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Article de méthode

Techniques pour l'analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

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⸱

DOI :

10.3791/52484

⸱

17 mars 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

Dans cet article

Résumé

De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l'aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes.

Résumé

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d'analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d'anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

Introduction

Extracellulaire vésicules (VE) sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont très impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques. Analyse des véhicules électriques en utilisant la cytométrie de flux (FCM) a été notoirement difficile en raison de leur petite taille et le manque de populations distinctes positifs pour les marqueurs d'intérêt. Méthodes d'analyse des EV, alors considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, sont encore un travail en cours. Malheureusement, il n'y a pas de one-size-fits-all protocole, et plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Présenté voici plusieurs techniques différentes pour les véhicules électriques de traitement et deux protocoles d'analyse véhicules électriques en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes. Les méthodes décrites ici vont aider à éliminer les agrégats d'anticorps trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-bruit, et les portes de réglage dans un f rationnelleashion qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur bourrelet de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

VE, aussi connu comme microparticules, sont de petites vésicules membranaires dérivés trouvés dans les fluides corporels qui sont impliqués dans la communication cellulaire et aident à réguler un large éventail de processus biologiques 1. À travers l'expression de différents marqueurs de surface et / ou le transfert direct de matériel biologique, les véhicules électriques sont en mesure de modifier la fonction des cellules réceptrices de jouer soit l'activation ou la suppression de rôles dans la communication intercellulaire 2-4. VE, dérivées des plaquettes cliniquement sont connus pour avoir une forte activité anticoagulante 5, tandis que d'autres ont été montrés pour contribuer à une large gamme de conditions, de la promotion tumorale metasta6 sis à protéger contre la maladie 7. VE peuvent être classés en catégories plus petites vésicules de dérivés de cellules tels que les exosomes et microvésicules (MV), en fonction de leur taille et le mécanisme de génération 8. La nomenclature des sous-populations de vésicules dérivées de cellules continue d'être un sujet de débat en cours 8,9, cependant, les exosomes sont généralement décrits comme petite, de 40 à 100 nm particules provenant de la fusion des endosomes avec la membrane plasmique, tandis que MV sont plus de 100 à 1000 des particules nm formés par l'excrétion de la membrane plasmique 10. Ici, le terme général "VE" sera utilisé pour désigner tous les types de vésicules biologiques extracellulaires libérés par les cellules.

Isolement des véhicules électriques à partir de sang entier est une procédure en plusieurs étapes et de nombreuses variables différentes de traitement se sont révélés affecter le contenu EV, y compris la température et la durée de stockage 11,12, anticoagulant / conservateur utilisé 13 etméthode de centrifugation utilisée 14. Un besoin de standardisation de ces variables a abouti à des recommandations de la Société internationale de thrombose et de traitement du sang et d'isolement EV procédures du Comité de normalisation (ISTH SSC) pour le bon Hémostase scientifiques et 15,16, mais il ne existe aucun consensus parmi les chercheurs sur le protocole optimal à utiliser 12. La plupart conviennent, cependant, que les variables pré-analytiques étroitement contrôlées sont cruciales pour les données précises et reproductibles.

Afin d'analyser les véhicules électriques, les chercheurs ont utilisé diverses méthodes, y compris la microscopie électronique à transmission 17, la microscopie électronique à balayage 18,19, microscopie à force atomique, la lumière diffusion dynamique de 20,21 et 22,23 western blot. Alors que la FCM est la méthode de choix pour de nombreux chercheurs 9,24 - 26 en raison de ses capacités à haut débit, analyse des véhicules électriques en utilisant la FCM a éténotoirement difficile en raison de leur taille et le manque de populations positifs discrets 27-32. Par rapport à l'analyse des cellules, la petite taille des résultats de SVE en 1) moins de fluorescence émise en raison du nombre inférieur d'antigènes par particule et 2) la faisabilité limitée de post-tache lavage, ce qui est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond. Défis communs entre les chercheurs comprennent signaux issus agrégats d'immunoglobulines 27,28 et auto-agrégation des anticorps 29. En outre, les longs délais de traitement et procédures de lavage / d'isolement de longs utilisés par un grand nombre de protocoles actuels 33,34 nécessitent des engagements de temps de plusieurs jours pour analyser un petit nombre d'échantillons, ce qui les rend moins idéal pour les applications à haut débit. Certains chercheurs renoncent à une étape de lavage tout à fait, rendant traditionnellement utilisés contrôles négatifs FCM telles que la fluorescence moins un (FMO) et isotypes d'anticorps inutile pour évaluer précisément bacfluorescence kground 30.

