Les outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associé à CRISPR) ont considérablement amélioré l’efficacité du ciblage génique dans les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer un rapporteur hiPSC spécifique à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas.
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Article de méthode
Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l'CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le ciblage génétique est une approche essentielle pour caractériser les fonctions des gènes dans la recherche biomédicale moderne. Cependant, l’efficacité du ciblage génique dans les cellules humaines a été faible, ce qui empêche la génération de lignées cellulaires humaines à un rythme souhaité. Au cours des deux dernières années, on a assisté à une progression rapide de l’amélioration de l’efficacité de la manipulation génétique par des outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated). Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer des rapporteurs de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) spécifiques à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas. Les procédures d’obtention des composants nécessaires à la fabrication de lignées neuronales à l’aide du système CRISPR/Cas, en se concentrant sur la construction de vecteurs de ciblage et d’ARN guides uniques, sont décrites. Ce protocole peut être étendu à l’établissement de plateformes et à la correction de mutations dans les hiPSC.
Introduction
Le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associé à CRISPR), associé à d’autres outils d’édition du génome, a révolutionné la manipulation du génome humain au cours des dernières années1-7. Les principaux composants du système CRISPR/Cas9 sont l’ARN guide unique (ARNsg) et Cas9. Cas9 est une endonucléase d’ADN de type II guidée par l’ARN. Il possède deux domaines de nucléases, HNH et RuvC, qui sont responsables de la fabrication de cassures double brin de l’ADN (DSB) dans une région génomique spécifique à côté d’un motif adjacent protospacer (PAM)7-10. Un ARNsg a une fonction combinée de celle de l’ARNcr et de l’ARNtracr, deux molécules d’ARN de l’immunité adaptative identifiées chez les bactéries (comme Streptococcus pyogenes) et les archées pour lutter contre l’invasion de l’ADN des sources exogènes9-11. Lorsqu’il est conçu de manière appropriée et co-introduit dans les cellules de mammifères, l’ARNsg reconnaît la séquence PAM, établit des paires de bases avec le brin complémentaire de l’ADN cible, et guide et transactive Cas9 pour qu’il clive les deux brins d’ADN immédiatement en amont de PAM7. Par la suite, une recombinaison dirigée homologue (HDR, en présence d’un vecteur cible) ou une jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) se produira pour réparer les DSB. Des transgènes tels que des ADNc, des cassettes rapporteures ou des fragments résistants aux antibiotiques peuvent être intégrés, et des lignées transgéniques ou knockin peuvent être fabriquées.
Bien que le système CRISPR/Cas9 soit très efficace et relativement spécifique, des activités indésirables hors cible ont été signalées12-15. Pour minimiser les événements hors cible, les nickases Cas9 (Cas9n) ont également été conçues9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A ou Cas9 H840A) est une enzyme Cas9 avec des mutations au niveau de l’un des deux domaines de la nucléase, qui ne provoque qu’une entaille au niveau d’un brin d’ADN. Pour réaliser un clivage aux deux brins, deux ARNsg sont conçus pour guider une paire de nickases, qui coupent séparément aux loci voisins des deux brins d’ADN différents. La stratégie de « double entaille » nécessite une conception plus stricte que la plate-forme Cas9 conventionnelle, et offre à la fois une efficacité élevée et une spécificité élevée pour les expériences d’édition de gènes.
Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer un rapporteur de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) spécifiques à la lignée à l’aide de la recombinaison homologue assistée par le système CRISPR/Cas. Les étapes permettant d’obtenir les composants nécessaires à la fabrication de lignées neuronales rapporteures à l’aide de l’édition du génome médiée par le système CRISPR/Cas sont décrites, en mettant l’accent sur la construction de vecteurs cibles et d’ARNsg. Ce protocole a été répété avec succès dans plusieurs lignées d’hiPSC, y compris celles dérivées d’individus sains et de patients atteints de maladies du SNC. Les gènes ciblés dans notre laboratoire comprennent OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 et SOD1. L’efficacité de ciblage de la recombinaison homologue médiée par le système CRISPR/Cas dans les hiPSC varie de 20 à 40 %, ce qui est cohérent avec les rapports précédents1,18,19. Par rapport à une efficacité typique de 1 à 2 % dans les expériences conventionnelles de ciblage génique, l’efficacité du ciblage est considérablement améliorée.
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Protocole
1. Conception et construction vectorielle pour le ciblage des vecteurs
- Une fois que le marqueur spécifique de la lignée est déterminé, localisez la séquence génomique du gène et concevez les bras d’homologie en conséquence. La longueur du bras d’homologie 5' est de ~1 kb et celle du bras d’homologie 3' est de ~1,5 kb (Figure 1).
