Suivi moelle osseuse de souris monocytes In Vivo

Résumé

Les monocytes sont des régulateurs clés de l’immunité innée et jouent un rôle critique dans le renouvellement du système phagocytaire mononucléaire périphérique et en cas d’inflammation. Ce manuscrit décrit la procédure d’imagerie en temps réel de la moelle osseuse de la calvaria de souris pour étudier le mécanisme de mobilisation des monocytes.

Résumé

L’imagerie multiphotonique en temps réel offre une excellente occasion d’étudier le trafic cellulaire et les interactions entre cellules dans leur environnement physiologique en 3 dimensions. Les activités biologiques des cellules immunitaires reposent principalement sur leurs capacités de motilité. Les monocytes sanguins ont une demi-vie courte dans la circulation sanguine ; Ils prennent naissance dans la moelle osseuse et en sont constitutivement libérés. Dans l’état inflammatoire, ce processus est amélioré, conduisant à la monocytose sanguine et à l’infiltration ultérieure des tissus inflammatoires périphériques. L’identification des événements biomécaniques contrôlant le trafic des monocytes de la moelle osseuse vers le réseau vasculaire est une étape importante pour comprendre la pertinence physiopathologique des monocytes. Nous avons réalisé une imagerie time-lapse in vivo par microscopie à deux photons de la moelle osseuse du crâne de la souris Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). La souris MacBlue exprime la protéine fluorescente cyan améliorée (ECFP) sous le contrôle d’un promoteur myéloïde spécifique ¹, en combinaison avec le marquage du réseau vasculaire. Nous décrivons comment cette approche permet de suivre les monocytes médullaires individuels en temps réel afin de quantifier davantage le comportement migratoire au sein du parenchyme de la moelle osseuse et du système vasculaire, ainsi que les interactions intercellulaires. Cette approche fournit de nouvelles informations sur la biologie des sous-ensembles de monocytes de la moelle osseuse et permet d’approfondir la façon dont ces cellules peuvent être influencées dans des conditions pathologiques spécifiques.

Introduction

La moelle osseuse joue un rôle central dans l’hématopoïèse et représente le principal réservoir de monocytes qui recirculent constitutivement entre le sang et le parenchyme médullaire, renouvellent le pool de monocytes circulants à courte durée de vie ^2,3 et participent à la reconstitution des tissus à l’état stationnaire-macrophages et cellules dendritiques ⁴. Au cours de l’inflammation ou après une aplasie transitoire, les monocytes sont activement mobilisés à partir de la moelle osseuse ou de la rate ^{5, 6, 7} et colonisent les organes enflammés. Plusieurs axes chimioattractants ont été impliqués dans le processus de mobilisation des cellules myéloïdes de la moelle osseuse ^{8, 5, 6, 9}. Au-delà du compartiment myéloïde, la moelle osseuse est également un site important d’amorçage des lymphocytes T ¹⁰ et une niche de mémoire immunologique ^11,12. Ainsi, ce tissu est central pour de nombreuses investigations dans le domaine de l’hématologie et de l’immunologie. Nos connaissances sur l’organisation structurale des cellules myéloïdes médullaires proviennent principalement de l’analyse de coupes histologiques de tissus fixés ¹³. Cette vue statique ne permet pas d’étudier la dynamique d’échange cellulaire entre les différents compartiments de la moelle osseuse, qui est à la base de son activité fonctionnelle.

L’imagerie intravitale constitue un intrant biologique important dans l’étude de la mobilité cellulaire, de l’adhérence cellulaire et des interactions intercellulaires, qui n’étaient auparavant décrites qu’à partir de systèmes in vitro. Les défis techniques d’une imagerie intravitale correcte comprennent la capacité d’atteindre le tissu d’intérêt d’un point de vue optique, et de maximiser son isolement des dérives physiologiques (respiration, contractions musculaires ou péristaltiques) ou mécaniques (perturbation et extension tissulaire après une intervention chirurgicale, et exposition à l’objectif du microscope ainsi qu’aux perturbations de la température et vasculaires/oxygénation). Les dérives microscopiques peuvent limiter la capacité de maintenir la focalisation pendant une longue période et pourraient introduire des artefacts dans la quantification de la motilité cellulaire. Une alternative, validée pour plusieurs tissus afin de réduire ces difficultés techniques, consiste à travailler sur des tissus explantés incubés dans un milieu thermostaté et oxygéné ; Cependant, une perturbation complète de la circulation lymphatique et vasculaire peut être problématique. L’imagerie intravitale de la moelle osseuse du crâne présente plusieurs avantages concernant ces questions. Tout d’abord, il nécessite une action chirurgicale minimale. Deuxièmement, l’épaisseur de l’os dans cette région permet de visualiser directement les niches de la moelle osseuse sans abrasion, réduisant ainsi les perturbations physiologiques. Le réseau médullaire peut être imagé dans la région parasagittale de l’os ; Cependant, les sinusoïdes sont plus visibles dans la région fronto-pariétale où la matrice osseuse est plus mince^12,14.

