Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons

14.7K vues

⸱

DOI :

10.3791/52520

⸱

4 mars 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d'injecter des agents de contraste ultrasonores de microbulles dans la vie, isolés en fin de gestation embryons murins de la scène. Cette méthode permet l'étude des paramètres de perfusion et de marqueurs moléculaires vasculaires au sein de l'embryon en utilisant à haute fréquence échographie de contraste amélioré.

Résumé

L’imagerie par ultrasons peut transmettre des informations quantitatives essentielles concernant la vascularisation et la perfusion tissulaires et, dans des applications ciblées, faciliter la détection et la mesure de biomarqueurs vasculaires au niveau moléculaire. Dans l’embryon de souris, cette technique non invasive peut être utilisée pour découvrir les mécanismes de base sous-jacents au développement vasculaire dans le système circulatoire précoce de la souris et dans des modèles génétiques de maladies cardiovasculaires. L’embryon de souris se présente également comme un excellent modèle pour étudier l’adhésion des microbulles à des cibles angiogéniques (y compris le récepteur 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR2) ou αv β3) et pour évaluer la nature quantitative de l’échographie moléculaire. Nous avons donc développé une méthode pour introduire des agents de contraste à ultrasons dans le système vasculaire d’embryons vivants et isolés. Cela permet une liberté en termes de contrôle et de positionnement de l’injection, de reproductibilité du plan d’imagerie sans obstruction ni mouvement, et une analyse et une quantification simplifiées de l’image. À la fin de la gestation (jour embryonnaire (E)16.6 et E17.5), des embryons murins ont été isolés de l’utérus, doucement extériorisés du sac vitellin et des agents de contraste à microbulles ont été injectés dans les veines accessibles à la surface chorionique du disque placentaire. L’imagerie par ultrasons de contraste non linéaire a ensuite été utilisée pour recueillir un certain nombre de paramètres de perfusion de base (augmentation du pic, taux de lavage et temps jusqu’au pic) et quantifier la liaison ciblée des microbulles dans un modèle murin d’endogline. Nous montrons la circulation réussie des microbulles dans les embryons vivants et l’utilité de cette approche dans la caractérisation du système vasculaire embryonnaire et du comportement des microbulles.

Introduction

échographie de rehaussement du contraste permet l'utilisation d'agents de contraste à microbulles de visualiser et caractériser l'environnement vasculaire. Ces agents permettent l'évaluation non invasive de la microcirculation, la vascularisation et la fonction cardiovasculaire. En outre, la modification de la surface de la bulle peut conduire à la liaison à microbulles ciblée biomarqueurs endotheliales, comme démontré dans des applications précliniques de l'angiogenèse, l'athérosclérose et l'inflammation faisant 1,2 imagerie par ultrasons moléculaire des événements vasculaires possibles. Échographie de contraste amélioré peut donc être utilisée pour identifier les environnements complexes et variés qui influencent états vasculaires sains et malades 3-5.

Dans le cours des dernières années, l'intérêt pour l'utilité de l'imagerie de microbulles a étendu au modèle polyvalent d'embryon de souris. Comme un modèle de développement des mammifères, l'introduction de microbulles dans le système vasculaire embryonnaire améliore physiologiqueétude du système circulatoire en développement (par exemple, le flux sanguin, le débit cardiaque) et en cas de transgéniques et des modèles de souris mutantes ciblés de la maladie cardiaque 6,7, peut fournir des indications sur la façon dont les facteurs génétiques de modifier la fonction cardiovasculaire. En fait, 2D analyse quantitative et qualitative du cerveau embryonnaire vasculaire ont déjà été atteints 8. En outre, l'embryon de souris présente comme un excellent modèle pour l'examen de la liaison de microbulles ciblées à des marqueurs vasculaires in vivo. Bartelle et al. 9, par exemple, ont mis en place des microbulles avidine en embryon ventricules cardiaque pour évaluer la liaison ciblées dans BIO TAG-Bira embryons transgéniques et d'examiner l'anatomie vasculaire. La génération de modèles hétérozygotes et homozygotes souris peut également être utilisé comme un substitut pour des études de modèle de tumeur visant à définir la nature quantitative de l'échographie moléculaire - une étape importante dans la traduction de cette technique à la clinique.