- Marquez la cassette rapporteure séquentiellement en aval de la séquence génomique juste avant le codon stop, par sous-clonage, afin que l’expression endogène ne soit pas altérée ou perturbée. Reliez le rapporteur, ou la ou les cassettes à double rapporteur, avec les séquences peptidiques 2A auto-clivantes (F2A, E2A ou T2A) 20,21, ou le site d’entrée interne du ribosome (IRES).
Remarque : Les déclarants peuvent inclure des protéines fluorescentes telles que GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, luciférase ou une cassette de résistance aux antibiotiques, une combinaison de protéines fluorescentes et de cassette de résistance aux antibiotiques. La figure 1 montre un exemple de construction d’un vecteur de ciblage pour le gène de la ALDH1L1 humaine, marqué par EGFP et cassette de résistance à la néomycine. - Ajouter une cassette de sélection positive en aval du rapporteur. La sélection positive est une cassette floxée résistante aux antibiotiques qui sera excisée des iPSC ciblées après la sélection et l’isolement des clones positifs.
- Inclure une cassette de sélection négative à l’extérieur du bras d’homologie de 3 pi. Les cassettes de sélection négative courantes sont la thymidine kinase, la TK et la toxine diphtérique A (DTA) 22.
- Obtenez un clone humain BAC contenant la séquence du marqueur de lignée et vérifiez le clone par amplification PCR. Construire le vecteur de ciblage dans pKD46 contenant du DH5α en utilisant la recombinaison pour abattre le site de ciblage 23. Appliquez des stratégies de passerelle multisite, Golden gate23,24 si nécessaire.
2. Conception et construction vectorielle d’ARNsg pour le système CRISPR/Cas9.
- Déterminez le marqueur spécifique à la lignée qui sera ciblé pour faire le rapport. Copiez la séquence d’ADNc à partir de la base de données NCBI. Allez à la recherche BLAT humain pour obtenir l’alignement de l’ADN génomique.
- Cliquez sur l’onglet « navigateur » pour voir l’assemblage du gène. Sous l’onglet « Affichage », cliquez sur « DNA » pour obtenir la séquence d’ADN génomique complète au format FATA.
- Localisez le codon stop dans la séquence d’ADN, où la séquence 2A et la cassette rapporteure seront marquées.
- Recherchez le motif adjacent du protospacer (PAM, c’est-à-dire NGG) dans la vinicité (~100 pb de zone flanquante) du codon stop. Balayez les deux brins pour localiser la séquence NGG appropriée. Tenez compte de la spécificité des séquences en amont pour éviter les événements hors cible potentiels. Utilisez des outils open source tels que BLAST et CasOT (voir l’étape 5 pour plus de détails).
- Copiez la séquence de 20 bases immédiatement en amont de NGG et collez-la dans l’outil de conception web ZiFit pour concevoir des oligos avec des surplombs compatibles avec le vecteur d’expression de l’ARNg humain (avec promoteur U6) MLM3636.
- Synthétiser les oligonucléotides avant et arrière 7.
- Pour fabriquer de l’ARNsg double brin, dénaturez les deux oligonucléotides à 70 °C pendant 15 minutes et refroidissez progressivement jusqu’à ce qu’ils soient RT. Pour une réaction de 50 μl, ajoutez respectivement 22,5 μl d’oligonucléotides avant et inverse (la concentration de la matière est de 0,1 mM) et 5 μl de tampon de recuit (100 mM de Tris-HCl, 10 mM d’EDTA, 1,5 M de NaCl, pH de 8,0).
- Mélanger et ligaturer les oligos obtenus à partir de l’étape 2.7 avec le vecteur d’expression de l’ARNg humain digéré par BsmBI (avec promoteur U6) MLM3636. Pour une réaction de 20 μl, ajoutez 1 μl d’oligos de l’étape 2.7, 100 ng de MLM3636 et 1 μl (400 U) de T4 ligase. Incuber à RT O/N.
- Transformez les cellules compétentes DH5α avec le produit de ligature par choc thermique à 42°C pendant 30 sec. Cultivez les bactéries dans une plaque d’ampicilline gélose LB (100 μg/ml) à 37°C O/N. Choisissez 3 ~ 5 colonies pour le miniprep plasmidique selon le protocole du fabricant. Séquencez l’ADN plasmidique pour confirmer auprès de fournisseurs commerciaux. Maxiprep le bon plasmide selon le protocole du fabricant.
