Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Résumé

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Résumé

Les structures de la crypte intestinale, appelées organoïdes, peuvent être maintenues en culture soutenue en trois dimensions lorsqu’elles sont complétées par les facteurs de croissance appropriés. Étant donné que les organoïdes sont très similaires au tissu d’origine en termes de différenciation des cellules souches homéostatiques, de polarité cellulaire et de présence de tous les types de cellules différenciées en phase terminale connus de l’épithélium intestinal adulte, ils constituent une ressource essentielle dans la recherche expérimentale sur l’épithélium. La possibilité d’exprimer des transgènes ou des ARN interférents à l’aide de vecteurs lentiviraux ou rétroviraux dans des organoïdes a augmenté les possibilités d’analyse fonctionnelle de l’épithélium intestinal et des cellules souches intestinales, surpassant les souris transgéniques traditionnelles en termes de vitesse et de coût. Dans le protocole vidéo actuel, nous montrons comment utiliser la transduction d’organoïdes de l’intestin grêle avec des vecteurs lentiviraux illustrés par l’utilisation de transgènes inductibles à la doxycyline, ou d’ARN en épingle à cheveux court inductible par IPTG pour la surexpression ou l’inactivation de gènes. De plus, considérant que la culture d’organoïdes donne un nombre infime de cellules qui peut même être réduit par un traitement expérimental, nous expliquons comment traiter les organoïdes pour l’analyse en aval visant la RT-PCR quantitative, les microréseaux d’ARN et l’immunohistochimie. Les techniques qui permettent l’expression de transgènes et l’inactivation de gènes dans les organoïdes intestinaux contribuent au potentiel de recherche de ces structures épithéliales intestinales, établissant la culture d’organoïdes comme une nouvelle norme dans la culture cellulaire.

Introduction

L'épithélium intestinal est l'un des tissus les plus proliférant rapidement corporels, qui a causé d'attirer un grand intérêt de la recherche sur les cellules cancéreuses et souches. En 2009, une technique a été publié pour générer cultures durables de petites cryptes intestinales dans matrigel, conserver une structure en 3 dimensions ^1. Ces structures, appelées organites intestinaux, peuvent être cultivées en utilisant des techniques standard, avec entourant milieu supplémenté avec un certain nombre de facteurs de croissance définis, y compris la BMP-signalisation inhibiteur de la voie noggine (cheville en bois), la voie Wnt-signalisation acti....

Protocole

1. Préparation de Polyéthylènimine (PEI) comme réactif de transfection

1. Dissoudre environ 150 mg de PEI dans 100 ml d'H ₂ O.
2. Réglez solution à pH 7,4 par addition de HCl jusqu'au solution devient limpide et remuer jusqu'à dissolution complète. Cela peut prendre entre 10 et 60 min et ajouter de l'eau à une concentration de 1 mg / ml final.
3. Lorsque claire, filtrer la solution à travers le filtre PEI 0,22 um stérile et stocker dans un congélateur à -80 ° C en aliquots de 5 ml.

2. Production de Particules Lentivirales

Jour 1:

1. Des cellules HE....

Résultats

Transduction lentiviral Organoid

La technique de transduction organoïde utilisant des particules lentiviraux dépend de manipulation correcte des organites avant et pendant la transduction. Organites (figure 3A) ont été cultivées et ils ont été perturbés dans cryptes simples (figure 3B). Comme indiqué précédemment, ces cryptes simples, lorsqu'elles sont cultivées en présence de l'inhibiteur de GSK3 Chir99021 cryptes sont devenues cystiques ⁹

Discussion

Le protocole vidéo actuel décrit transduction lentiviral des organites de l'épithélium intestinal primaire et l'analyse en aval de ces organites en utilisant des techniques d'ARN quantitatifs et immunohistochimie.

Transduction lentivirale est souvent réalisée dans des cellules adhérentes ou flottantes dans des plaques de culture. Étant donné que la structure tridimensionnelle des organites les rend difficiles à pénétrer par des particules virales, un certain nombre de méthodes po.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polyéthylène imine	Polysciences	23966-2
DMEM moyen	Lonza	BE12-614F
Sérum de veau fœtal	Lonza	DE14-801F
Pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acétyl cystéine	Sigma	A9165-1G
souris Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632  ;	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsine	Lonza	BE02-007E
puromycine	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β ;-mercaptoéthanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldéhyde	Sigma	252549-1L
flacon en verre conique 12  ; mm x 75  ; mm 5  ; ml	VWR	LSUKM12
Éosine Jaunâtre	VWR	1 159 350 025