microbulles sont le plus souvent introduit à la circulation embryonnaire par injections intra-cardiaque dans des embryons simples exposés à travers une laparotomie 8-10. Dans injections in utero, cependant, faire face à un certain nombre de défis. Il se agit notamment des conseils d'injection, la nécessité de contrer le mouvement dans la mère et l'embryon extériorisé, le maintien de la viabilité hémodynamique chez la mère et embryons extériorisés, portant sur ​​les effets à long terme de l'anesthésie et de complications dues à un saignement 11. Par conséquent, l'objectif de l'enquête était de développer une technique pour injecter microbulles en vie isolé des embryons à un stade avancé 12. Cette option offre plus de liberté en matière de contrôle d'injection et le positionnement, la reproductibilité du plan d'imagerie sans entrave, et l'analyse d'image simplifiée et la quantification.

Dans la présente étude, nous présentons une nouvelle procédure pour l'injection de microbulles en vivant embryons murins for les fins de l'étude du comportement cinétique microbulles et d'étudier la liaison à des marqueurs de surface endothéliales endogènes microbulles ciblées. Non linéaire échographie de contraste spécifique est utilisé pour mesurer un certain nombre de paramètres de perfusion de base, y compris la mise en valeur de crête (PE), lavez-la fréquence et de temps pour culminer (TTP) dans isolées embryons E17.5. Nous démontrons également la validité du modèle d'embryons pour évaluer la nature quantitative de l'échographie moléculaire dans une perte de endogline embryonnaire de modèle de souris fonction transgénique, où endogline est une cible cliniquement pertinente en raison de sa forte expression dans les cellules endothéliales vasculaires dans les sites de l'angiogenèse active 13 . L'adhésion de l'endogline ciblée (MB E), isotype de rat IgG 2 commande (MB C) et non ciblées (MB U) microbulles est évaluée dans endogline hétérozygote (+/- Eng) et homozygote endogline (ENG + / +) exprimant des embryons. Analyse du bindi cibléeng révèle que l'échographie moléculaire est capable de différencier entre les génotypes de endogline et concernant les densités de récepteurs à des niveaux moléculaires quantifiables à ultrasons.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

REMARQUE: Les procédures expérimentales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de soins des animaux au Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procédures pour le traitement sans cruauté des animaux doivent être respectées en tout temps. Il est supposé que l'enquêteur est formé dans le fonctionnement de base d'un système d'imagerie par ultrasons. Ce protocole fonctionne mieux avec deux personnes.

1. Modèles animaux

  1. Compagnon CD-1 mâle et femelle Mus musculus d'obtenir des embryons de type sauvage pour les études de perfusion.
  2. Pour les études d'imagerie moléculaire, de générer la souris Eng par recombinaison homologue en utilisant des cellules souches embryonnaires de 129 origine / Ola comme décrit par Bourdeau et al. 14.
    1. Les souris de rétrocroisement B6- Eng, veuillez acquis du Dr Michelle Letarte, sur le CD-1 arrière-plan. Le CD-1 Utiliser Eng rétrocroisés embryons, ainsi que leur Eng + / + co littermatentrols. Accoupler les souris de produire des embryons mis en scène.