L’imagerie intravitale repose sur la disponibilité du rapporteur fluorescent le plus précis pour marquer la population d’intérêt. Le marquage in vitro de la population cellulaire purifiée avant le transfert adoptif a conduit à une caractérisation importante des niches de cellules souches hématopoïétiques ¹⁵ ou des microdomaines endothéliales de la moelle osseuse favorisant la greffe tumorale ¹⁶, et a fourni plusieurs informations fondamentales sur des concepts clés en immunologie ¹⁷ . Cependant, cette approche nécessite généralement des centaines de milliers de cellules pour avoir la chance de les détecter par la suite in vivo. Cela pourrait s’expliquer par le taux de mortalité élevé suite à la coloration, la dilution dans l’ensemble du corps et le changement de l’état d’activation, ce qui pourrait conduire à un guidage biaisé. Le marquage endogène à partir du système de souris transgénique surmonte largement ces limitations et a permis d’imager le comportement de l’ostéoblaste endogène ⁸, des mégacaryocytes ¹⁸ ou des sous-ensembles de la lignée myéloïde ⁶. Néanmoins, il faut être prudent lorsque l’on considère la spécificité du rapporteur fluorescent parmi le sous-ensemble étudié.

La souris Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, appelée souris MacBlue ¹, est un système transgénique précieux pour l’étude des monocytes médullaires avec l’imagerie en temps réel ⁶. L’injection intraveineuse de rhodamin-dextran de haut poids moléculaire distingue le parenchyme médullaire du réseau sinusoïdal vasculaire de la moelle osseuse. En utilisant cette approche, il est possible de suivre le comportement des monocytes dans les différents compartiments médullaires dans un contexte physiopathologique spécifique d’intérêt. De plus, nous proposons une stratégie supplémentaire pour comparer la dynamique des monocytes avec celle des neutrophiles par marquage in vivo à l’aide d’un anticorps spécifique.

Protocole

REMARQUE: Tous les protocoles d'expérimentation ont été approuvés par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale et français et validés par le "Service de Protection et Santé Animales, Environnement" avec le numéro A-75-2065. La taille des échantillons sont choisies pour assurer la reproductibilité des expériences, et selon l'3R éthique de régulation de animal.

1. Préparation de la souris

1. Anesthésie
   1. Pour courte période de formation d'image (moins de 1 h), anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale de 200 ul d'une solution saline contenant de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
   2. En variante, pour une longue période de formation d'image (jusqu'à 4 heures), anesthésier les souris avec une inhalation d'isoflurane 2,5% vaporisé dans un mélange 70/30 de O ₂ / N ₂ O, à travers un masque adapté.
   3. NOTE: cette façon prévoit l'inconscience plus stable et évite injection intrapéritonéale série de médicaments.
   4. Une fois que la souris est anesthésiée, vérifier l'inconscience par la stimulation de la garniture de pied avec des pinces.
2. Coloration vasculaire / coloration supplémentaire
   1. Pour la coloration vasculaire: injecter par voie intraveineuse dans la veine caudale, 200 ul de rhodamine-dextrane (2 MDA, 10 mg / ml dans un tampon salin).
   2. Pour la coloration des neutrophiles: 2 ug d'injecter Ly6G-PE (clone 1A8) dans 100 ul de solution saline par voie intraveineuse dans la veine caudale.
3. Immobilisation
   1. Pour l'immobilisation, utiliser un support stéréotaxique sur mesure adaptée à la loupe et l'inhalateur de gaz anesthésique.
      NOTE: Le titulaire stéréotaxique est un support métallique avec deux supports de plaques de métal, l'un étant fixe et l'autre amovibles et adaptables, pour resserrer la tête de l'animal.
   2. Installez la tête de la souris entre les plaques de retenue pour assurer l'isolation des mouvements respiratoires. Serrer les oreilles entre les plaques de retenue et de la tête pour étirer le sk. Vérifiez la stabilité et le bien-être de respiration de l'animal.
4. Retirer le cuir chevelu
   1. Soigneusement utiliser l'éthanol à 70% pour mouiller les cheveux du cuir chevelu avec un applicateur stérile, évitant tout contact avec les yeux.
   2. Couper la peau avec des ciseaux et des pinces stériles pour supprimer complètement le cuir chevelu de l'arrière de l'os pariétal à l'os frontal. Tenir à l'écart jusqu'à 3 mm d'yeux et les oreilles pour éviter un saignement important. Retirer le tissu conjonctif lâche couvrant le crâne (périoste). Laver les cheveux avec chaude restante serviette en papier imbibé PBS.
5. système d'immersion mis en place
   1. Collez un anneau de 18 mm de diamètre avec de la colle chirurgicale en caoutchouc directement sur le crâne à l'aide d'une aiguille de petit calibre de contrôler la distribution. Coller la totalité de la périphérie de l'anneau en caoutchouc pour empêcher la fuite (30 ul devraient être suffisants).
   2. Nettoyez le crâne sous l'anneau une dernière fois avec PBS-serviette imbibée de papier, puis ajouter 37 ° C PBS pour une immersion complète de lacrâne. Ajouter une goutte de solution de NaCl à 0,9% ou un onguent ophtalmique spécifique sur chaque oeil de la souris afin d'éviter la sécheresse oculaire. Faites glisser le support stéréotaxique titre de l'objectif.
   3. Environ positionner le terrain en utilisant l'oculaire du microscope par transmission directe.