Nos protocoles portent sur trois problèmes communs qui peuvent entraver l'analyse de la FCM correcte des véhicules électriques: signaux issus des agrégats d'anticorps et d'autres non-vésicules, de la difficulté à éliminer l'anticorps non lié, et le manque de populations positifs perceptibles. Les techniques décrites ici seront utiles pour éliminer les agrégats d'anticorps on trouve couramment dans les préparations commerciales, l'augmentation du rapport signal-sur-bruit, et la mise en portes de façon rationnelle qui minimise la détection de la fluorescence de fond. Deux méthodes de détection différentes sont présentés ici: le premier protocole utilise une méthode de détection qui est particulièrement bien adapté pour l'analyse d'un volume élevé d'échantillons cliniques, tandis que le second protocole utilise une approche fondée sur des perles-de capturer et de détecter les plus petits véhicules électriques et des exosomes.

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Protocole

REMARQUE: Les protocoles suivants ont été réalisées en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. Tous les échantillons des sujets humains ont été testés dans un conseil d'examen institutionnel (IRB) -approuvé protocole et avec le consentement éclairé des sujets.

1. Méthode A: Méthode de détection individuelle

1.1) Le traitement de l'échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques

  1. Prélever le sang du donneur / patient dans deux tubes de 10 ml en verre contenant 1,5 ml d'ACD-Solution A ou un autre anticoagulant approprié et processus immédiatement (dans les 30 minutes max) en utilisant le 2-step protocole de centrifugation différentielle suivante.
    NOTE: Ce protocole donnera environ 10 ml de plasma pauvre en plaquettes (PPP) des combinés ~ 17 ml de sang prélevé. Si plus ou moins PPP est nécessaire, le nombre de tubes de sang collecté peut être ajustée en conséquence.
  2. Centrifuger les échantillons à 1500 g pendant 10 min à température ambiantepour séparer le plasma de la couche leucocytaire et les globules rouges. Transférer 1,2 ml aliquotes du surnageant de plasma pour 1,5 ml tubes de centrifugation, en faisant attention de ne pas déranger les couches inférieures contenant la couche leucocytaire et les globules rouges.
  3. Tourner à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante pour éliminer les plaquettes et les grands fragments cellulaires. Transférer soigneusement le PPP, laissant derrière 200 pi pour éviter de perturber le culot et ajouter le PPP dans un nouveau tube.
  4. À ce stade, utiliser PPP immédiatement pour l'analyse ou le transfert dans aliquotes de 1,0 ml à 1,5 ml de nouveaux tubes de centrifugeuse et conserver à -80 ° C pendant jusqu'à deux ans pour une analyse ultérieure (voir la figure 1A pour un aperçu).
  5. Si VE purifiés sont nécessaires pour les expériences fonctionnelles, transfert 6 ml de PPP à un tube d'ultracentrifugeuse et ajouter 28 ml de 0,2 um filtré la solution tampon phosphate (PBS). Spin pendant 60 min à 100 000 x g à la température ambiante en utilisant une ultracentrifugeuse équipé d'un rotor à godet oscillant. Aspirer le surnageant et remettre en suspension EV pellaisser dans 1,5 ml de milieu.
    NOTE: Pour plus reproductibilité, des échantillons de sang doivent être traités de manière aussi cohérente que possible d'un donneur à. Toute variation dans la méthode d'isolement EV pourrait avoir une incidence significative le nombre et le type de véhicules électriques détectés.

1.2) Préparation des échantillons pour analyse

NOTE: A partir de là, les étapes expliquer un protocole à haut débit pour l'analyse de 12 échantillons pour 14 marqueurs en trois panneaux. Cependant, d'autres combinaisons d'anticorps peuvent être utilisés ici; le protocole peut être adapté à l'étude d'autres populations EV en substituant les marqueurs ont été proposées pour ceux d'intérêt.

  1. Retirer du congélateur 12 échantillons (se il est stocké à -80 ° C) et du dégel à 37 ° C.
  2. contenu de la pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Retirer 320 pi de chaque échantillon et ajouter à la rangée du haut d'une plaque de 96 puits.
    REMARQUE: Un multi-puits pipette réglable en largeur est extrêmement utile pour cela et bien d'autres étapes tout au long de l'âneay, en particulier lors de l'analyse de plusieurs échantillons à la fois.