2. Préparation expérimentale

  1. Initier accouplement de souris et de vérifier bouchons quotidienne. Jour embryonnaire 0,5 est défini comme midi de la journée d'un bouchon vaginal est observée.
  2. Préparer support d'embryon par addition de 50 ml de sérum bovin fœtal, 5 ml de 1 M de HEPES et 5 ml de pénicilline-streptomycine (10 000 unités de pénicilline, 10 000 ug de streptomycine) à 500 ml du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec haute teneur en glucose (4500 mg / L). Envelopper la bouteille dans du papier et de garder réfrigérés à 4 ° C.
  3. Centrifugeuse gel échographique clair dans 50 ml tubes coniques à 140 g pendant 20 min. Dessinez gélifier jusqu'à 30 ml dans des seringues. Remplissez supplémentaires (marqué) 30 ml seringues avec tampon phosphate salin (PBS) et mettre de côté. Une portée d'embryons exige généralement entre 2-3 seringues de gel de l'échographie et 4 seringues de PBS.
  4. Tirez environ 30 aiguilles de verre et serrez doucement pour une bande de pâte à modelerdans une boîte de culture cellulaire de 100 x 20 mm. Cela assure que les aiguilles sont séparées et sûr pendant la manipulation. Aide d'un extracteur de verre, utilisez les paramètres suivants sur 1 x 90 mm capillaires de verre à filament: Chauffeur 77, 55 Sous aimant, aimant principal 70.
  5. Préparer dix à douze plaques de dissection (assez pour se assurer que chaque embryon dans une litière recevra sa propre boîte), en utilisant un ratio de 1: 8 en volume d'agent de durcissement à la base. Verser 40 ml de base dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 5-6 ml agent de durcissement et remuer avec un bâton en bois.
    1. Verser dans 60 x boîtes de culture de 15 mm, chaque remplissage de moitié environ. Laisser reposer O / N à définir.
  6. Attacher Luer femelle à 400 mm de longs morceaux de chlorure de polyvinyle (PVC) tube (diamètre interne: 0,79 mm). Le tube doit atteindre à partir de la pompe à seringue pour l'étape d'ultrasons confortablement.

3. expérimental

  1. Disposer la plate-forme d'imagerie sous le microscope chirurgical avec un moteur 3D et réseau linéaire 21 MHz transducteur.
    1. Orient la plate-forme de sorte que le rail de montage est sur la gauche, à l'étape positionné directement sous le microscope.
    2. Fixer le moteur 3D à la rotule du bras se étendant de la plate-forme. Vissez le poste de libération rapide de la pince de la sonde dans la libération rapide monter sur le moteur, vers l'avant, et de positionner la tête de transducteur dans la pince, la fixation de la serrure.
    3. Fixez le connecteur de la sonde dans le port actif sur le panneau avant du panier. Allumer la machine.
  2. Initier le transducteur à ultrasons de 21 MHz, la sélection du réglage 'de cardiologie »pour des études d'imagerie moléculaire, et« générale »pour les études de perfusion. Maj tous les curseurs temps gain compensation à la position milieu exact. Pour «mode Contraste ', définir les paramètres suivants: Fréquence: 18 MHz, la puissance de transmission: 4%, (0,39 MPa), contraste Gain: 30 dB, Foci: 6 et 10 mm, Contraste Mode: non linéaire, le temps d'éclatement: 100% à 0,1largeur sec, faisceau: Large.
  3. Aliquotes 40 ml de milieu d'embryon chacun en quatre 50 ml tubes coniques. Placez sur la glace.
  4. Chauffer 1 L d'eau dans un bécher de 2 L. sur une plaque chauffante. Maintenir à 45 ° C. Ajouter une seringue de gel d'ultrasons et PBS dans le bécher pour préchauffer. Maintenir cette température par le contrôle d'un thermomètre à tout moment.
  5. Mettre de côté dix à douze seringues et 1 ml de dix à douze 21 g d'aiguilles pour l'injection de microbulles.

4. Intervention chirurgicale

NOTE: Demander à un assistant de préparer les bulles (étape 5) tandis que le chirurgien commence l'intervention chirurgicale. Le protocole décrit ici a été adapté de Whiteley et al 15.

