compris la dopaminergique chez le rat lignée cellulaire 1RB 3 AN 27 (N27), l....

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Protocole

REMARQUE: Les animaux ont été maintenus et manipulés en conformité avec les directives institutionnelles et toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par la protection des animaux de l'Imperial College et le Home Office et de l'Université Harvard institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) examen éthique du corps (de AWERB) et, en conformité avec les règlements fédéraux et étatiques.

1. réactif et le matériel Setup

  1. Thaw, aliquote et stocker 1 mg / ml solution à -80 ºC laminine. Dissoudre 2 pi dans 1 ml de DMEM / F12, résultant en une concentration de revêtement de 1-2 mg / cm....

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Résultats

Immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (Th) montre que, entre 0,5 à 1% des cellules en culture sont dopaminergique. Projections neuronales apparaissent dans deux heures après placage et par le premier jour, les axones et les dendrites se distinguent (Figure 2), en utilisant la tyrosine hydroxylase (TH) et la protéine 2 (carte2) anticorps associée aux microtubules (Figure 3). Les neurones de survivre pendant plus de six semaines, et montrent une vaste excroissance. Le ratio neu.......

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Discussion

Les neurones dopaminergiques dans le mésencéphale sont la principale source de la dopamine dans le système nerveux central. Ils sont divisés en trois groupes, substantia nigra pars compacta (SNPC), Surface tegmentale ventrale (VTA) et sur ​​le terrain retrorubral (RRF) 10, 11. Les neurones dans SNPC et VTA donnent lieu à des grandes voies dopaminergiques, mésocorticales, mésolimbiques et nigro-striée, impliquées dans les fonctions telles que le contrôle de l'émotion, la motivation et le comportement moteu.......

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Ce travail a été réalisé à l’aide des fonds de démarrage de la Division des sciences du cerveau, du Département de médecine, de l’Imperial College de Londres pour K.N.A.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mélange de nutriments moyen Eagle modifié de Dulbecco F-12Invitrogen11330
saline équilibrée de Hanks (HBSS) (1X), liquideInvitrogen24020-117
Sérum fœtal bovin, inactivé par la chaleur (FBS)Invitrogen16140
N2 Supplement (100X), liquideInvitrogen17502-048
D-(+)-Glucose solution (45 % (en poids/vol) dans l’eauSigmaG8769
Albumine sérique bovine BSASigmaA9430
Laminine d’Engelbreth-Holm-Swarm Sarcome murin Membrane basaleSigmaL2020
Pénicilline/streptomycineInvitrogen15070
Trypsine (0,05 % (en poids/vol)Invitrogen25300
Sérum bovin culture cellulaire d’albumine (BSA) testéeSigma  ;A9418
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)SigmaP3813
Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (Th)Pel-Freez BiologicalsP60101-0  ;
Poly-L-ornithine, solution à 0,01 %SigmaP4957
Anti-Map2 (protéines associées aux microtubules-2A et -2B) AnticorpsMilliporeMAB3418
Anti-Synapsine-1MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 âne anti-lapin IgG  ;   ; sondesmoléculairesd’anticorps A-21206
Alexa Fluor 594 âne anti-lapin IgG  ;   ; sondesmoléculairesA-21207
Alexa Fluor 488 âne anti-mouton IgG  ;   ; sondesmoléculairesd’anticorps A-11015
Alexa Fluor 594 âne anti-mouton IgG  ;   ; sondesmoléculairesA-11016
Alexa Fluor 594 âne anti-souris IgG  ;   ; sondesmoléculairesd’anticorps A-21203
Solution de bleu de trypan (0,4 % (poids/vol))Biowhittaker17-942E
StéréomicroscopeCarl ZeissStemi 2000-C
Microscope à contraste de phase inverséCarl ZeissAxiovert 40 C
Pince Dumont Outilsscientifiques finsMay-45
Pince à glissement de couverture &ndash ; DumoxelFine Scientific Tools11251-33
Deux pinces Dumont #45 &ndash ; DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Porte-lame/briseur à poignée plate - 11cmFine Scientific Tools10052-11
Ciseaux à iris d’étudiant - Droit 11,5 cmOutils scientifiques fins91460-11
Illuminateur halogène à fibre optiqueNikonMKII
Pipettes jetables en verre borosilicaté PasteurFisherbrand13-678-20C
HémocytomètreProscitechSVZ2NIOU
0,2 & micro ; m unités de filtration stérileNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 mm Boîtes de PétriBD Biosciences351005
Round Cover Slip #1 Epaisseur Verre allemand 12 mmBellco Glass1943-10012  ;
Solution d’anticorps

Références

  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P.

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Mots-clés

Culture de neurones primairesdissection du m senc phale ventraldissociation tissulairemicroscopie immunofluorescencemarquage la tyrosine hydroxylaseessai de viabilit cellulairepr paration de lamellesrev tement la lamininemaintien neuronal long terme

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