Th17 Inflammation modèle de la candidose oropharyngée chez des souris immunodéficientes

Résumé

Bien qu’il existe des modèles d’infection à Candida pour étudier la résistance immunitaire de l’hôte, il n’existe aucun modèle pour étudier l’immunopathologie induite par les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à Candida. Nous décrivons ici une méthode pour établir l’immunopathologie Th17 associée à l’infection orale à Candida chez les souris immunodéficientes.

Résumé

La candidose oropharyngée (OPC) est causée non seulement par l’absence de résistance immunitaire de l’hôte, mais aussi par l’absence de régulation appropriée de l’immunopathologie induite par l’infection. Bien que les cellules Th17 soient impliquées dans la défense antifongique, leur rôle dans l’immunopathologie n’est pas clair. Cette étude présente une méthode pour établir l’immunopathologie orale Th17 associée à l’infection orale à Candidal chez les souris immunodéficientes. La méthode est basée sur la reconstitution de souris lymphopéniques avec des cellules Th17 cultivées in vitro, suivie d’une infection buccale par Candida albicans (C. albicans). Les résultats montrent que les cellules Th17 non restreintes entraînent une inflammation et une pathologie, et sont associées à plusieurs lectures mesurables, notamment la perte de poids, la production de cytokines pro-inflammatoires, l’histopathologie de la langue et la mortalité, montrant que ce modèle peut être précieux dans l’étude de l’immunopathologie OPC. Le transfert adoptif de cellules régulatrices (T_regs) contrôle et réduit la réponse inflammatoire, ce qui montre que ce modèle peut être utilisé pour tester de nouvelles stratégies pour contrer l’inflammation buccale. Ce modèle peut également être applicable à l’étude de l’immunopathologie orale Th17 en général dans le contexte d’autres maladies bucco-dentaires.

Introduction

Les infections buccales et l’inflammation ont été liées au cancer et aux maladies cardiovasculaires, et ont un impact dramatique sur la santé humaine globale^2,3. Les infections opportunistes et l’inflammation causées par C. albicans sont associées à des immunodéficiences primaires (AIP)^4,5, à des troubles inflammatoires tels que la parodontite ^6,7, le syndrome de Sjögren et la maladie des glandes salivaires^8,9, ainsi qu’à un carcinome épidermoïde buccal ^10-12. C. albicans est un champignon commensale dimorphe qui colonise la bouche de 60 % des humains en bonne santé de manière asymptomatique, mai....

Protocole

REMARQUE: Les expériences utilisant des souris ont été effectués conformément au comité de protection des animaux institutionnelle (IACUC) des lignes directrices.

1. La reconstitution de l'Rag-1 ^{- / -} souris avec des cellules I n vitro de culture Th17 (Trois jours avant l'infection)

1. Pour l'établissement des cellules Th17, culture CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25 des lymphocytes T naïfs (3 x 104) en U à fond plaques à 96 puits seuls ou co-culture eux avec 3 x 104 cellules CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg en présence d'soluble α-CD3 (1 pg / ml), α-CD28 (2 pg / ml) d'anticorps et de cellules présentatr....

Résultats

Dans ce modèle, les deux souris infectées par Candida et les souris non infectées dans Rag-1 ^{- / -} fond immunodéficientes ont été adoptive transféré avec des cellules Th17 3-5 jours avant l'infection. Un total de 10 à 12 souris ont été utilisés pour les expériences, avec deux souris dans chaque groupe Sham infecté et 4-5 dans chacun des groupes infectés Candida. Cellules naïves ont été obtenues à partir de souris congéniques CD45.1 ou Thy1.1, de sorte que les cellules Th17 injectés ont é.......