1.3) Les échantillons coloration EV

  1. Avant coloration, filtrer tous les anticorps (ABS) pour éliminer les agrégats, ce qui peut provoquer des signaux positifs.
    1. Moissonneuses anticorps à utiliser dans chacun des trois panneaux à 0,22 um tubes filtrants centrifuges séparées et centrifugation en utilisant une centrifugeuse à angle fixe unique de vitesse (~ 750 x g) à température ambiante pendant 2 min, ou jusqu'à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu'aucun liquide ne reste d'anticorps sur la surface du filtre. Magasin Ab cocktails dans le réfrigérateur jusqu'à deux semaines, mais re-filtre à chaque fois avant de l'utiliser.
  2. Ajouter la quantité appropriée de mélange Ab filtré pour chaque puits dans la rangée 2 (par exemple, des échantillons de Groupe I sont colorées avec 2 pi de chaque Ab, soit un total de 12 ul du cocktail Ab filtrée est ajouté par puits à la ligne 2). Reportez-vous à la figure 1B pour un aperçu de la carte de la plaque suggéré. Répétez ces pluss pour les lignes en dessous si plusieurs panneaux sont exécutés (ici, ajouter 8 pl / puits du cocktail Panel II à la ligne 3 et 11 pl / puits du cocktail Panel III à ramer 4; se référer à la liste de matériaux pour des informations spécifiques du panneau).
  3. Utilisation de la pipette multicanaux, mélanger les échantillons de PPP dans la rangée 1 de haut en bas et de transférer 100 pi des puits dans la rangée 1 dans les puits dans la rangée 2. Mix de haut en bas. conseils de changement et de répétition, le transfert de 100 pi de la ligne 1 aux lignes 3 et 4. Incuber à 4 ° C pendant 30 min.

1,4) échantillons de MT à laver

  1. Retirer la plaque de 96 puits de 4 ° C et le transfert au Cabinet de sécurité biologique. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 220 pi de PBS / bien rangées 6-8 (à utiliser pour le rinçage / lavage des puits contenant teinté PPP).
  2. Transférer le contenu de chaque puits pour tubes filtrants centrifuges pré-étiquetés en utilisant le multicanal pipette réglable en largeur (Pour 12 échantillons, avec 3 panneaux d'anticorps, 12 x 3 = 36 tubes de filtreêtre nécessaire). En utilisant les mêmes conseils, retirer 200 pi de PBS à partir des lignes de lavage et ajouter aux puits correspondants à partir de laquelle PPP a été juste enlevé.
  3. Mélanger haut et bas pour rincer les puits et transférer la solution de rinçage pour les mêmes filtres à laquelle le PPP a déjà été ajouté. Fermer sommets des filtres centrifuges. Changer conseils.
  4. Répétez ce processus avec les échantillons colorés restants jusqu'à ce que tous les échantillons PPP colorées ont été transférés avec leurs solutions de rinçage à filtres centrifuges.
  5. Transférer les filtres centrifuges à rotor d'une centrifugeuse de filage fixe et à 850 g pendant 3 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Veiller à ce qu'aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme "sec" sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons PPP peuvent nécessiter un temps de centrifugation plus à se déplacer efficacement à travers le filtre.
  6. Retirer les tubes de filtre centrifuge et revenir à l'enceinte de sécurité biologique.En utilisant la pipette à canaux multiples, remettre en suspension les sommets des filtres dans 300 ul de PBS. Transférer le contenu remises en suspension dans des tubes pré-étiquetés pour une analyse immédiate FCM.
    NOTE: Il est très important de garder la force et le nombre de dépressions pipette à piston cohérentes parmi les échantillons pour éviter la variation échantillon à échantillon. Ce devrait idéalement être fait en utilisant une pipette électronique qui a été programmé pour pipette de haut en bas un volume spécifique (par exemple, 280 pi) d'un nombre exact de fois (par exemple, 8 fois) pour chaque échantillon.