  1. Recueillir E16,5 ou E17.5 embryons de la souris femelle enceinte suivants dislocation cervicale.
    REMARQUE: Les effets de l'anesthésie sur les embryons ne ont pas encore été étudiées en détail 16. D'autres méthodes, y compris la décapitation, peuvent être op appropriéetions pour le sacrifice des souris enceintes.
    1. Couper ouvrir l'abdomen de révéler l'utérus et les embryons. Soigneusement et rapidement enlever l'utérus en coupant à l'extrémité des cornes utérines (sectionnement des vaisseaux ovariens et utérins) et la séparation au vagin et la vessie.
    2. En utilisant une pince à échardes, transférer l'utérus à un tube de 40 ml de milieu d'embryon glacée aussi rapidement que possible sans endommager les embryons. Jeter la carcasse de la souris.
  2. Déménagerais dans un microscope et la scène. Déposer l'utérus dans une boîte de culture cellulaire de 100 x 20 mm. Transférer l'utérus dans un nouveau plat rempli de 50 ml de milieu d'embryons frais.
  3. Utilisation stérilisé (pulvérisation d'éthanol à 70%) des pinces fines, déchirer délicatement et retirez les membranes externes de l'utérus commençant à une extrémité. Exposer la caduque placentaire, pariétal sac vitellin et la membrane de Reichert pour séparer et éliminer de la vésicule ombilicale viscérale sous-jacent.
  4. On dissèque les embryons une par une, en maintenant la y viscéralesacs OLK intactes et de manutention le placenta aussi doucement que possible 17. Prenez soin d'éviter la rupture de la vésicule ombilicale que les embryons pop immédiatement.
    1. Utilisez la cuillère perforée pour déplacer les embryons à un autre plat conservé dans la glace avec les médias d'embryons frais. Garder les embryons réfrigérés jusqu'à ce que nécessaire. Changer les médias dans le plat de chaque embryon 1-1,5 h. Avec ces conditions embryons sont viables jusqu'à 4 h après la dissection.

5. microbulles Préparation

REMARQUE: Effectuez imagerie moléculaire avec des ultrasons en utilisant les deux microbulles ciblées et non ciblées. Une expérience unique peut nécessiter jusqu'à trois flacons séparés de microbulles: microbulles i) anticorps ciblée microbulles, ii) anticorps isotype contrôle ciblées et iii) microbulles non ciblées. L'agent de contraste se présente comme une poudre sèche et le gel doit être reconstitué avec une solution saline avant l'injection. Il ya ~ 2 x 10 9 microbulles dans chaque microb non cibléeflacon ubble et ~ 8,8 x 10 8 microbulles dans les flacons prêts cibles. Les microbulles sont stables pendant jusqu'à 3 heures après la reconstitution.

