Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4 ⁺ CD45RB ^Haute T cellules dans des souris immunodéficientes

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse résultent d’une interaction complexe et incomplètement définie entre les réponses immunitaires de l’hôte, la susceptibilité génétique, les facteurs environnementaux et le contenu luminal entérique¹. De récentes études d’association à l’échelle du génome font état d’associations entre les gènes régulateurs des cellules immunitaires et la susceptibilité aux MII^2,3. Les gènes intrinsèques des cellules immunitaires innées et adaptatives sont représentés dans ces études, ce qui indique un rôle central pour ces populations cellulaires dans la pathogenèse des MICI.

Il existe actuellement plus de 50 modèles animaux de MICI humaines. Bien qu’aucun modèle ne phénocopie parfaitement les MICI humaines, beaucoup sont utiles pour étudier divers aspects des maladies humaines, y compris l’apparition et la progression de la maladie et la réponse à la cicatrisation des plaies. Dans la méthode décrite ici, l’inflammation intestinale est initiée par un transfert adoptif syngénique de lymphocytes T^{spléniques élevés} CD4⁺CD45RB dans des souris receveuses déficientes en lymphocytes T et B⁴. La population de lymphocytes T^CD4+CD45RB élevée contient principalement des lymphocytes T naïfs prêts à l’activation qui sont capables d’induire une inflammation chronique de l’intestin grêle et du côlon. Cette méthode permet au chercheur de modifier des variables expérimentales clés, y compris les populations de cellules immunitaires innées et adaptatives, afin de répondre à des questions biologiquement pertinentes relatives à la pathogenèse de la maladie. De plus, cette méthode permet d’amorcer précisément l’apparition de la maladie et d’obtenir une évolution temporelle expérimentale bien caractérisée. Cela permet l’étude cinétique des caractéristiques cliniques de la progression de la maladie chez la souris. L’inflammation intestinale induite par cette méthode partage de nombreuses caractéristiques avec les MICI humaines, notamment l’inflammation transmurale chronique du gros et de l’intestin grêle, la pathogenèse induite par des cytokines telles que le TNF et l’IL-12, et des symptômes systémiques tels que l’émaciation⁵. Il s’agit donc d’un système modèle idéal pour étudier la pathogenèse des MICI humaines.

La méthode décrit en détail le protocole d’induction de la colite expérimentale par transfert adoptif de lymphocytes T^CD4+CD45RB élevés chez des souris Rag1^-/-. Nous abordons les étapes techniques clés, les résultats attendus, l’optimisation et le dépannage. Nous abordons les éléments nécessaires au développement réussi de ce modèle murin d’inflammation intestinale à des fins de recherche.

REMARQUE: Assurez-vous que tous les protocoles d'animaux sont approuvés par et en conformité avec institutionnel de protection des animaux et l'utilisation du Comité (IACUC) règlements et le Guide du Conseil national de recherches pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les souris donneuses peuvent être soit mâle ou femelle, mais les souris receveuses doivent être de sexe masculin. Si les bénéficiaires de sexe féminin doivent être utilisés, les souris les donateurs doivent être des femmes ^5. Maintenir colonies utilisant régulière, literie non stérile et l'eau non acidifié, car ils peuvent affecter la microflore intestinale, et, par conséquent, le phénotype de la colite de la souris ^5,6.

1. Préparation expérimentale

1. Utiliser les médias et les tampons glacées. Gardez cellules sur la glace pendant toute l'expérience.
2. Réaliser l'expérience dans le capot de risque biologique stérile en utilisant une technique stérile.

