Un guide pour générer et utiliser hiPSC PNJ dérivés pour l'étude des maladies neurologiques

Résumé

Ce protocole décrit comment les cellules progénitrices neurales peuvent être différenciées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, afin de produire une population de cellules neurales robustes et répliquatives, qui peut être utilisée pour identifier les voies de développement contribuant à la pathogenèse de la maladie dans de nombreux troubles neurologiques.

Résumé

Les études post-mortem des maladies neurologiques ne sont pas idéales pour identifier les causes sous-jacentes de l’apparition de la maladie, car de nombreuses maladies incluent une longue période de progression de la maladie avant l’apparition des symptômes. Étant donné que les fibroblastes de patients et de témoins sains peuvent être efficacement reprogrammés en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC), puis différenciés en cellules progénitrices neurales (NPC) et en neurones pour l’étude de ces maladies, il est maintenant possible de récapituler les événements de développement qui se sont produits avant l’apparition des symptômes chez les patients. Nous présentons une méthode permettant de différencier efficacement les hiPSC en NPC, qui, en plus d’être capables de se différencier davantage en neurones fonctionnels, peuvent également être robustement passés, gelés-décongelés ou transitionnés pour se développer en tant que neurosphères, permettant un dépistage génétique rapide pour identifier les facteurs moléculaires qui ont un impact sur les phénotypes cellulaires, notamment la réplication, la migration, le stress oxydatif et/ou l’apoptose. Les cellules hiPSC dérivées de patients constituent une plateforme unique, parfaitement adaptée pour le test empirique des conséquences cellulaires ou moléculaires de la manipulation de l’expression des gènes.

Introduction

des études d'expression génique de neurones différenciés in vitro à partir de cellules souches pluripotentes d'origine humaine (les) hiPSCs par nous et d'autres ^{1 2,3} indiquent que les neurones hiPSC ressemblent foetal plutôt que le tissu cérébral adulte. À l'heure actuelle, les modèles fondés sur hiPSC peuvent être plus appropriées pour l'étude de prédisposition à, plutôt que de caractéristiques tardive de la maladie neurologique. Nous avons précédemment rapporté que une fraction significative de la signature de gène de neurones hiPSC dérivé schizophrénie est conservée dans les cellules de la schizophrénie de hiPSC dérivé progénitrices neurales (CNP), indiquant que CPN peut être un type cellulaire utile pour étudier les mécanismes moléculaires qui contribue à la schizophrénie ¹ . Nous et d'autres avons signalé la migration aberrante, augmentation du stress oxydatif et les espèces réactives de l'oxygène, la sensibilité à la sous-seuil stress environnementaux et la fonction mitochondriale altérée dans la schizophrénie hiPSC PNJ ^1,4-6, ainsi qu'une diminution de c neuronaleonnectivit é et la fonction synaptique dans les neurones de la schizophrénie hiPSC ^5,7-10. Si les facteurs moléculaires contribuent à la migration aberrante et / ou le stress oxydatif dans la schizophrénie hiPSC PNJ sous-tendent également la connectivité neuronale réduite dans les neurones hiPSC dérivés schizophrénie, PNJ pourraient être une population de neurones robuste et très réplicative avec lequel pour étudier les mécanismes responsables de la maladie. En outre, parce que l'on peut générer rapidement un grand nombre de cellules et ne doivent pas attendre des semaines ou des mois pour la maturation neuronale, tests basés sur PNJ sont adaptés pour l'étude de cohortes de patients plus importants et sont plus disposés à criblage à haut débit. Nous croyons que hiPSC PNJ peut servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la pathogenèse de la maladie, comme cela a déjà été démontré dans de troubles aussi divers que la schizophrénie ¹ et la maladie de Huntington ^11.

