Ici, nous présentons un protocole d'injecter des agents de contraste ultrasonores de microbulles dans la vie, isolés en fin de gestation embryons murins de la scène. Cette méthode permet l'étude des paramètres de perfusion et de marqueurs moléculaires vasculaires au sein de l'embryon en utilisant à haute fréquence échographie de contraste amélioré.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Imagerie de contraste dans les embryons de souris utilisant à haute fréquence à ultrasons
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’imagerie par ultrasons peut transmettre des informations quantitatives essentielles concernant la vascularisation et la perfusion tissulaires et, dans des applications ciblées, faciliter la détection et la mesure de biomarqueurs vasculaires au niveau moléculaire. Dans l’embryon de souris, cette technique non invasive peut être utilisée pour découvrir les mécanismes de base sous-jacents au développement vasculaire dans le système circulatoire précoce de la souris et dans des modèles génétiques de maladies cardiovasculaires. L’embryon de souris se présente également comme un excellent modèle pour étudier l’adhésion des microbulles à des cibles angiogéniques (y compris le récepteur 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR2) ou αv β3) et pour évaluer la nature quantitative de l’échographie moléculaire. Nous avons donc développé une méthode pour introduire des agents de contraste à ultrasons dans le système vasculaire d’embryons vivants et isolés. Cela permet une liberté en termes de contrôle et de positionnement de l’injection, de reproductibilité du plan d’imagerie sans obstruction ni mouvement, et une analyse et une quantification simplifiées de l’image. À la fin de la gestation (jour embryonnaire (E)16.6 et E17.5), des embryons murins ont été isolés de l’utérus, doucement extériorisés du sac vitellin et des agents de contraste à microbulles ont été injectés dans les veines accessibles à la surface chorionique du disque placentaire. L’imagerie par ultrasons de contraste non linéaire a ensuite été utilisée pour recueillir un certain nombre de paramètres de perfusion de base (augmentation du pic, taux de lavage et temps jusqu’au pic) et quantifier la liaison ciblée des microbulles dans un modèle murin d’endogline. Nous montrons la circulation réussie des microbulles dans les embryons vivants et l’utilité de cette approche dans la caractérisation du système vasculaire embryonnaire et du comportement des microbulles.
Introduction
échographie de rehaussement du contraste permet l'utilisation d'agents de contraste à microbulles de visualiser et caractériser l'environnement vasculaire. Ces agents permettent l'évaluation non invasive de la microcirculation, la vascularisation et la fonction cardiovasculaire. En outre, la modification de la surface de la bulle peut conduire à la liaison à microbulles ciblée biomarqueurs endotheliales, comme démontré dans des applications précliniques de l'angiogenèse, l'athérosclérose et l'inflammation faisant 1,2 imagerie par ultrasons moléculaire des événements vasculaires possibles. Échographie de contraste amélioré peut d....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
REMARQUE: Les procédures expérimentales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité de soins des animaux au Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada). Procédures pour le traitement sans cruauté des animaux doivent être respectées en tout temps. Il est supposé que l'enquêteur est formé dans le fonctionnement de base d'un système d'imagerie par ultrasons. Ce protocole fonctionne mieux avec deux personnes.
1. Modèles animaux
- Compagnon CD-1 mâle et femelle Mus musculus d'obtenir des embryons de type sauvage pour les études de perfusion.