1.5) la configuration du cytomètre

  1. Ouvrez le logiciel FCM. Avant d'expérimenter l'installation, effectuer l'étalonnage de l'instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l'appareil (en suivant les instructions du fabricant).
  2. Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d'un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit:
    1. Ajouter deux gouttes de perles de compensation de prétubes marqué au (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d'anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache.
    2. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS.
    3. Utilisation du cytomètre de flux logiciel fourni avec l'appareil, exécutez chaque tube de compensation et de régler les tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle de 5 log-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, et d'ajuster les paramètres de tensions fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube.
    4. Sélectionnez l'onglet "Expérience", puis sélectionnez «Rémunération», puis sélectionnez «Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons.
  3. Régler la diffusion vers l'avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) paramètres de tension à échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas permis par le cytomètre (FSC et SSC = 200 = 200) pour chaque.
  4. Lors de l'exécution d'un tube de 0,22 um filtré PBS, régler les tensions FSC et SSC aux valeurs les plus élevées qui excluent la majorité du bruit de fond (ce est à dire, juste en dessous du seuil de tension à laquelle le taux d'événements dépasse 5 événements / sec).
  5. Ensuite, exécutez un tube contenant 0,2 um - 1,0 um perles, dilué dans du PBS si nécessaire. Dans un complot FCS vs SSC, dessiner une grille autour de la population de billes pour capturer les événements entre 0,2 um et 1,0 um. Alternativement, dans un histogramme SSC-H, dessiner une porte d'inclure tous les événements plus petits que les 1,0 um perles.
  6. Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min). En utilisant le tube de perles (ou autre tube contenant une concentration connue de perles) régler le cadran de débit sur le cytomètre jusqu'à la veillent taux atteint environ 200 événements / sec. Lire tous les tubes échantillons au même débit et utiliser la même concentration de billes dans des expériences futures pour se assurer que les débits restent cohérents entre les courses.
  7. Exécutez un tube de particules fluorescentes arc dilué dans du PBS. Acquérir 5000 événements. Notez les valeurs d'intensité moyenne pour FSC, SSC, et chaque canal de couleur. Utilisez ces valeurs pour ajuster les tensions dans les expériences futures à assurer que les intensités de fluorescence restent cohérents entre les expériences.

1,6) lecture de l'échantillon

  1. Réglez le débit du cytomètre à «Lo» (environ 8 à 12 pi / min) et tester chaque échantillon pendant exactement 1 ou 2 min.
  2. Après la première lecture, ajouter 20 ul de 10% de NP-40 à chaque échantillon, une pipette de haut en bas, et pour relire la même quantité de temps (soit une ou deux minutes) pour permettre la soustraction d'événements positifs détectés dans l'échantillon lysées sur un laps de temps égal.
    NOTE: Il est extrêmement important que les échantillons soient mélangés à l'aide d'une pipette plutôt que d'un vortex. Dans notre expérience, vortex peut causer l'auto-agrégation de certains anticorps, conduisant à des événements positifs EV-imitant.
  3. Une fois que tous les échantillons ont été lus, l'exportation de tous les fichiers .fcs dans un fichier séparé pour être utilisé pour l'analyse en outre l'utilisation des logiciels d'analyse de la FCM.

1.7) Analyse de données

  1. Ouvrez le logiciel d'analyse de la FCM. Importer tous les fichiers de .fcs dans un nouveau fichier de l'expérience.
  2. Ouvrez le perles seule tube. Dans le FSC-A vs SSC-Un complot, dessiner une grille autour de toutes les perles de taille entre 0,2 um et 1,0 um. Ce est la porte d'EV. Faites glisser pour ajouter à tous les échantillons.
  3. En utilisant les échantillons lysées comme témoins négatifs, dessiner portes au bord de la fluorescence de fond dans chaque canal de fluorescence utilisé. Faites glisser portes fluorescents dans la porte EV de chaque échantillon non-lysées correspondant.
    NOTE: A ce stade, il est également utile d'examiner fluorescentes deux parcelles bi-paramètres. formes de fuséele quadrant double positif (voir figure 8), en particulier si les marqueurs sont connus pour se trouver sur les types de cellules non liées, peuvent être le signe d'artefact à partir de l'agrégation ou d'autres événements imitant des vésicules.
  4. Pour chaque marqueur fluorescent, soustraire le nombre d'événements dans l'échantillon lysé du nombre d'événements dans l'échantillon non-lysées. Eventuellement, diviser ce nombre par le nombre total de véhicules électriques au sein de la grille non-lysées EV pour obtenir% des valeurs positives.