  1. Reconstitution des cibles Prêt flacons
    NOTE: Des exemples de préparations prêtes cibles: microbulles de endogline ciblées (MB E, avec rat biotinylé MJ 7/18 anticorps à endogline de la souris; en installations d'hybridation de la maison); vasculaire récepteur du facteur de croissance endothelial 2 (VEGFR2) microbulles ciblées (Mo V, à la biotine anti-souris CD309); isotype de rat anticorps IgG de contrôle 2 microbulles ciblées (MB C, biotine isotype de rat IgG deux cibles de maîtrise IgG2a de souris).
    1. Diluer la solution d'anticorps (20 pg) dans 1 ml (volume final) d'une solution saline. Garder sur la glace.
    2. Remplir la seringue avec 1 ml de solution saline, en supprimant toutes les bulles d'air. Fixation de l'aiguille 21 G, injectez lentement la solution dans le flacon de microbulles.
    3. Retirer lentement le piston, retirer 1 ml d'air, et de retirer l'aiguille. Doucementagiter. Laisser reposer 5 min sur la glace.
      REMARQUE: microbulles ultrasons peuvent être détruits dans des environnements à haute pression.
    4. Après le temps écoulé, remplissez une nouvelle seringue avec la dilution d'anticorps et d'ajouter au flacon approprié. Agiter doucement. Laissez le mélange (maintenant 2 ml) reposer pendant 10 min. Garder sur la glace. En supposant que la conjugaison complète de la surface, le nombre moyen de ligand lié pour les microbulles est d'environ 18 ligands 7600 / um 2.
  2. Reconstitution des flacons non ciblées
    1. Remplir la seringue avec 1 ml de solution saline, en supprimant toutes les bulles d'air. Fixation de l'aiguille 21 G, injectez lentement la solution dans le flacon de microbulles.
    2. Retirer lentement le piston, retirer 1 ml d'air, et de retirer l'aiguille. Agiter doucement. Laisser reposer 5 min. Ajouter un supplément de 1 ml de solution saline, comme décrit ci-dessus. Agiter doucement et laisser reposer 10 min sur la glace.
  3. Coulter comptage
    1. Agiter doucement le flacon de microbulles souhaitée et d'en tirer ~50 ul de la solution dans une seringue de 1 ml à l'aide de l'aiguille 21 G. Injecter les microbulles dans un 2 ml microtube vide.
    2. Introduire à la pipette un échantillon de 10 ul de la solution de microbulles de stock en 10 ml de diluant.
    3. Après mélange doux, d'évaluer la concentration et la taille des distributions de la population de microbulles en utilisant soc comptage (voir la liste des matériaux). Compter un minimum de trois mesures de 50 ul (par flacon d'échantillon) à l'aide d'une ouverture 30 um.
  4. Microbulles Préparation pour injection
    REMARQUE: L'assistant effectue cette étape lorsque 'injection de microbulles dans des embryons' (étape 6) est introduite. Chaque embryon est injecté une fois, avec le type de microbulles choisi pour chaque injection afin d'être sélectionné au hasard par l'assistant de telle sorte que tous les types de microbulles sont uniformément répartis dans la procédure, mais donnés dans un ordre aléatoire. Se assurer que le chirurgien est aveugle au type de bulle étant injecté.
    1. Déterminer ee volume de la solution stock bulle nécessaire pour produire une concentration finale de 1 x 10 8 Mo / ml dans un volume de 400 pi (calculer le volume en utilisant les concentrations mesurées dans des actions 5.3.3). Aliquoter le volume correspondant de solution saline dans un tube à centrifuger vide.
    2. Agiter doucement le flacon microbulles sélectionnée et attirera un volume excédentaire (~ 50 pi supérieure à celle calculée ci-dessus) de la solution dans une seringue de 1 ml en utilisant l'aiguille 21 G. Injecter les microbulles dans un tube à centrifuger vide.
    3. Pipeter le volume nécessaire de solution stock microbulles et ajouter à l'aliquote de solution saline. Mélanger en remuant délicatement avec la pointe de la pipette.
    4. Aspirer la solution de microbulles dilué dans une seringue propre en utilisant l'aiguille 21 G. Retrait de l'aiguille, éliminer les bulles d'air de la seringue et fixer le luer et de tubes. Poussez lentement la solution à la fin de la fabrication de tubes sûr de ne pas générer les bulles d'air.
    5. Insérez le Syringe dans une pompe à perfusion à seringue fixé pour distribuer les microbulles à un débit de 20 ul / min pour un volume total de 20 ul. Attacher une aiguille de verre tiré à l'extrémité de la tubulure. Déplacer la pompe près de l'étape d'injection.

6. injection de microbulles dans des embryons

  1. Choisissez au hasard et retirer (avec une cuillère perforée) un embryon de l'antenne des médias réfrigérés. Placez dans un plat de dissection situé sur la scène de l'échographie dans le stéréoscope et enlever la vésicule ombilicale et des membranes amniotiques avec les fines pinces, coupe / déchirure du côté qui apparaît moins vascularisée (le côté antimesometrial). Ceci est plus facilement obtenu en perçant une zone adjacente à la zone de tête.
    1. Couper suffisant pour enlever l'embryon de l'intérieur, mais pas plus. Stabiliser les plats de dissection à l'aide de petits morceaux de pâte à modeler.
  2. Manœuvrer délicatement le sac de partout dans l'embryon. Positionner l'embryon de son côté, avec le placenta etvaisseaux ombilicaux devant. En utilisant les broches insectes, cerner la vésicule ombilicale (4 broches recommandé) et les bords du placenta nécessaire d'apposer en place. Évitez les gros vaisseaux.
  3. Laver l'embryon pré-chauffé à 45 ° C jusqu'à ce que l'embryon PBS ravive. Identifier la veine ombilicale et son réseau vasculaire associée. Placez le plat de sorte que l'injection peut être effectuée confortablement.
    NOTE: Une fois réchauffé, du sang dans l'embryon commencera à couler, le pompage visiblement dans l'artère ombilicale. Lorsque le flux commence d'abord, les veines sera un rouge vif, avec le sang dans les vaisseaux apparaissant rapidement identiques. Les branches provenant de la veine ombilicale recouvrent généralement ceux de l'artère ombilicale à la surface placentaire.
  4. Une fois que l'embryon a relancé, couvrir (mais pas le placenta) avec du gel US préchauffé, en étant sûr de retirer délicatement les bulles d'air (en utilisant les pince fine) de partout dans l'embryon. Compléter le plat préalablement chauffé PBS.
    NOTE: Gardez un œil sur le niveau de solutidans les seringues PBS et de gel et ajouter seringues de sauvegarde dans le bécher de chauffage au besoin.
  5. Montez l'aiguille de verre sur une grosse boule de pâte à modeler sur le bord du plat de dissection et insérer l'extrémité de l'aiguille dans le PBS. Choisir une veine sur la surface du disque chorionique placentaire, aussi loin de la branche principale raisonnable, couper la pointe à la taille avec des ciseaux. Injection est plus facile si la pointe est coupée à un léger angle. Supprimer tous les bords dentelés du verre en utilisant le bord des ciseaux à ressort.
  6. Utilisation de la pompe seringue, injecter lentement la solution de microbulles à 20 pl / min dans l'aiguille de verre jusqu'à ce que tout l'air est expulsé de la pointe de l'aiguille et de microbulles peut être vu de circuler librement dans le PBS. Arrêtez la pompe et pour réinitialiser un volume d'injection de 20 pi. Ne pas permettre à l'air d'entrer dans le système vasculaire de l'embryon au cours de l'injection.
  7. Insérez la pointe de l'aiguille de verre doucement dans l'une des veines dans le placenta et se assurer qu'il est immobile. Balancer loin le stèretête de oscope et la position du transducteur ci-dessus l'embryon. Initier imagerie.