Pour différencier les PNJ de se hiPSCs, neurale initialela production est réalisée par double inhibition SMAD (0,1 mM et 10 mM LDN193189 SB431542) ^12. En se opposant BMP et TGF signalisation avec ces petites molécules, l'endoderme et du mésoderme spécification est bloquée, ce qui accélère la différenciation neuronale et conduisant à la formation de rosettes de neurones visibles dans la semaine de placage. Neural motif se produit au début de ce processus, probablement au cours de la période de la formation de rosettes de neurones et immédiatement après. En l'absence d'autres indices, ces cellules nerveuses primitives supposent un cerveau antérieur comme le destin ^{antérieure-13.} Immédiatement après la formation de rosettes de neurones, et continue tout au long de l'expansion de l'APN, PNJ cerveau antérieur sont cultivées avec FGF2 ^8,14. Ils ont le potentiel de la lignée double et peuvent être différenciés aux populations de neurones de 70-80% neurones III-tubuline-positifs et de 20 à 30% protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) astrocytes -positifs (Figure 1). La majorité des neurones du cerveau antérieur hiPSC sont VGLUT1 positif, Et sont donc vraisemblablement glutamatergique, même si environ 30% des neurones sont GAD67 positif (GABAergique) ^8.

PNJ sont régulièrement soumises à des passages plus de dix fois in vitro, tout en maintenant des profils de différenciation cohérentes et sans accumuler des anomalies du caryotype. Groupes ont rapporté PNJ de passages plus de 40 fois ^15, cependant, nous constatons que plus de dix passages, PNJ montrent propension accrue à la différenciation des astrocytes. PNJ bien tolérer plusieurs gel-dégel et peut être la transition de croître comme neurosphères simplement en culture dans des plaques non-adhérentes. PNJ sont efficacement transduites par des vecteurs viraux, permettant l'évaluation rapide des conséquences moléculaires et cellulaires de la perturbation génétique et facilement extensible pour obtenir suffisamment de matériel pour les études biochimiques. En outre, en raison des vecteurs viraux permettent robuste sur-expression et / ou inactivation de gènes responsables de maladies concerné, soit le contrôle ou le patient dérivée neural cellules, on peut utiliser cette plateforme pour tester l'effet de fond génétique sur ces manipulations. Bien que ne convient pas pour synaptique ou tests basés sur les activités nécessitant neurones matures, PNJ peut être une alternative pratique pour de nombreuses analyses moléculaires ou biochimiques simples de cellules neurales provenant de patients.

Protocole

1. hiPSC différenciation de cellules progénitrices neurales

1. Grandir et se développer hiPSCs dans les cellules souches embryonnaires humaines (HES) médias (tableau 1) co-cultivées sur une fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de couche d'alimentation jusqu'à ce que les grandes (mais subconfluentes) colonies sont prêts pour la différenciation neuronale via un corps embryoïdes (EB) intermédiaire (Figure 2). Conditions de culture de routine hiPSC sont bien décrits ailleurs ^16,17; brièvement, grandir hiPSCs dans les médias HES sur une couche nourricière MEF jusqu'à la confluence, puis le passage par voie enzymatique avec de la collagénase (1 mg / ml dans DMEM) et étendre environ 1: 3 tous les 7 jours.
2. Pour préparer des plaques revêtues de poly-L-ornithine / laminine, des plaques de revêtement de 10 g / ml de poly-L-ornithine dans de l'eau stérile pour les surfaces en plastique (50 g / ml pour les surfaces de verre) et incuber à température ambiante pendant 3-24 heures. Laver au moins une fois avec de l'eau stérile, puis enrober de 5g / ml laminine dans du PBS stérile à température ambiante pendant 3 à 24 h.
   NOTE: Si enveloppés dans du plastique, les plaques peuvent êtrestockée jusqu'à six mois à -20 ºC.
3. Le Jour 1, soulevez enzymatique hiPSCs subconfluentes (généralement cultivées sur des MEF, ou hiPSCs cultivés dans des milieux définis tels que REET ¹⁸ sur Matrigel) de la plaque que les grandes colonies en utilisant 1 mg / ml collagénase IV dans du DMEM / F12.
   NOTE: Après 1-2 heures d'incubation à 37 ° C, les colonies sera flottant dans le plat.
4. Lavez délicatement colonies hiPSC (par décantation, la centrifugation pas) 1-2x avec DMEM / F12, remettre en suspension dans 2 ml / puits de N2 / médias B27 (tableau 1) et le transfert aux plats non adhérent 6 puits (combiner trois puits dans une eh bien) ^19.
   REMARQUE: Pendant la nuit, les colonies formeront flottants grappes sphériques appelé «corps embryoïdes" (EbS). Attendez-vous à une mort cellulaire importante.
5. Le Jour 2, les plaques d'inclinaison et de permettre de régler EB. Retirez délicatement les médias et laver une fois avec DMEM / F12 pour enlever les débris. Nourrissez-le avec N2 / B27 milieux supplémentés avec des inhibiteurs SMAD double (0,1 M LDN193189 et 10M SB431542) ¹² .
6. Sur Jours 3-7, neuralisation se produira dans le cadre de la double inhibition SMAD; vérifier que EB sont ronds mais pas kystique. EB nourrir tous les deux jours avec les médias N2 / B27 complété avec 0,1 M LDN193189 et 10M SB431542.
7. Sur Jours 7-14, à la suite du dépôt EBS pour Poly-L-ornithine / laminine plaques revêtues, consultez l'aide d'un microscope à fond clair que rosettes neurones commencent à apparaître dans quelques jours (caractérisé comme des grappes de cellules rondes neuroépithéliales avec apico-basale polarité; figure 1). Continuer à alimenter EB adhérentes chaque seconde de jour avec N2 / B27 médias complété avec 0,1 M de LDN193189, 10M SB431542 et 1 g / ml laminine.