2. Isolement des cellules T spléniques

1. Euthanasier souris donneuse / souris de CO ₂ chambre suivies par dislocatio col de l'utérusn. Pulvériser abdomen avec 70% d'éthanol.
2. Faire une incision horizontale dans l'abdomen et décoller la peau pour exposer péritoine. Tenez péritoine loin des organes internes avec la pince et faire une incision dans le péritoine abdominal gauche pour exposer et exciser la rate.
3. Placez la rate dans 10 ml de médias complète dans une boîte de Petri. Retirez et jetez l'excès de tissu de la rate.
4. Utilisez deux lames de verre stérilisés pour écraser et de démêler la rate en suspension à cellule unique. suspension de cellules de filtre à travers un tamis de 70 um dans un tube conique de 50 ml et rincer filtre avec 5 ml de milieu complet. Placez jusqu'à 5 rates dans un tube conique de 50 ml.
5. Centrifuger les cellules à 450 g pendant 7 min. Rejeter le surnageant en versant à pied ou par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets.
6. Resuspendre doucement les cellules dans 5 ml par rate de tampon de lyse pour lyser les globules rouges pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter un volume égal de milieu complet (5 ml par rate) au tube.
8. Resuspendre doucement les cellules dans 10 ml de Labeling Buffer.
9. Compter les cellules par exclusion au bleu trypan.
   1. Retirer 20 ul de suspension cellulaire et ajouter 180 ul bleu trypan à un tube de centrifugeuse et bien mélanger. Après 5 min, ajouter 10 ul cellules hémocytomètre et compter les cellules non-bleu sous le microscope étiquetés. Déterminer le nombre total de cellules viables. Jeter cellules / trypan bleu mix.
10. Centrifuger les cellules dans 10 ml de Labeling Buffer à 450 g pendant 7 min. Rejeter le surnageant en versant à pied ou par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets.

3. Enrichissement de cellules T CD4 ⁺

REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour des produits spécifiques utilisés dans cette section.

1. Resuspendre doucement les cellules à une suspension à cellule unique de 20 x 10 ⁶ cellules / ml dans du froid ÉtiquetteBuffer ing.
2. Ajouter 5 ul par 1 x 10 ⁶ cellules d'anticorps d'enrichissement de cellules T CD4 biotinylé. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min.
3. Ajouter 10x volume de Labeling Buffer. Centrifuger les cellules à 450 g pendant 7 min. Aspirer soigneusement tout le surnageant par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets.
4. Bien agiter au vortex particules magnétiques de streptavidine conjugué. Ajouter 5 ul de particules par 1 x 10 ⁶ cellules.
5. Mélanger soigneusement mais doucement. Gardez mélange à 6-12 ° C pendant 30 min.
6. Ajouter étiquetage tampon à une concentration de 20 à 80 x 10 ⁶ cellules / ml. Transfert jusqu'à 1,0 ml des cellules marquées par 12 x 75 mm tube à essai à fond rond (dénommé "tube-positif fraction»).
7. Placez chaque tube positif fraction sur l'aimant pour les 6-8 min.
8. Avec les tubes positif fraction encore sur l'aimant, transférer soigneusement surnageant à partir du tube positif fraction avec pipette Pasteur en verre à une nouvelle stériles 50 ml tube conique (referred pour que la "fraction enrichie»). Cette fraction enrichie contient des cellules T CD4 ^+. Veillez à ne pas perturber les cellules marquées attirés par l'aimant.
9. Resuspendre les cellules laissées dans les tubes positif fraction dans le même volume de Labeling Buffer comme dans l'étape 3.6 par aspiration et vigoureusement vers le bas. Placez le tube positif fraction de retour sur aimant pour les 6-8 min.
10. Avec tubes positif fraction encore sur l'aimant, transférer soigneusement surnageant (fraction enrichie, CD4 ⁺⁾ du tube positif fraction de verre Pasteur pipette pour stérile de 50 ml tube conique de l'étape 3.8 sans perturber les cellules attachées à l'aimant.
11. Répéter les étapes 3.9 à 3.10 pour augmenter le rendement en cellules T CD4 ⁺ obtenues. Continuer protocole utilisant fraction enrichie (CD4 ⁺ cellules).