- Pour les études d'imageri....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
L'injection d'agents de contraste ultrasonore dans ex utero des embryons de souris dépend de l'isolement réussi de vie, les embryons au stade gestationnel tardif de l'utérus et le maintien de la viabilité au cours de l'injection et l'imagerie par ultrasons associée. Une fois que l'embryon a été extériorisé et positionné, comme le montre la figure 1, l'injection soigneuse de l'agent de contraste dans le système vasculaire embryonnaire est possible. Une image u.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Ultrasons agents de contraste ont été injectés dans des embryons de souris gestation stade avancé et des images de contraste non linéaires ont été acquis pour mesurer les paramètres de perfusion et de microbulles ciblées contraignant. Imagerie réussie des microbulles à l'intérieur du système vasculaire embryonnaire était dépendant d'un certain nombre de facteurs, le premier étant embryon viabilité. Tous les équipements et appareils ont été préparées à l'avance afin de minimiser le temps nécessaire pour l'.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
F.S. Foster reconnaît son rôle de consultant chez VisualSonics Inc.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Programme Terry Fox de l’Institut national du cancer du Canada.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
anticorps
td colspan="4"> (biotinylé, eBioscience) — ; Le choix de l’anticorps dépend de l’expérience interne Les distillée glace Sigma 76240 4 % de Système 3120000062022491351 Fisher Seringues
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| réactifs< | |||
| eBioscience | 13-4321-85 | Cette combinaison anticorps/microbulle est souvent nécessaire comme contrôle expérimental ; |
| eBioscience | 13-5821-85 | |
| Anticorps de rat biotinylé MJ 7/18 contre l’endogline de souris | Hybridome | anticorps extérieurs peuvent également être appropriés : nous avons utilisé eBioscience (13-1051-85 ) dans le passé | |
| Eau | |||
| Milieu embryonnaire | |||
| Sigma | D5796 | |
| ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
| Gibco | 15630 | 5 ml, 1 M |
| Gibco | 15140-122 | 5 ml, 10 000 unités Pen., 10 000 μ ; g Éthanol streptococcique |
| , 70 % | |||
| de paraformaldéhyde | de | ||
| solution saline tamponnée au phosphate [1x] ; | Sigma | D8537 | 1x, sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium |
| Souris enceinte, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. ; | ||
| Chlorure de sodium à 0,9 % (solution saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Agent de contraste à ultrasons, prêt à cibler et non ciblé | Micromarqueur ; VisualSonics Inc. | ||
| Gel à ultrasons (Aquasonic 100, incolore) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Plaques de culture cellulaire (4) : ; 100 ; x ; 20 ; mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Plaques de culture cellulaire (12) : 60 ; x ; 15 ; mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifugeuse | Sorvall Legend RT centrifugeuse ; | ||
| Tubes coniques, 50 ml BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluant | Beckman Coulter | Isoton II, 8448011 | |
| Ciseaux de dissection (Wagner) | Outils de science | fine Wagner 14068-12 | |
| Pince (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm) | Outils de science fine | 11200-33 | |
| Pince à éclats | VWR | 25601-134 | |
| Bécher en verre, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Capillaires en verre, 1 x 90 ; mm GD-1 avec filament | Narishige | GD-1 | |
| Extracteur d’aiguille en verre | Narishige | PN-30 | |
| Gants | Ansell | 4002 | |
| Sonde d’anatomie générale | Outils de sciences fines | 10088-15 | |
| Plaque chauffante | VWR | 89090-994 | |
| Seau à glace | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imagerie Plateforme | VisualSonics Inc. | de rail intégré | |
| Source lumineuse, fibre optique | Fisher Scientific | 12-562-36 | Idéalement a des bras réglables |
| Luers (12), polypropylène barbelé femelle ¼ ;-28 Filetage UNF | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Micro-système d’échographie, haute fréquence | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Aiguilles, calibre 21 (1 po) | VWR | 305165 | |
| Analyseur de taille de particules | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter Cuillère | |
| perforée (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Broches (6), anodisé noir minutien 0,15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 μ ; l, 20-200 μ ; l, 100-1 000 μ ; l] | Eppendorf | Research Plus ; 3120000038 réglable ; ; ; ; ; ; ; 3120000054; ; ; ; ; ; ; | |
| Pointes de pipette [2-200 ; μ ; l, 50-1 000 ; μ ; l] | Eppendorf | epT.I.P.S. ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; 22491334; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; | |
| Ciseaux | |||
| Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone | Dow Corning | ||
| Tubing, Tygon laboratory 1/32 » x 3/32 » | VWR | 63010-007 | |
| Bâtonnet applicateur en bois (écouvillon, tête de coton) | VWR | CA89031-270 | |
| Microscope chirurgical Grossissement 5-8X | Scientific | Steromaster | |
| , 1 ml Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Seringues (10), 30 ml | VWR | CA64000-041 | |
| Pompe à perfusion pour seringues ; | Bio-lynx ; | Thermomètre NE-1000 | |
| , -20-110 ; ° ; C | VWR | 89095-598 | |
| Minuterie | VWR | 33501-418 | |
| Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Racks de tubes (3) | VWR | 82024-462 | |
| Sonducteur à ultrasons, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tübingen, | coudé Fine Science Tools | 15005-08 | |
Références
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