2. Récolte de Neural rosettes

NOTE: Nous recommandons que rosettes neuronaux être récoltées en utilisant enzymatique Réactif de Sélection Neural Rosette ²⁰ ou réactif de sélection similaire. Bien rosettes de neurones peuvent être récoltés manuellement dans 6 puits Poly-L-ornithine / laminine plaque revêtue, this méthodologie prend une formation approfondie pour maître, et, en fonction de l'utilisateur compétences, peuvent nécessiter un second tour de la cueillette à jour 20 pour enrichir encore plus pour les PNJ et épuiser types de cellules non-neuronales.

1. Pour la sélection enzymatique de rosettes de neurones au jour 14, les médias aspirer de EB adhéré et ajouter 1 ml de neurones réactif de sélection de la rosette par puits pour une plaque à 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
2. Avec un Pipetman P1000, retirez délicatement enzyme de chaque puits. Ajouter 1 ml de DMEM / F12 par puits pour se laver.
3. Avec un P1000, recueillir les 1 ml de DMEM / F12 et rapidement expulser le DMEM / F12 dans le puits, détachant ainsi les rosettes de la plaque. Recueillir les rosettes dans un tube de faucon.
4. Pipet encore 1 ml de DMEM / F12 et rapidement expulser dans le même puits pour détacher rosettes restants. (Ne pas triturer. Essayez de ne pas casser les agrégats de la rosette). Recueillir les rosettes de neurones dans un même tube de faucon.
5. Répétez l'étape 2.4 si nécessaire. Si rosettes ne se détachent pas facilement, ajouter more enzyme et répétez le processus (étapes 2.1 à 2.4)
6. Spin cellules à 300 g pendant 3 min. Aspirer le lavage, et remettre en suspension dans 2 ml rosettes des médias PNJ (tableau 1). cellules de transfert (1: 1) dans un poly-L-ornithine / laminine revêtus 6 plaque bien.
7. De 15 à 21 jours, les rosettes de neurones augmenteront; rosettes d'alimentation à chaque seconde de jour avec le PNJ médias.
8. Évaluer la qualité des rosettes de neurones et de se assurer que les cellules de fibroblastes plats ne se développent pas dans la culture.
   NOTE: Si les non-rosettes persistent, la culture PNJ peut parfois être récupéré par cueillette manuelle, en sélectionnant seulement le meilleur des rosettes cueillies dans Accutase. Dissocier 15 min à 37 ° C. Pellet, laver et plaque dans PNJ support sur 24 puits Poly-L-ornithine / laminine plaque revêtue.