7. Ultrason Molecular Imaging

NOTE: En utilisant les conditions d'imagerie non linéaires de contraste précédemment définies, positionner le transducteur de façon que l'embryon se trouve également entre les foyers à 6 et 10 mm. Une fois positionné, commencer l'injection en bolus de microbulles. Lorsque l'injection est terminée, démarrer la minuterie.

  1. Imagerie de perfusion
    1. Assurez-vous que le nombre maximum d'images pour le mode de contraste non linéaire est sélectionnée en appuyant sur ​​le bouton 'de gestion d'étude »et en cliquant sur ​​l'onglet" Préférences "en haut du navigateur de l'étude. Cochez la case appropriée dans la fenêtre «Préférences».
    2. Réglez les paramètres d'imagerie en lançant imagerie non linéaire. Appuyez sur le bouton 'mode de contraste »sur le panneau de commande. Affiner le gain 2D en ajustant le «gain & #8217; composer à 30 dB, réduire la puissance à 4% en utilisant le «pouvoir» cadran, diminuer la fréquence de 1 Hz en utilisant la «fréquence» cadran et réglez la largeur du faisceau (au coin en bas à gauche) à l'échelle à l'aide du rouleau à billes / souris.
      NOTE: Toutes les commandes sont situées sur le panneau du système à ultrasons de contrôle.
    3. Capturer l'ensemble de lavage et à la dissipation de la microbulle bolus par l'enregistrement d'une boucle ciné 20 min à un débit de 1 Hz de trame. Appuyez sur SCAN / gel pour démarrer l'acquisition de données.
    4. Une fois la séquence complète des images a été capturé, appuyez sur le bouton «magasin ciné» situé sur le panneau de commande pour enregistrer la séquence d'images dans la mémoire tampon du système. Le système crée un ciné boucle horodaté des données du modèle de contraste non linéaires acquises.
  2. Ciblée microbulles Imaging
    1. Sous «Préférences», régler le temps de rafale à 0,1 sec. Définissez les paramètres d'imagerie appropriés en utilisant les contrôles described ci-dessus (7.1.2.).
    2. Initier imagerie de contraste non linéaire en appuyant sur ​​le bouton «mode de contraste» sur le panneau de commande. Se assurer que l'embryon est correctement situé sous le transducteur, et que le débit de l'agent de contraste à microbulles par l'embryon est visible dans l'image en mode non linéaire de contraste.
    3. Pour évaluer la liaison au cours d'études d'imagerie moléculaire embryonnaires microbulles ciblées, de permettre aux microbulles de circuler au repos pendant 3 min et 40 s après l'achèvement de l'injection. Cette fois est de permettre la rétention des microbulles circulent. De scan / le gel 'Appuyez sur pour arrêter l'imagerie pendant ce temps.
    4. À 3 min et 40 sec, l'imagerie de CV pour confirmer que l'embryon est encore visible, est suffisamment couvert avec du PBS, et que les bulles continuent à circuler. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'imagerie.
    5. Acquérir la séquence perturbations / reconstitution après l'injection 3 min et 50 sec en enregistrant un «pré-destructionséquence de réponse acoustique tion 'à 29 Hz. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'acquisition de données. Après l'injection de 4 min 18,19, lancer un 0,1 sec à haute fréquence acoustique rafale. Appuyez sur le bouton «éclater» à mettre en œuvre une rafale.
    6. Continuer à enregistrer des cadres pour le reste de la séquence (jusqu'à ce que la ligne de mémoire tampon est pleine) et sauver la boucle ciné en appuyant sur «magasin ciné».
    7. Recueillir une boucle ciné supplémentaire de microbulles circulation. Cette séquence d'imagerie ultérieure «post-destruction» est supposé contenir ne circulant signaux de bulles qui ont reconstitué les faisceau. De scan / le gel 'Appuyez sur pour lancer l'imagerie et «magasin ciné» afin de recueillir les images.
    8. Étiqueter les boucles de ciné après imagerie chaque embryon. De la gestion de l'étude 'Appuyez sur, sélectionnez le fichier en utilisant la bille et le bouton, appuyez sur «label d'image" et le nom "select" appropriée.