Discussion

Ce modèle est basé sur l'induction par voie orale C. albicans infection inflammation Th17 dépendante. En raison de l'absence de T _regs, l'inflammation cellulaire Th17 induite est effrénée et conduit à l'immunopathologie mal résolu. In vitro dérivés des cellules CD4 naïfs polarisés que les cellules Th17 ont été utilisés pour le transfert adoptif. 40-50% de la culture CD4 + cellules montrent détectable expression de l'IL-17A autour de 3 jours (cellules Th17), et donc ont ét.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CAF-2	Université de Pittsburgh (Sarah Gaffen)	-	Culture Candida
U-bottom 96 plaques de puits  ;	Fisher	055588	Utilisé pour la culture cellulaire
a-CD3  ;	eBiosciences	16-0031-85	Polarisation des cellules aux conditions Th17
a-CD28  ;	eBiosciences	16-0281-85	Polarisation des cellules aux conditions Th17
m-IL-6	Bio Basic	RC232	Polarisation des cellules aux conditions Th17
h-TGF-b  ;	R& D	240-B	Polarisation des cellules aux conditions Th17
a-IFN-g  ;	eBiosciences	16-7311-85	Polarisation des cellules aux conditions Th17
a-IL-4  ;	eBiosciences	16-7041-85	Polarisation des cellules aux conditions Th17
alpha ;-IL17A ef660	eBiosciences	50-7177-82	Utilisé pour la culture cellulaire - 1:50
&alpha ;-TNFa-PE-Cy7	eBiosciences	25-7423-41	Utilisé pour la culture cellulaire - 1:100
&alpha ;-RORgt PE  ;	eBiosciences	12-6981-82	Utilisé pour la culture cellulaire - 1:50
YNB sans acides aminés)/Peptone/Dextrose milieu de bouillon  ;	Bio Basic	S507. TAILLE	Mediium pour la croissance du candida
Incubateur Shaker  ;	New Brunswick Scientific	Innova 4300	Croissance d’incubation pour candida
Tubes de 15 ml	Bio Basic	BT888-SY	Utilisé pour la culture cellulaire et la croissance du candida
Tubes de 50 ml	Bio Basic	CT 788-YS	Utilisé pour la culture cellulaire et la croissance du candida
Centrifugeuse de table	VWR International LLC	82017-654	Pour la granulation du candida -900 g
Allegra Centrifuge	Beckman Coulter	392302	Culture cellulaire - 480 g
1,5 ml Tubes eppendorf	Bio Basic	BT620-NS	Préparation de la concentration finale de candida
2x paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	15710	Fixation du candida pour le comptage
Hémocytomètre	VWR International LLC	15170-172	Comptage des cellules
PBS - Phosphate Buffered Saline	Bio Basic	PD8117	Préparation des tampons
kétamine/xylazine  ;	Case Western Reserve University - Centre de ressources animales	-	Obtenu à partir du protocole approuvé par l’ARC pour l’anesthésie
Pommade lubrifiante ophtalmique.		Allergan-Pommade	pour les yeux pour les animaux pour prévenir la sécheresse
Saline (0,9 % NaCl)	G Biosciences	786-561	Administrée aux animaux pour prévenir la déshydratation
Boule de coton de 3 mm de diamètre  ;	VWR International LLC	BP7603	Boules de 3 mm pour l’infection à candida
Coussinets de gel chauffant	Case Western Reserve University - Centre de ressources animales	-	pour le maintien de la température corporelle et la récupération rapide
Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine	Histoserv - MD	-	Histologie tissulaire
10 % de formol  ;	Microscopie électronique Sciences	JC1111/MC	Histologie tissulaire
70 % éthanol  ;	VWR International LLC	97064-490	Objectif de stérilisation
PMA - Phorbol 12-myristate 13-acétate	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	Restimulation des cellules
Ionomycin	Life Technologies	124222 1mg	Restimulation des cellules
Kit de perméabilisation de fixation	eBiosciences E16913-106		Cellules de fixation pour cytométrie en flux
Seringues à tuberculine	BD Biosciences	309659	Souris injection
25 G x 3/8 aiguilles	BD Biosciences	309626	souris
injection Rag1 -/- souris	Jackson laboratories	N° stock : 002216	Souris receveuses
CD45.1 souris congéniques Jackson	laboratories	N° stock :002014  ;	Cellules Th17 du donneur
Souris CB17-SCID Jackson	laboratories	N° de stock : 001303	Souris receveuses
Souris Balb/c Jackson	laboratories	N° de stock : 000651	Cellules Th17 du donneur

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