3. expansion des cellules progénitrices neurales

Remarque: NPC hiPSC peut être cultivé sur navigateur Matrigel- ou poly-L-ornithine / laminine plaques revêtues. Nous utilisons généralement MatrigeL-plats, car ils peuvent être préparés plus rapidement et à moindre coût.

1. Pour préparer des plaques enduites de Matrigel, décongeler rapidement et remettre en suspension une portion aliquote congelée de 1 mg dans 24 ml de Matrigel froid DMEM / F12 et distribuer immédiatement 2 ml à chaque puits de deux plaques à six puits. Incuber pendant au moins 1 heure à 37 ºC.
   NOTE: Matrigel a seulement besoin d'être aspiré, pas lavé, immédiatement avant l'utilisation.
2. Nourrir PNJ tous les deux jours et maintenir à très haute densité ou ils spontanément se différencier pour les neurones.
   REMARQUE: Bien que les PNJ plus établis sont généralement divisées 1: 4 chaque semaine, les PNJ de passage très faibles peuvent être répartis 1: 2 comme peu souvent qu'une fois toutes les deux semaines.
3. Pour diviser, premier média aspirer et ajouter 1 ml chaude Accutase (1X) par puits de plaque de 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 10-15 min.
4. Transférer en douceur les cellules individuelles dans un tube de 15 ml contenant du DMEM / F12 avec aussi peu de contraintes mécaniques que possible. Ne pas titrer cellules tout en enzyme. Cellules granules par Spinning à 1000 g pendant 5 min.
5. Aspirer le lavage, et remettre en suspension les PNJ dans ~ 1 ml PNJ médias par puits original de 6 puits.
   REMARQUE: Attendez que le puits de confluence d'un plat à 6 puits a 5-10000000 cellules; Ceci peut être confirmé par le comptage d'un aliquote de 10 litres de cellules en utilisant un hémocytomètre avant de re-placage.
6. Après remise en suspension, PNJ re-plaque comme PNJ, ou neurones neurosphères. Pour maintenir PNJ, la plaque d'environ 1-2 millions de cellules par puits d'une plaque à 6 puits. L'efficacité de la formation de neurosphères peut varier entre les expériences et les lignées cellulaires, mais se produit généralement préférable que entre 200.000 et 1.000.000 cellules sont ensemencées par puits d'une plaque à 6 puits non adhérente; si l'agglutination des neurosphères se produit, réduire le nombre de cellules ensemencées. Pour différencier les neurones, plaque environ 200 000 cellules par puits d'une plaque à 6 puits, remplaçant médias NPC avec les médias neurone.
7. Immunohistochimique valider chaque ligne PNJ établie. Une fois que suffisamment de matériel cellulaire a été expanDED, des PNJ d'étiquettes avec des anticorps pour la nestine et SOX2. Validé lignes PNJ devraient également être différenciées en neurones pendant 4-6 semaines, et marquées avec des anticorps pour III-tubuline et MAP2AB.
   1. Fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS à 4 ° C pendant 10 min. Perméabiliser PNJ à température ambiante pendant 15 min dans 1,0% de Triton dans du PBS, puis bloquer dans le sérum de l'âne de 5% avec 0,1% de Triton à température ambiante pendant 30 min.
   2. Incuber avec l'anticorps primaire dans le sérum de l'âne de 5% avec 0,1% de Triton, une nuit à 4 ° C.
      NOTE: Nous vous recommandons les anticorps suivants: chèvre anti-Sox2, 1: 200; de souris anti-nestine humaine, 1: 200; de lapin anti-BIII-tubuline, 1: 500; anti-BIII-tubuline de souris, 1: 500; anti-MAP2AB souris, 1: 200. (Figure 2).
   3. Après un lavage avec du PBS, les cellules incuber des anticorps secondaires avec l'anticorps secondaire approprié conjugué à de chèvre, de souris ou de lapin à 1: 300, en en 5% de sérum de âne avec 0,1% de Triton pendant 1-2 heures à température ambiante. Pour visualiser les noyaux, les cellules de coloration avec 0,5 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) puis monter avec Vectashield.