4. L'étiquetage et le tri des cellules ⁷

1. Centrifugeuse enrichi cellules à 450 g pendant 7 min. Rejeter le surnageant en versant hors tension ou sous vide SUCTions dans un conteneur à déchets.
2. Resuspendre les cellules dans 1 ml de Labeling Buffer. Retirer aliquote de cellules pour compter et pour évaluer la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan comme à l'étape 2.9.
3. Ajouter un volume de Labeling Buffer à 10 x 10 ⁶ cellules / ml; si les cellules sont déjà <10 x 10 ^6, centrifuger à 450 g pendant 7 min, éliminer le surnageant en versant off ou d'aspiration sous vide dans un conteneur à déchets, et d'ajouter volume de Labeling Buffer à 10 x 10 ⁶ cellules / ml.
   1. Mettre en place des portions séparées d'environ 5 à 10 x 10 ⁵ cellules chacune des cellules de contrôle non colorées, isotype teinté et simples teinté dans des microtubes.
4. Ajouter 5 ug / ml de CD4-FITC et 1 ug / ml de CD45RB-PE aux cellules. Ajouter taches de contrôle isotypique et les taches simples à la même concentration se approprier aliquotes dans des microtubes. Mélangez bien mais doucement et incuber sur de la glace abri de la lumière pendant 30 min.
5. Ajouter 10x volume de Labeling Buffer aux cellules et le contrôles. Centrifugeuse 450 xg pendant 7 min. Rejeter le surnageant par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets.
6. Remettre en suspension dans Labeling Buffer au volume à l'étape 4.5. Centrifugeuse 450 xg pendant 7 min. Rejeter le surnageant par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets.
7. Remettre en suspension dans Labeling Buffer à 10 x 10 ⁶ cellules / ml. Passez cellules à 70 um passoire dans FACS tube. Garder sur la glace abri de la lumière jusqu'au moment de FACS.
8. Mettre en place et déterminer la rémunération appropriée sur le trieur de cellules avec des cellules non colorées et des contrôles simples teinté.
9. Exclure les cellules non viables avec déclenchement prospectifs et dispersion latérale (figure 1A). Mettre en place gating pour CD4 ⁺ et ⁺ CD45RB cellules avec contrôles isotypiques teinté. Cellules porte sur la population CD4 ^+.
10. Trier cellules CD4 ⁺ dans CD45RB ^élevé et CD45RB ^faibles populations en utilisant un histogramme simple pour les cellules de PE teinté dans des tubes avec 2 ml de milieu complet. Le CD45RB ^haute + CD45RB ⁺ cellules (CD45RB ^haute), et de la ^{faible densité de} population est la plus faible CD45RB 20% des cellules CD4 ⁺ CD45RB ⁺ (CD45RB ^bas, figure 1B).

Figure 1: flux Représentant cytométrie parcelles de populations de cellules CD4 ⁺ CD45RB T lors de l'analyse FACS (A - C) FITC CD4 et PE CD45RB-taché splénocytes de donneurs C57BL / 6 ont été triées par FACS en CD4 ⁺ CD45RB ^élevé et CD4 ^+. populations de cellules T CD45RB ^bas. Événements (A) Doublet ont été exclus sur le nuage de points avant. (B) Les lymphocytes ont été bloqués dans le complot de l'avant et la diffusion latérale. (C) CD4 ⁺ (D) CD4 ⁺ CD45RB ⁺ T ont été reportées sur un PE par rapport Events histogramme. Cellules CD4 ⁺ CD45RB ^faibles ont été considérés comme la plus faible de 20% des cellules CD45RB ^+. Cellules CD4 ⁺ CD45RB ^élevés ont été définis comme la plus haute de 40% des cellules CD45RB ^+.

11. Exécuter une aliquote de chaque population de cellules sur la machine FACS pour évaluer la pureté des populations.
12. Centrifugeuse triée cellules à 450 g pendant 7 min. Remettre en suspension dans 1 ml de PBS. Retirer aliquote de cellules pour compter et pour évaluer la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan comme à l'étape 2.9.

5. injection de cellules dans des receveurs

1. Remettre en suspension les cellules triées à 4 x 10 ⁶ cellules / ml (CD45RB ^haut) ou 2 x 10 ⁶ cellules / ml (CD45RB ^bas) dans du PBS.
2. Transférer 100 ul de cellules de ^haute CD45RB par bénéficiaire dans un nouveau tube stérile. Ajouter 100 ul de PBS pardestinataire de ce tube. Ainsi, le volume total d'injection par animal est de 200 pi, et le montant total de cellules par bénéficiaire est de 4 cellules T naïves ^élevés x 10 ⁵ CD4 ⁺ CD45RB.
3. Si groupe expérimental recevant cellules régulatrices T est souhaitée, transférer 100 pi de cellules ^élevées CD45RB par bénéficiaire dans un nouveau tube stérile. Ajouter 100 pi de cellules par CD45RB ^faible destinataire dans le même tube. Volume d'injection total par animal est de 200 pi; rapport de CD45RB ^haute: CD45RB cellules ^faibles est de 2: 1.
4. Injecter 100 ul de CD45RB ^élevé ou CD45RB ^{high / low} CD45RB cellules CD4 ⁺ par voie intrapéritonéale dans le droit et le côté gauche de l'abdomen (total de 200 pi) de chaque destinataire.