2. Deux photons Acquisition d'imagerie

1. Utilisation d'un microscope multiphoton couplé à un laser Ti: saphir à cristaux, qui fournit des impulsions de lumière 140fs NIR, accordables sélectivement de 680 à 1080 nm, et un modulateur acousto-optique pour le contrôle de la puissance du laser. Utilisez une configuration comprenant trois détecteurs externes non balayée (NDD) (qui permettent l'enregistrement simultané des trois canaux fluorescentes) avec une combinaison de deux miroirs dichroïques (565 nm et 690 nm), 565/610 et 500/550 filtres passe-bande, et un 485 filtre passe courte, avec un apochromat plan × 20 (NA = 1) L'objectif de l'immersion en eau.
2. Réglez la chambre de chauffage pour permettre une bonne homéothermie des anessouris thetized.,
   REMARQUE: Température pourrait être réglé une heure avant la session d'imagerie pour une meilleure stabilité. Dans notre cas, 32 ° C a été choisi pour obtenir optimale la température du corps de la souris anesthésié (36-37 ° C) et est maintenue jusqu'à 4 h. Cette température peut être adaptée au système utilisé (sonde numérique peut être utilisé pour vérifier ce point). En outre, la chambre de chauffage utilisé est sombre / noir et couvre une partie du système (objectifs et la plaque motorisé) pour éviter la contamination de la lumière extérieure.
3. Allumez le système
   1. Allumez le laser Ti: saphir, puis l'ensemble du système de microscope. Lancez le logiciel d'acquisition. Définissez la plage de longueur d'onde laser à 870 nm. Sélectionnez NDD appropriée pour l'enregistrement.
      NOTE: Dans notre cas, génération de second harmonique (SHG) ¹⁹ et la protéine fluorescente cyan (ECFP) sont détectées par le DDN après le court filtre 485 passe. ECFP est également détectée par le DDN après le filtre passe-bande 500/550 et la rhodamine-dextrane est détectée par til DDN après le filtre passe-bande 565/610.
4. Réglez les paramètres d'acquisition
   1. Utilisez "l'acquisition en direct" commande d'imagerie du logiciel et en utilisant la commande directionnelle de microscope, la mise au point sur une zone avec un signal ECFP et la rhodamine. Régler la puissance du laser au minimum afin d'obtenir le meilleur rapport signal sur bruit avec un minimum de photo-dommages.
      NOTE: Le réglage de la puissance utilisée varie en fonction de la profondeur de la région d'intérêt. Généralement, les paramètres AOM sont installés autour de 20%, ce qui représente une puissance de laser au-delà de l'objectif d'environ 15 mW. Il est préférable d'augmenter la puissance de gain sur les PMT pour chaque NDD pour réduire la photo-blanchiment et photo-dommages. Paramètres d'acquisition typiques sont la numérisation simple avec un temps de séjour de pixels de 1,58 ps, et une résolution de 512 x 512 pixels avec un grossissement de 1,5.
5. Sélectionnez régions d'intérêt
   1. Une fois les paramètres d'enregistrement sont réglés, utilisez de nouveau la commande d'acquisition «en direct»,et étudier le tissu de choisir un (x, y, z) champ désiré à surveiller en temps réel.
      NOTE: En règle générale, nous avons choisi un champ comprenant à la fois vasculaire et zones parenchymateuses.
   2. Créer le domaine avec la commande de logiciel "de position".
      REMARQUE: Cette commande mémorise x, y, z de différents champs éloignés.
   3. Sélectionner et enregistrer les champs d'intérêt supplémentaires (jusqu'à 3) en utilisant la même procédure.
   4. Définir un z-stack 3D avec la commande de logiciel "z-pile" sur la première position mémorisée selon le volume requis avec un grossissement choisi. Mémorisez profond première position, puis la position la plus élevée. Normaliser la puissance du laser avec la profondeur.
      NOTE: Pour les multiples imagerie de champ concomitante, nous acquérons cinq tranches séparées par 3 um z-étapes pour chaque champ d'acquérir un volume de 12 um d'épaisseur. Ces paramètres peuvent être adaptés au type de cellules étudiées.
6. acquisition de lancement
   1. Sélectionnez le220; séries chronologiques "de commande du logiciel et choisissez la durée de l'intervalle de temps et le nombre de cycles. Commencez imagerie time-lapse selon le laps de temps et la durée nécessaire en sélectionnant le "Début de l'expérience" commande logicielle.
      NOTE: Dans notre cas, nous acquérons un volume chaque 30 secondes pendant 60 cycles représentant 30 min en temps réel. Plus petit laps de temps peut être effectuée à chemin de roulement cellulaire rapide dans le vaisseau sanguin. Dans ce cas, plus mince z-stack et pas plus de deux domaines différents peuvent être enregistrés en même temps.
   2. Un suivi régulier de la mise en place.
      1. Toujours surveiller l'animal pour se assurer qu'il est inconscient.
         REMARQUE: Secouer des moustaches ou des jambes de l'animal sont des indicateurs de reprise. En cas de respiration de l'animal est saccadé, la quantité de l'isoflurane peut être légèrement réduite. Dérive de tissus forte lors de l'acquisition est un indicateur de la renaissance de la souris.
      2. Assurer l'objectif est bien immergé. Renouveler 37 ° C PBS between deux acquisitions (30 min).
         REMARQUE: disparition progressive des signaux lors de l'acquisition est l'indicateur de fuite PBS.
7. Fin de la procédure
   1. Une fois les vidéos enregistrées sont nécessaires, euthanasier l'animal par dislocation cervicale rapidement devant la réanimation.
      REMARQUE: la cicatrisation conduit à la formation d'une croûte en 24-48 h, ce qui limite la possibilité d'effectuer une imagerie longitudinal.