2. Méthode B: Méthode Perles

2.1) Le traitement de l'échantillon de sang / Isolation des véhicules électriques

  1. Reportez-vous à la méthode de traitement du sang décrit dans la méthode A (article 1.1).

2.2) Préparation des échantillons pour analyse

  1. Si vous le souhaitez, fractionner PPP ou EVS ultracentrifugés en exosomes et microvésicules. Ajouter 250 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés à 0,22 um filtres centrifuges et transfert à une centrifugeuse à rotor fixe et tournent à 750 xg pendant 2 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Veiller à ce qu'aucun liquide reste sur les sommets de filtre. Après centrifugation, le filtre doit apparaître comme "sec" sans couche de fluide restant visible sur le dessus. Bien que peu probable, certains échantillons peuvent nécessiter un temps de centrifugation légèrement plus longue pour le fluide de se déplacer de manière efficace à travers le filtre.
  2. Lavez non couchés 6 um billes de polystyrène (par exemple, perles négatifs ABC) 2x avec les médias RPMI, et remettre en suspension dans 2 ml. Ajouter 6000 perles à chaque tube FACS. Pour le tube de contrôle négatif, ajouter 400 ul de milieu RPMI seul à billes. Pour tous les autres tubes, ajouter 200 pi de PPP ou EVS ultracentrifugés (ou de leurs fractions) et 200 pi de milieu RPMI.
  3. Ajuster le volume final de tous les tubes avec 400 ul de médias et incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
  4. Le lendemain matin, lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer le surnageant.
  5. Bloquer avec 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans un milieu (400 ul) pendant 3 heures à 4 &# 176; C sur un agitateur.
  6. Lavez perles avec 2 ml de milieu. Aspirer et remettre en suspension le culot dans 100 pl de milieu.

2.3) Les échantillons coloration EV

  1. Filtrer tous les anticorps. Utiliser les mêmes panneaux anticorps utilisé dans la méthode A, ou si on le souhaite, de créer une combinaison différente d'anticorps aussi longtemps que leurs fluorochromes sont compatibles entre eux.
  2. Mélanger tous les anticorps à utiliser dans un seul panneau dans un tube de filtre centrifuge de 0,22 um. Centrifugeuse utilisant une centrifugeuse à angle fixe à une seule vitesse pendant 2 minutes ou jusqu'à ce que la totalité du mélange Ab a traversé le filtre et qu'aucun liquide ne reste d'anticorps sur la surface du filtre.
  3. Ajouter le volume approprié de cocktail d'anticorps filtré à tous les tubes et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
  4. Lavez perles avec 2 ml de médias, remettre en suspension dans 400 pi de milieu et l'exécuter immédiatement (ou dans la même journée) sur cytomètre de flux.

2.4) cytomètre installation et lecture d'échantillon

  1. Ouvrez le logiciel FCM. Avant d'expérimenter l'installation, effectuer l'étalonnage de l'instrument par jour et la configuration utilisant des billes de configuration de l'appareil (en suivant les instructions du fabricant).
  2. Si les échantillons EV ont été colorées avec plus d'un anticorps et multiples fluorochromes sont à mesurer à la fois, calculer les valeurs de rémunération comme suit:
    1. Ajouter deux gouttes de perles de compensation à des tubes pré-étiquetés (1 tube pour chaque anticorps conjugué à un fluorochrome) et ajouter la quantité recommandée d'anticorps. Ajouter deux gouttes de perles négatifs de compensation dans un autre tube à utiliser comme commande de compensation sans tache. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, on lave avec du PBS et remettre en suspension dans 400 ul de PBS.
    2. Utilisation du logiciel de la FCM, exécutez chaque tube de compensation et ajuster tensions fluorescentes de placer chaque pic à environ 10 4 sur une échelle logarithmique 5-décennie. Assurez-vous que le pic de fluorescence est le plus élevé (le plus clair) dans son propre canal fluorescente par rapport à tous les autres canaux, etajuster les tensions de paramètres fluorescentes à nouveau si nécessaire. Exécutez chaque tube maquette individuellement colorées et de capturer au moins 5000 événements par tube.
    3. Sélectionnez l'onglet "Expérience", puis "rémunération", puis "Calculer la rémunération» pour appliquer les valeurs de rémunération à tous les échantillons.
  3. Changez le FSC et les paramètres de tension SSC à échelle logarithmique et sélectionnez les seuils les plus bas permis par le cytomètre (FSC et SSC = 200 = 200) pour chaque.
  4. Échantillons terme, porte sur la population des perles de singlet et acquièrent 2000 événements dans cette porte. Les dossiers de l'exportation.
  5. Utilisez le logiciel d'analyse de la FCM pour analyser .fcs fichiers. Porte sur des billes de singlet. Calculer l'intensité de fluorescence moyenne géométrique (IMF) pour chaque fluorochrome et comparer avec l'IMF du contrôle négatif.