4. PNJ transduction

1. Utilisation spinfection (centrifugation de plaques de culture de cellules en présence de virus à 1000 x g pendant 1 heure) pour augmenter le pourcentage de cellules transfectées ^21. Aspirer le milieu et remplacer par la surexpression pertinentes (ou de contrôle) ou lentivirus (rétrovirus), titrés à la multiplicité désirée d'infection (MOI) (typiquement 1-10), diluée dans les médias NPC. Utiliser 1,5 ml de volume par puits d'une plaque à 6 puits (ou un volume à l'échelle appropriée pour d'autres types de plaques de culture de tissus). Spin à 1000 xg et 37 ºC pendant 1 heure dans une centrifugeuse de la plaque.
   REMARQUE: Idéalement, la transduction PNJ avec lentiviral ou vecteurs rétroviraux dans les 1-2 jours de fractionnement. Que l'on utilise des virus commerciales ou préparés en laboratoire, il peut être utile pour titrer appropriée lots de virus à l'avance par dilution en série. (Figure 3).
2. Pour réduire cellular mort, remplacer le support dans les 8 h de spinfection.
   REMARQUE: l'intégration virale et l'expression du transgène doit être détectable dans les 24 heures par fluorescence d'un gène rapporteur. (Si le virus manque d'un rapporteur fluorescent, ce est plus difficile à évaluer; transfection réussie peut être mieux validée par immunoblot, immunohistochimie ou qPCR pour les produits de surexpression.) Pleine expression peut prendre 3-7 jours; spinfections répétés avec le virus supplémentaires peuvent être nécessaires pour augmenter le pourcentage de cellules transfectées. Spinfections récurrentes peuvent se produisent quotidiennement, mais pas besoin d'être si fréquent. Idéalement, si vous utilisez un rapporteur fluorescent,> 80% des cellules doit être étiqueté.

5. Migration Neurosphère Assay

REMARQUE: Neurosphères forme spontanément, suite à la dissociation enzymatique de PNJ (par une manière identique à celle utilisée dans l'expansion PNJ - étapes 3/3 à 3/6), si les cellules sont cultivées en suspension dans PNJ médias.

1. Brièvement, grandir dissocierPNJ dans les médias d NPC pour 48 h dans des plaques non adhérentes afin de générer neurosphères. (Figure 4).
2. Pour la migration de neurosphère, préparer des plaques Matrigel frais en utilisant les médias NPC froid, plutôt que DMEM, dans une plaque de 96 puits, 1-2 heures avant neurosphère cueillette. Ne pas aspirer les puits de Matrigel.
3. Tel que publié pour souches embryonnaires neurosphères dérivées de cellules ^22, choisissez manuellement neurosphères NPC dérivés sous un microscope, après avoir lavé une fois dans les médias NPC pour éliminer les débris cellulaires. Transférer une neurosphère à chaque puits d'une plaque de 96 puits Matrigel revêtu.
4. Ajouter un montant supplémentaire de 0,5 mg Matrigel, dilué dans les médias NPC froides, les neurosphères dans chaque plaque de 96 puits.
5. Centrer manuellement chaque neurosphère individuelle au milieu du puits en utilisant une pipette.
   NOTE: Il est important de choisir neurosphères de taille similaire, afin de réduire la variabilité dans les résultats.
6. Permettre la migration de se produire pendant 48 heures et ensuite fixer les cellules wième paraformaldéhyde 4% et les taches avec des marqueurs immunohistochimiques souhaités.
7. Si la migration radiale doit être déterminée, neurosphères de photographie dans leur entièrement en utilisant un objectif 4x microscope. Exclure des neurosphères en contact avec le bord du puits ou une seconde neurosphères à partir de l'analyse.
   NOTE: Si la migration se produit pendant plus de 48 heures, la migration radiale résultante sera probablement trop grand pour l'image en utilisant un objectif 4x.
8. Mesurer la migration moyenne de chaque neurosphère l'aide du logiciel NIH ImageJ (figure 5). Ceci peut être réalisé en utilisant l'une des méthodes d'analyse décrites ci-dessous:
   1. La migration Radial:
      1. Tracer manuellement le bord des cellules les plus éloignées de la migration à l'aide de l'outil de sélection à main levée puis utilisez la fonction (Ctrl + M) Mesure pour calculer l'aire de la forme obtenue. Avant de mesurer la zone assurez-vous que la région est cochée dans la fenêtre Définir les mesures trouve sous l'onglet Analyser. Utilisez leLa valeur de la mesure de surface et l'équation de la surface d'un cercle (A = πr ²⁾ pour déterminer le rayon (externe).
      2. Tracer le bord de la neurosphère origine, mesurer la surface et de calculer le rayon (intérieure) de la même manière. Calculer la migration radiale totale comme étant la différence entre les rayons externe et interne.
   2. Greatest migration cellulaire:
      1. Mesurer la distance parcourue des cinq cellules les plus éloignées du bord de la neurosphère intérieure en utilisant l'outil de sélection en ligne droite suivie par la fonction (Ctrl + M) Mesure.