3. Analyse des données

1. correction de la dérive
   1. Utilisez un logiciel Imaris Bitplane pour le suivi automatique 3D.
   2. Ouvrez l'image 3D sur Imaris séquence. Sélectionnez "spot" de commande, et de générer suivi manuel (clic de souris + shift) pour tous les points de temps pour un minimum de 4 points d'ancrage différents, si possible répartis de manière homogène dans le domaine.
   3. Appliquer la correction de la dérive en utilisant la commande "de dérive correcte" dans l'onglet "édition de piste".
   4. Vérifiez til la qualité de la correction en x, y et z en particulier dans flottement pour éviter artefact.
      NOTE: Si la correction ne est pas satisfaisante, essayez d'autres points d'ancrage ou d'exclure la vidéo à partir de l'analyse.
2. suivi cellulaire
   1. Utilisez "ajouter de nouveaux spots" commande et sélectionnez "taches de suivre dans le temps" de réglage de l'algorithme. Aller à l'étape suivante.
   2. Appliquer la procédure de suivi automatique de la cellule, soit sur l'ensemble du canal d'intérêt en utilisant "canal source" commande. Set objets (ie, cellules) de diamètre à 10 um. Aller à l'étape suivante.
      NOTE: Le choix dépendra de la distinction entre les objets et la spécificité du signal mesuré. En bref, l'alignement automatique sur l'ensemble du canal ne est possible que si le signal détecté est spécifique à l'objet d'intérêt. Parce que les deux SHG ECFP et sont détectées par le DDN après le filtre 485 passe-court, suivi sera plus précise et plus efficace en utilisant le signal enregistré par l'ECFP NDD après le 500/550 filtres passe-bande. Groupées ou des objets emballés denses nécessiteront sélection manuelle des objets individuels similaires à l'étape 3.1.2.
   3. Sélectionnez le type de filtre "de qualité", définir le seuil d'exclure le suivi d'objets non spécifiques. Aller à l'étape suivante.
   4. Choisissez "brownien algorithme Motion" avec des paramètres précis de "Max la distance» et «taille de Gap" entre deux points. Valider la génération de piste.
   5. Une fois les pistes sont calculés automatiquement, sélectionnez "la durée de la piste" type de filtre, fixer le seuil d'éliminer pistes plus courtes que 120 secondes (soit 4 points de temps).
   6. Obligatoire: Après un suivi automatique, vérifier la qualité des pistes.
      1. Déroulez la barre de temps pour vérifier que les objets suivent les chemins de piste. Sinon, utilisez les options de correction de point de trace disponibles dans l'onglet "modifier": Supprimer les pistes fausses ou inappropriées avec commande "Supprimer" (supprimer ne importe quelle piste point individuellement en utilisant la commande "Déconnecter"). Si le chemin de la piste est discontinue, ajouter les données manquantes (clic de souris + décalage), sélectionner tous les points sur une piste donnée, et d'utiliser "connecter" commande dans l'onglet "édition de piste".
