Article de méthode
Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.
La dégénérescence des neurones dopaminergiques mésencéphaliques (mesDA) est la caractéristique pathologique de la maladie de Parkinson. L’étude des processus biologiques impliqués dans les fonctions physiologiques et la vulnérabilité et la mort de ces neurones est essentielle pour comprendre les causes sous-jacentes et découvrir le remède à cette maladie neurodégénérative courante. Les cultures primaires de neurones mesDA fournissent un outil pour l’étude des propriétés moléculaires, biochimiques et électrophysiologiques, afin de comprendre le développement, la survie à long terme et la dégénérescence de ces neurones au cours de la maladie. Nous présentons ici une méthode détaillée pour l’isolement, la culture et la maintenance des neurones dopaminergiques du mésencéphale à partir d’embryons de souris E12.5 (ou de rats E14.5). Les conditions de culture cellulaire optimisées dans ce protocole entraînent la présence de projections axonales et dendritiques, de connexions synaptiques et d’autres propriétés morphologiques neuronales, qui rendent les cultures appropriées pour l’étude des caractéristiques physiologiques, biologiques cellulaires et moléculaires de cette population neuronale.
La perte de neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta conduit à des symptômes moteurs cardinal de la maladie de Parkinson (MP), le deuxième trouble neurodégénératif le plus répandu. La cause sous-jacente de la disparition de cette population neuronale mésencéphalique ne est pas connu. Pour étudier les voies biochimiques responsables du développement et de moduler les propriétés neurophysiologiques et la survie des neurones MESDA, plusieurs culture cellulaire et des systèmes de modèles animaux ont été utilisés. Les lignées cellulaires immortalisées, y compris la dopaminergique chez le rat lignée cellulaire 1RB 3 AN 27 (N27), l....
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REMARQUE: Les animaux ont été maintenus et manipulés en conformité avec les directives institutionnelles et toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par la protection des animaux de l'Imperial College et le Home Office et de l'Université Harvard institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) examen éthique du corps (de AWERB) et, en conformité avec les règlements fédéraux et étatiques.
1. réactif et le matériel Setup
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Immunohistochimie contre la tyrosine hydroxylase (Th) montre que, entre 0,5 à 1% des cellules en culture sont dopaminergique. Projections neuronales apparaissent dans deux heures après placage et par le premier jour, les axones et les dendrites se distinguent (Figure 2), en utilisant la tyrosine hydroxylase (TH) et la protéine 2 (carte2) anticorps associée aux microtubules (Figure 3). Les neurones de survivre pendant plus de six semaines, et montrent une vaste excroissance. Le ratio neu.......
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Les neurones dopaminergiques dans le mésencéphale sont la principale source de la dopamine dans le système nerveux central. Ils sont divisés en trois groupes, substantia nigra pars compacta (SNPC), Surface tegmentale ventrale (VTA) et sur le terrain retrorubral (RRF) 10, 11. Les neurones dans SNPC et VTA donnent lieu à des grandes voies dopaminergiques, mésocorticales, mésolimbiques et nigro-striée, impliquées dans les fonctions telles que le contrôle de l'émotion, la motivation et le comportement moteu.......
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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Ce travail a été réalisé à l’aide des fonds de démarrage de la Division des sciences du cerveau, du Département de médecine, de l’Imperial College de Londres pour K.N.A.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Mélange de nutriments moyen Eagle modifié de Dulbecco F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| saline équilibrée de Hanks (HBSS) (1X), liquide | Invitrogen | 24020-117 | |
| Sérum fœtal bovin, inactivé par la chaleur (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquide | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45 % (en poids/vol) dans l’eau | Sigma | G8769 | |
| Albumine sérique bovine BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminine d’Engelbreth-Holm-Swarm Sarcome murin Membrane basale | Sigma | L2020 | |
| Pénicilline/streptomycine | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsine (0,05 % (en poids/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Sérum bovin culture cellulaire d’albumine (BSA) testée | Sigma ; | A9418 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (Th) | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 ; | |
| Poly-L-ornithine, solution à 0,01 % | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (protéines associées aux microtubules-2A et -2B) Anticorps | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsine-1 | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 âne anti-lapin IgG ; ; sondes | moléculaires | d’anticorps A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 âne anti-lapin IgG ; ; sondes | moléculaires | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 âne anti-mouton IgG ; ; sondes | moléculaires | d’anticorps A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 âne anti-mouton IgG ; ; sondes | moléculaires | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 âne anti-souris IgG ; ; sondes | moléculaires | d’anticorps A-21203 | |
| Solution de bleu de trypan (0,4 % (poids/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stéréomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Microscope à contraste de phase inversé | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Pince Dumont Outils | scientifiques fins | May-45 | |
| Pince à glissement de couverture &ndash ; Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Deux pinces Dumont #45 &ndash ; Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Porte-lame/briseur à poignée plate - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Ciseaux à iris d’étudiant - Droit 11,5 cm | Outils scientifiques fins | 91460-11 | |
| Illuminateur halogène à fibre optique | Nikon | MKII | |
| Pipettes jetables en verre borosilicaté Pasteur | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hémocytomètre | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0,2 & micro ; m unités de filtration stérile | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Boîtes de Pétri | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Epaisseur Verre allemand 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 ; |
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