6. Suivi de progression de la maladie chez les animaux receveurs

1. Pour évaluer l'état clinique des animaux receveurs, attribuer des notes cliniques globales pour la paramete suivanters ⁸ le jour de l'injection, toutes les semaines par la suite, et au moment du sacrifice:
   1. Déterminer perdre en mesurant la perte de poids: 0 - aucune perte de poids; Perte de poids corporel initial de 0,1 à 10% de - 1; 2 - La perte de plus de 10% du poids corporel initial (figure 2A).

Figure 2: signes pathologiques cliniques et bruts de l'inflammation se produisent après le transfert de cellules de ^haute T CD4 ⁺ CD45RB de type sauvage dans Rag1 ^{- / -} et NRDKO souris receveuses ¹¹ (A) bénéficiaires NRDKO perdu en moyenne 10% de leur poids corporel initial de 5. semaines après le transfert, alors que Rag1- / - Les destinataires ne ont pas présenté de signes cliniques de la maladie à ce moment. Chaque point représente le pourcentage moyen de poids corporel initial pour la cohorte ± SEM. **, P <0,005. (B) Certaines souris ont développé une inflammation intestinale sévère, comme en témoigne la présence d'un prolapsus rectal. Ce est une image représentative de prolapsus rectal chez un receveur souris NRDKO. (C) Grossièrement, deux points à la fois Rag1 ^{- / -} et les souris receveuses NRDKO sont épaissies et raccourci par rapport à deux points de Rag1 ^{- / -} et souris sans NRDKO cellules T transfert adoptif. Colons de souris receveuses NRDKO montrent une inflammation sévère et le poids du côlon augmentation (données non présentées). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. 2. Déterminer la qualité des selles en plaçant l'animal dans un récipient propre jusqu'à ce qu'il ait passéselles: 0 - aucun; 1 - selles molles; 2 - selles liquides et / ou sanglante.
   3. Déterminer la santé générale de l'animal par la présence des signes de maladie suivants: 0 - pas une posture voûtée, poils de fourrure, la peau ou des lésions; 1 - l'un quelconque des présents suivante: posture voûtée, fourrure à poils, ou des lésions de la peau.
   4. Déterminer la présence d'un prolapsus rectal: 0 - absent; 1 - présente (figure 2B).
2. Sacrifier des animaux par inhalation de CO ₂ suivie par dislocation cervicale quand ils ont perdu 20% de leur poids corporel de départ ou au point de temps désiré, selon la première éventualité. Maladie clinique est habituellement apparente à partir de 5 semaines post-réplétion.
3. Évaluer la gravité de la maladie, comme décrit précédemment ^5,7.
   1. Attribuer des notes cliniques que dans l'étape 6.1 ^8.
   2. Mesurer la longueur du côlon et du poids (figure 2C).
   3. Effectuer l'analyse histologique de l'inflammation5.
   4. Déterminer l'expression de cytokine spontanée dans les cultures d'explants intestinaux de tissu ^{9, 10} nœuds lymphatiques mésentériques, et / ou le sérum ^11.
      1. En bref, pour les cultures d'explants ^neuf, retirer deux points après le sacrifice, ouverte longitudinalement, et propre avec du PBS. Incuber deux points sur un agitateur orbital réglé à 250 rpm dans un milieu complet pendant 30 min à température ambiante.
      2. Hacher le tissu en petits morceaux et incubées à 37 ° C dans un milieu complet pendant 24 heures. Recueillir le surnageant et utiliser pour la quantification de cytokines par 100 mg de tissu par ELISA.
   5. Effectuer la caractérisation ex vivo des phénotypes et / ou de la fonction ¹⁰ cellules T.