8. Manipulation des embryons après l'injection

  1. Imagerie Post, déplacer le transducteur, dégoupiller l'embryon et l'euthanasie (via la décapitation, la dislocation cervicale, dioxyde de carbone asphyxie, ou une anesthésie suivie par le gel ou la fixation rapide) comme vous le souhaitez.
  2. Pour chaque injection ultérieure de l'embryon un segment plat frais de dissection, aiguille, la seringue et le tube doit être utilisé, avec la préparation de la prochaine fournée de l'injection de microbulles prise de solution lieu lors de la dissection et de renouveau.
  3. Enregistrer des échantillons de tissus (par exemple, la queue, le cerveau) pour des analyses supplémentaires (par exemple, le génotypage déterminée par analyse PCR de l'ADN isolé de queue, lacz coloration, ou des mesures semi-quantitatives d'expression de biomarqueurs en utilisant des empreintes occidentaux 21).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L'injection d'agents de contraste ultrasonore dans ex utero des embryons de souris dépend de l'isolement réussi de vie, les embryons au stade gestationnel tardif de l'utérus et le maintien de la viabilité au cours de l'injection et l'imagerie par ultrasons associée. Une fois que l'embryon a été extériorisé et positionné, comme le montre la figure 1, l'injection soigneuse de l'agent de contraste dans le système vasculaire embryonnaire est possible. Une image u...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ultrasons agents de contraste ont été injectés dans des embryons de souris gestation stade avancé et des images de contraste non linéaires ont été acquis pour mesurer les paramètres de perfusion et de microbulles ciblées contraignant. Imagerie réussie des microbulles à l'intérieur du système vasculaire embryonnaire était dépendant d'un certain nombre de facteurs, le premier étant embryon viabilité. Tous les équipements et appareils ont été préparées à l'avance afin de minimiser le temps nécessaire pour l'...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

F.S. Foster reconnaît son rôle de consultant chez VisualSonics Inc.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme Terry Fox de l’Institut national du cancer du Canada.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

