Techniques pour l'analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

Summary

De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l'aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes.

Abstract

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d'analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d'anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

Introduction

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doiven....

Protocol

REMARQUE: Les protocoles suivants ont été réalisées en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les échantillons des sujets humains ont été testés dans un conseil d'examen institutionnel (IRB) -approuvé protocole et avec le consentement éclairé des sujets.

1. Méthode A: Méthode de détection individuelle

1.1) Le traitement de l'échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques

1. Prélever le sang du donneur / patient dans deux tubes de 10 ml en verre contenant 1,5 ml d'ACD-Solution A ou un autre anticoagulant a....

Results

La figure 1 présente le schéma général de traitement pour l'isolement et la détection des véhicules électriques en utilisant soit la méthode de la tringle ou de la méthode de détection utilisée. Détection individuelle des véhicules électriques utilisant FCM fonctionne bien pour l'analyse de grands véhicules électriques mais la plupart des cytomètres sont pas capables de détecter individuellement des particules aussi petites que les exosomes. Une approche basée bourrelet permet aux petits véhicules élect.......

Discussion

Deux protocoles différents pour l'isolement, le traitement et l'analyse des véhicules électriques ont été présentés, soit en utilisant une détection individuelle ou une approche à base de billes. Sélection de la méthode la plus appropriée à utiliser ne est pas toujours simple et nécessite une compréhension de l'échantillon testé ainsi que les sous-populations individuelles d'intérêt. En outre, la sensibilité du cytomètre utilisée pour l'acquisition doit être considéré au moment de choisir la méthode .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytomètre en flux de paillasse LSR II	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm bleu, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet et 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rouge)
Logiciel FACS Diva  ;	BD Biosciences		Version PC 6.0
Logiciel FlowJo  ;	Treestar US		Mac version 9.6.1 ou PC version 7.6.5
Sphero Rainbow Les particules fluorescentes	BD Biosciences	556298	utilisées pour ajuster toutes les tensions de canal afin de maintenir la cohérence de l’intensité de fluorescence.
Particules fluorescentes Ultra Rainbow	Spherotech	URFP-10-5	utilisé en plus des billes Megamix-Plus SSC pour assurer la cohérence de la porte EV d’un lot à l’autre
Perles Megmix-Plus SSC	Biocytex	7803	utilisées pour ajuster les tensions FSC et SSC afin de maintenir la cohérence entre les cycles. Peut également être utilisé pour surveiller le débit et ajuster le débit afin de s’assurer que le même débit est utilisé dans tous les cycles
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	utilisé pour les contrôles de compensation et les billes AbC négatives utilisées pour la méthode basée sur les billes
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz  ;	SC-281108	Utilisé dans la méthode de détection individuelle uniquement pour lyser des échantillons après la lecture initiale afin de les utiliser comme témoins négatifs. Le bouillon peut être dilué à 1:10 dans du PBS et conservé au réfrigérateur jusqu’à 1 mois.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	utilisé chaque fois que des concentrations absolues de VE sont nécessaires
Ultrafree-MC, GV 0,22 & micro ; m Unités de filtration centrifuge	Millipore  ;	UFC30GVNB	utilisé pour le lavage post-coloration des Evs et/ou le fractionnement des EV en fonction de la taille
Tubes de sang entier en verre Vacutainer ACD-A	BD Biosciences	364606
Tubes Facs 12x75 polystène	BD Biosciences	352058
50 ml Réservoirs emballés individuellement.	Phenix	RR-50-1s Pointes
de pipette Green-Pak - 10 & micro ; l	Rainin	GP-L10S Pointes
de pipette Green-Pak -200 & micro ; l  ;	Rainin	GP-L250S
Vert -Pak pointes de pipette - 1 000 & micro ; l  ;	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 pointes préstérilisées	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite  ;XLS 8 Canaux LTS  ; Réglable  ; Entretoise  ;	Rainin	LA8-300XLS Plaques de culture tissulaire
96 puits	E& K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Milieux (sans Hepes)	Installation de culture cellulaire UCSF	CCFAE001	milieux utilisés pour la méthode de détection à base
de billes Dulbeccos PBS D-PBS, sans CaMg, 0,2 & micro ; m filtré	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Tube ultracentrifuge, paroi mince, ultra-transparent	BECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µ ; l
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 & micro ; l
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 & micro ; l
CD28 FITC	biolegend	302906	2 & micro ; l
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 & micro ; l
CD19 A700	Biolegend	302226	2 & micro ; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 & micro ; l
CD62L APC	Biolegend	304810	2 & micro ; l
CD108 PE  ;	BD Biosciences	552830	2 & micro ; l
CD235a FITC	biolegend	349104	2 & micro ; l
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 & micro ; l
CD62p APC	Biolegend	304910	2 & micro ; l
CD66b PE  ;	Biolegend	305106	2 & micro ; l
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 & micro ; l
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, &kappa ;	Biolégende	400230