Résultats

Rosettes de neurones peuvent être identifiées morphologiquement en utilisant un microscope à fond clair, par leur aspect caractéristique en tant que clusters de cellules neuro-épithéliales rondes avec polarité apico-basale (Figure 1). Bien que les PNJ sont généralement cultivées à très haute densité cellulaire, immédiatement après repiquage, légèrement soma forme pyramidale et la structure bipolaire neurites est visible (figure 1D). PNJ validées expriment la nestine et SOX2 dans la majo...

Discussion

Nous avons décrit les méthodes permettant de différencier hiPSCs dans PNJ, un type de cellules neurales dans laquelle une fraction importante de la signature génétique des neurones hiPSC dérivés est conservée et que peuvent servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la maladie pathogenèse ^{8, 11.} En outre, comme nous l'avons précisé, les PNJ sont une population de neurones robuste réplicative et facilement transduites, qui nous croyons peut être approprié pour les ét...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	pour les milieux HES
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	pour les milieux neuronaux
KO-Serum	Replacement Life Technologies	#10828	Doit être testé sur un lot
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	;#11140
N2	Life Technologies	;#17502-048	Doit être testé en lot
B27-RA	Life Technologies	;#12587-010	Doit être testé en lot
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Remettre en suspension en PBS + 1 % BSA
	LDN193189 Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Remise en suspension dans PBS + 0,1 % BSA
GDNF  ;	Peprotech	;#450-10	Remise en suspension dans PBS + 0,1
BSA Dibutyryl cyclic-AMP	Sigma	;#D0627	Remise en suspension dans PBS + 0,1 % BSA
Acide L-ascorbique	Sigma	#A0278	Remise en suspension dans H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Réactif	Stemcell Technologies	;#05832
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104
Collagénase IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminine, Souris Naturelle 1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Remettre en suspension sur de la glace dans du DMEM froid à 10 mg/ml, utiliser 1 mg par équivalent à deux plaques à 6 puits
traitées par culture tissulaire	Corning	3506
Plaques à 6 puits à très faible fixation	Corning	3471
anti-Sox2  ;	Santa Cruz	sc­ ; 17320	utilisation à 1:200
souris anti-humain Nestin	Millipore	MAB5326	utilisation à 1:200
lapin anti-&beta ; III-tubuline	Covance	PRB­ ; 435P	utilisation à 1:500
souris anti-&beta ; III-tubuline	Covance	MMS­ ; 435P	utilisation à 1:500
souris anti-MAP2AB	Sigma	M1406	utilisation à 1:200
Centrifugeuse à plaques	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (avec support de plaque SX4750)