3. paramètres de quantification
   1. Sélectionnez l'onglet "statistique" dans la commande «Préférences», choisissez les paramètres dynamiques d'intérêt dans la liste. Sélectionnez "Exporter toutes les statistiques de déposer" commandement et enregistrez le fichier excel généré.
      NOTE: Plusieurs paramètres dynamiques sont obtenues directement à partir du logiciel tels que longueurs de piste, vitesse instantanée, vitesse moyenne, et de suivre la rectitude. coefficient de motilité ^{6, 20} peut être déterminé mais ne est pas directement disponible par le logiciel.
   2. Pour chaque cellule, calculer la moyenne des déplacements pour chaque période de temps (At) (pour un film laps de temps de 30 sec, AT aura 30, 60, 90 secondes, etc).Tracer la moyenne du déplacement quadratique en fonction de l'intervalle de temps. Obtenir coefficient de motilité en calculant la pente de la partie linéaire de la courbe.

Résultats

La structure du crâne de souris offre une bonne occasion pour étudier la physiologie de la moelle osseuse par imagerie intravitale. L'os étant mince autour de la zone avant-pariétale, il est possible d'avoir accès à des niches médullaires sans abrasion de l'os. La figure 1 représente un champ 2D large du crâne d'une souris transgénique MacBlue. La matrice d'os est composée principalement de collagène de type I facilement détectable par ¹⁹ SHG. L'injection de rhodamine-dextrane colore le résea...

Discussion

Les points critiques de la méthode in vivo d'imagerie sont en assurer la stabilité de la mise au point afin de maximiser la durée de formation d'image et de réduire au minimum le risque de contamination bactérienne et l'inflammation, ce qui pourrait avoir un impact de la dynamique des cellules inflammatoires. L'imagerie du crâne moelle osseuse suite à ces objectifs comme la chirurgie effectuée pour obtenir l'accès à la moelle osseuse est minime. L'utilisation de matériel ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine	Merial		100 mg/ml, anesthésique
Xylazin	Bayer HealthCare		10 mg/ml, anesthésique
Isofluran	Baxter		2,5 %, anesthésique
O2/NO2			70/30 mélange, anesthésique
Rhodamin-Dextran	Invitrogen		2 MDa, 10 mg/ml, Coloration vasculaire
Ly6G-PE	Clone Becton-Dickinson		1A8, coloration des neutrophiles
Porte-stéréotaxie	Chirurgie	maison
Éthanol 70 %
chirurgie Ciseaux stériles et pinces
Chirurgie Anneau			18 mm de diamètre, chirurgie
Glubran 2	Queryo Colle médico-chirurgicale		, fixation par anneau en caoutchouc,
aiguilles de petit calibre,	Terumo		,
microscope multiphotonique Zeiss LSM 710 NLO.	Carl Zeiss		Microscope
Ti :Laser à cristal de saphir  ;	Coherent Chameleon Ultra		140 fsec impulsions de lumière NIR
Zen 2010	Carl Zeiss		Acquisition Software
Imaris Bitplane  ;	Bitplane		, suivi automatique 3D
PBS 1X	D. Chirurgie Dutscher
Chambre thermostatée	Imagerie intravitale	Carl Zeiss