Environ 10 x 10 6 cellules CD4 + CD45RB de 10 rates de souris donneuses adultes C57BL / 6 de haute T sont fiable isolé. Ce nombre varie en fonction de l'âge et de la souche de la souris entre les donateurs et les compétences du chercheur. Lorsque 4 x 10 5 C57BL / 6 cellules CD4 + CD45RB haute T sont transférés dans C57BL / 6 Rag1 - / - souris receveuses, des signes cliniques de la maladie apparaissent autour de la semaine 5 post-réplétion ou plus tôt si les souris sont génétiquement sensibles à la maladie plus grave ( Figure 2, 3) 11,12. Lymphocytes T CD3 + sont vu accumulent dans deux points de Rag1 - / - bénéficiaires dès 3 semaines (figure 3A) 12.

Figure 3: Transfert de type sauvage CD4 + cellules CD45RB haute T dans Rag1 - / - et les bénéficiaires RKO / δ KD induit une inflammation intestinale chronique 12 (A) (grossissement 10X origine, H & E et CD3 immunohistochimie).. Coloration H & E (panneaux supérieurs) illustre hyperplasie épithéliale, infiltrats de cellules inflammatoires, et des abcès cryptiques (flèche) présents dans / δ bénéficiaires de KD RKO mais pas RAG1 - / - bénéficiaires. Colons de souris receveuses de KD RKO / de δ démontré accumulation marquée des lymphocytes T CD3 + par CD3 IHC (Les panneaux de fond) par rapport à deux points de RAG1 - / - bénéficiaires. (B) Colons de RKO / δ KD souris receveuses démontré une inflammation plus sévère par rapport à Colons from Rag1 - / - souris receveuses tel que déterminé par l'histologie notation. (C, D) cultures d'explants coliques de RKO / δ souris receveuses de KD sécrétées moins IL-10 (C) et plus IL-12p40 (D) que les cultures d'explants coliques du Rag1 - / -. Souris receveuses Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Nous avons déjà publié que le transfert de cellules T adoptive dans NFIL3 - / - / Rag1 - / - bénéficiaires à double inactivation (NRDKO) développer la colite plus sévère par rapport à Rag1 - / - souris receveuses (figure 2) 11. NFIL3 régule négativement IL-12p40 dans les macrophages murins coliques indépendamment de ses effets de l'IL-10 induisant 13. Le dérèglement de l'IL-12p40 et IL-10 est impliquée dans la voieogenesis d'une MII humaine. Ainsi, décochée production d'IL-12p40 dans le transfert des résultats NDRKO souris bénéficiaire adoptifs dans la progression de la maladie plus rapide, comme le montre la perte de poids (figure 2A). Certaines souris receveuses ont développé une maladie grave NRDKO résultant en un prolapsus rectal (figure 2B). Grossièrement, deux points de souris receveuses NRDKO sont épaissies et raccourcies, ce qui représente un grand afflux de cellules inflammatoires dans le côlon, comparativement à Rag1 - souris receveuses (figure 2C) - /.

Comparativement, dans Rag1 - / - souris avec un non fonctionnel PI3K catalytique p110δ de sous-unité dans les populations non-lymphocytes (RKO / δ KD), CD4 + CD45RB haute lymphocytes T réplétion induit une évolution clinique similaire rapide et sévère de la maladie par rapport aux souris NRDKO (Figure 3) 12. L'analyse histologique à trois semaines montre une hypertrophie des tissus du côlon, inflammainfiltrats de cellules conservateurs, et la crypte abcès (flèches) dans / δ bénéficiaires de KD RKO rapport à Rag1 - / - bénéficiaires (figure 3A). Les souris receveuses dans cette expérience ont été euthanasiés à trois semaines en raison d'un nombre important qui avait perdu 20% de leur poids corporel initial. Scores histologiques, tel que déterminé par un pathologiste aveuglé aux groupes expérimentaux et sur ​​la base de critères spécifiques développés dans notre laboratoire 12, étaient plus élevés chez les souris receveuses de KD RKO / de δ par rapport à Rag1 - / - souris receveuses (figure 3B). En outre, la production de cytokine spontanée à partir de cultures d'explants coliques démontré une diminution de l'IL-10 et IL-12p40 renforcée par la production de souris receveuses KD RKO / de δ par rapport à Rag1 - / - souris receveuses (figure 3C, D) 12. Encore une fois, l'augmentation de l'IL-12p40 et IL-10 a diminué la production est impliquée dans la pathogenèse de la IBD humaine 1.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.