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Résultats

La figure 1 présente le schéma général de traitement pour l'isolement et la détection des véhicules électriques en utilisant soit la méthode de la tringle ou de la méthode de détection utilisée. Détection individuelle des véhicules électriques utilisant FCM fonctionne bien pour l'analyse de grands véhicules électriques mais la plupart des cytomètres sont pas capables de détecter individuellement des particules aussi petites que les exosomes. Une approche basée bourrelet permet aux petits v...

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Discussion

Deux protocoles différents pour l'isolement, le traitement et l'analyse des véhicules électriques ont été présentés, soit en utilisant une détection individuelle ou une approche à base de billes. Sélection de la méthode la plus appropriée à utiliser ne est pas toujours simple et nécessite une compréhension de l'échantillon testé ainsi que les sous-populations individuelles d'intérêt. En outre, la sensibilité du cytomètre utilisée pour l'acquisition doit être considéré au moment de choisir la méthode ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Dale Hirschkorn de Blood Systems Research Institute pour son aide avec cytomètre de flux réglages de l'appareil. Ce travail a été soutenu par le NIH et accorde HL095470 U01 HL072268 et contrats DoD W81XWH-10-1-0023 et W81XWH-2-0028.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cytomètre en flux de paillasse LSR IIBD Biosciences3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm bleu, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet et 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm rouge)
Logiciel FACS Diva  ;BD BiosciencesVersion PC 6.0
Logiciel FlowJo  ;Treestar USMac version 9.6.1 ou PC version 7.6.5
Sphero Rainbow Les particules fluorescentesBD Biosciences556298utilisées pour ajuster toutes les tensions de canal afin de maintenir la cohérence de l’intensité de fluorescence.
Particules fluorescentes Ultra RainbowSpherotechURFP-10-5utilisé en plus des billes Megamix-Plus SSC pour assurer la cohérence de la porte EV d’un lot à l’autre
Perles Megmix-Plus SSCBiocytex7803utilisées pour ajuster les tensions FSC et SSC afin de maintenir la cohérence entre les cycles. Peut également être utilisé pour surveiller le débit et ajuster le débit afin de s’assurer que le même débit est utilisé dans tous les cycles
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344utilisé pour les contrôles de compensation et les billes AbC négatives utilisées pour la méthode basée sur les billes
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz  ;SC-281108Utilisé dans la méthode de détection individuelle uniquement pour lyser des échantillons après la lecture initiale afin de les utiliser comme témoins négatifs. Le bouillon peut être dilué à 1:10 dans du PBS et conservé au réfrigérateur jusqu’à 1 mois.
BD TruCOUNT TubesBD Biosciences340334utilisé chaque fois que des concentrations absolues de VE sont nécessaires
Ultrafree-MC, GV 0,22 & micro ; m Unités de filtration centrifugeMillipore  ;UFC30GVNButilisé pour le lavage post-coloration des Evs et/ou le fractionnement des EV en fonction de la taille
Tubes de sang entier en verre Vacutainer ACD-ABD Biosciences364606
Tubes Facs 12x75 polystèneBD Biosciences352058
50 ml Réservoirs emballés individuellement.PhenixRR-50-1s Pointes
de pipette Green-Pak - 10 & micro ; lRaininGP-L10S Pointes
de pipette Green-Pak -200 & micro ; l  ;RaininGP-L250S
Vert -Pak pointes de pipette - 1 000 & micro ; l  ;RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 pointes préstériliséesRaininSS-L300S
Pipet-Lite  ;XLS 8 Canaux LTS  ; Réglable  ; Entretoise  ;RaininLA8-300XLS Plaques de culture tissulaire
96 puitsE& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Milieux (sans Hepes)Installation de culture cellulaire UCSFCCFAE001milieux utilisés pour la méthode de détection à base
de billes Dulbeccos PBS D-PBS, sans CaMg, 0,2 & micro ; m filtréUCSF Cell Culture FacilityCCFAL003
Tube ultracentrifuge, paroi mince, ultra-transparentBECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 µ ; l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 & micro ; l
CD16 V450BD Biosciences5604742 & micro ; l
CD28 FITCbiolegend3029062 & micro ; l
CD152 APCBD Biosciences5558552 & micro ; l
CD19 A700Biolegend3022262 & micro ; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 & micro ; l
CD62L APCBiolegend3048102 & micro ; l
CD108 PE  ;BD Biosciences5528302 & micro ; l
CD235a FITCbiolegend3491042 & micro ; l
PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 & micro ; l
CD62p APCBiolegend3049102 & micro ; l
CD66b PE  ;Biolegend3051062 & micro ; l
CD15 FITCexalphaX1496M5 & micro ; l
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