anticorps
Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactifs<
  • rat IgG2 contrôle
eBioscience13-4321-85Cette combinaison anticorps/microbulle est souvent nécessaire comme contrôle expérimental  ;
  • biotine anti-souris CD309
eBioscience13-5821-85
Anticorps de rat biotinylé MJ 7/18 contre l’endogline de sourisHybridomeanticorps extérieurs peuvent également être appropriés : nous avons utilisé eBioscience (13-1051-85 ) dans le passé
Eau
Milieu embryonnaire
  • 500 ml Dulbecco' s Aigle modifié' s Moyen avec une glycémie élevée
SigmaD5796
  • 50 ml Sérum de veau fœtal
ATCC30-2020lot # 7592456
  • Hepes
Gibco156305 ml, 1 M
  • Pénicilline-streptomycine
Gibco15140-1225 ml, 10 000 unités Pen., 10 000 μ ; g Éthanol streptococcique
, 70 %
de paraformaldéhydede
solution saline tamponnée au phosphate [1x]  ;SigmaD85371x, sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium
Souris enceinte, CD-1Charles River Laboratories Inc.  ;
Chlorure de sodium à 0,9 % (solution saline)Hospira0409-7984-11
Agent de contraste à ultrasons, prêt à cibler et non cibléMicromarqueur ; VisualSonics Inc.
Gel à ultrasons (Aquasonic 100, incolore)CSP Medical133-1009
Equipment
Plaques de culture cellulaire (4) :  ; 100  ; x  ; 20  ; mmFisher Scientific08-772-22
Plaques de culture cellulaire (12) : 60  ; x  ; 15  ; mmSigmaD8054
CentrifugeuseSorvall Legend RT centrifugeuse  ;
Tubes coniques, 50 ml BD FalconVWR21008-938
DiluantBeckman CoulterIsoton II, 8448011
Ciseaux de dissection (Wagner)Outils de sciencefine Wagner 14068-12
Pince (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)Outils de science fine11200-33
Pince à éclatsVWR25601-134
Bécher en verre, 2 L (Griffin Beaker)VWR89000-216
Capillaires en verre, 1 x 90  ; mm GD-1 avec filamentNarishigeGD-1
Extracteur d’aiguille en verreNarishigePN-30
GantsAnsell4002
Sonde d’anatomie généraleOutils de sciences fines10088-15
Plaque chauffanteVWR89090-994
Seau à glaceCole ParmerRK 06274-01
Imagerie PlateformeVisualSonics Inc.de rail intégré
Source lumineuse, fibre optiqueFisher Scientific12-562-36Idéalement a des bras réglables
Luers (12), polypropylène barbelé femelle ¼ ;-28 Filetage UNFCole Parmer45500-30
Micro-système d’échographie, haute fréquenceVisualSonics Inc.Vevo2100
Aiguilles, calibre 21 (1 po)VWR305165
Analyseur de taille de particulesBeckman CoulterMultisizer 3 Coulter Counter Cuillère
perforée (Moria)Fine Science ToolsMC 17 10373-17
Broches (6), anodisé noir minutien 0,15 mmFine Science Tools26002-15
Pipettors [2-20 μ ; l, 20-200 μ ; l, 100-1 000 μ ; l]EppendorfResearch Plus  ; 3120000038 réglable ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 3120000054;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Pointes de pipette [2-200  ; μ ; l, 50-1 000  ; μ ; l]EppendorfepT.I.P.S.  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 22491334;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Ciseaux
Sylgard 184 Kit d’élastomère de siliconeDow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32 » x 3/32 »VWR63010-007
Bâtonnet applicateur en bois (écouvillon, tête de coton)VWRCA89031-270
Microscope chirurgical Grossissement 5-8XScientificSteromaster
, 1 ml NormjectFisher14-817-25
Seringues (10), 30 mlVWRCA64000-041
Pompe à perfusion pour seringues  ;Bio-lynx  ;Thermomètre NE-1000
, -20-110  ; ° ; CVWR89095-598
MinuterieVWR33501-418
Tubes, EppendorfVWR20170-577
Racks de tubes (3)VWR82024-462
Sonducteur à ultrasons, 20 MHzVisualSonics Inc.MS250
Vannas-Tübingen,coudé Fine Science Tools15005-08
td colspan="4"> (biotinylé, eBioscience) — ; Le choix de l’anticorps dépend de l’expérience interne Les distillée glace Sigma 76240 4 % de Système 3120000062022491351 Fisher Seringues

Références

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65(2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581(2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162(2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097(2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Imagerie de contraste par ultrasonsvascularisation de l'embryon de sourisinjection de microbullesparamètres de perfusionliaison de microbulles cibléesmodèle murin d'endoglineréseau vasculaire placentaireultrasons de contraste non linéairestechnique de manipulation d'embryons
Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.