- Évaluez l’ARNsg à l’aide d’un test d’endonucléase T7 1 (T7E1) (voir l’étape 4 pour plus de détails). La hiPSC transfective avec le plasmide et l’ARNsg sera exprimée sous le promoteur U6 intégré dans le squelette MLM3636 (voir l’étape 6 pour plus de détails).
3. Conception et construction de l’ARNsg double Nickase Cas9n
- Obtenir double nickase Cas9n D10A vecteur pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
- Concevez une paire d’oligonucléotides avant et inverse pour chaque locus de ciblage. Copiez la séquence de 20 bases immédiatement en amont de NGG comme décrit à l’étape 2 et collez-la dans l’outil de conception web ZiFit
- Pour obtenir des oligonucléotides avec des porte-à-faux compatibles avec pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), retirez la première et la dernière base des oligos avant et arrière qui sont montrés par l’outil de conception ZiFit.
- Synthétiser les oligos avant et arrière7. Nommez ces oligonucléotides comme f(n)-F, f(n)-R pour les PAM d’un côté du site cible, r(n)-F, r(n)-R pour les PAM de l’autre côté du site cible. Parmi ceux-ci, n est le nombre pour désigner différents PAMs, les minuscules f et r représentent l’emplacement des PAM soit au brin sens (f) ou antisens (r), F et R représentent les oligos avant et arrière.
- Testez plusieurs paires (p. ex., r5 et f2) à l’aide du test T7E1 (détaillé à l’étape 4) pour identifier la paire optimisée d’ARNsg à utiliser pour Cas9n.
- Pour fabriquer de l’ARNsg double brin, dénaturez les deux oligonucléotides à 70 °C pendant 15 minutes et refroidissez progressivement jusqu’à ce qu’ils soient RT. Pour une réaction de 50 μl, ajoutez respectivement 22,5 μl d’oligonucléotides avant et inverse (la concentration de la matrice est de 0,1 mM) et 5 μl de tampon de recuit (100 mM de Tris-HCl, 10 mM d’EDTA, 1,5 M de NaCl, pH 8,0).
- Mélanger et ligaturer les oligos obtenus à partir de l’étape 3.5 avec le pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) digéré par BbsI. Pour une réaction de 20 μl, ajoutez 1 μl d’ARNsg de l’étape 3.5, 100 ng de Cas9n (D10A), 1 μl (400 U) de T4 ligase. Incuber à RT O/N.
- Transformez les cellules compétentes DH5α avec le produit de ligature par choc thermique à 42 °C pendant 30 sec. Cultivez les bactéries dans une plaque d’ampicilline gélose LB (100 μg/ml) à 37 °C O/N. Choisissez 3 ~ 5 colonies pour le miniprep plasmidique selon le protocole du fabricant. Séquencez l’ADN plasmidique pour confirmer auprès de fournisseurs commerciaux. Maxiprep le bon plasmide selon le protocole du fabricant.
- Évaluez l’ARNsg par dosage T7E1 (voir l’étape 4 pour plus de détails). La hiPSC transfectible avec le plasmide et l’ARNsg sera exprimée sous le promoteur U6 intégré dans le squelette Cas9n (D10A) (voir l’étape 6 pour plus de détails).
4. Évaluation des ARNsg par le dosage de l’endonucléase T71 (T7E1)
- Pour une plaque de 24 puits, plaquez 2 x 105 cellules de 293 pieds par puits un jour avant (jour -1).
- Le jour de la transfection (jour 0), co-transfectez les cellules 293FT avec le plasmide sgRNA et le vecteur d’expression Cas9. Ajouter 0,5 μg de vecteur d’ARNsg, 0,5 μg de vecteur d’expression Cas9 JDS246 (Cas9-003) et 1,5 μl de lipofectamine 2000.
- Pour un contrôle négatif, ajoutez 0,5 μg de vecteur d’expression GFP (par exemple, GFP piloté par le promoteur CMV dans un squelette pcDNA3) au lieu de vecteurs d’ARNsg.
- Après 72 heures (jour 3), récoltez les cellules en ajoutant 100 μl de tampon d’extraction rapide d’ADN et en triturant vigoureusement.
- Incuber le mélange à 68 °C pendant 15 min, puis à 95 °C pendant 8 min. Il s’agit du modèle pour les expériences PCR ultérieures.
- Concevez des amorces PCR avant et arrière pour amplifier la séquence flanquant la PAM. Habituellement, le produit PCR ciblé a une longueur d’environ 400 à 500 pb. Synthétiser les oligonucléotides7.
- Pour une réaction PCR de 50 μl, ajoutez 1 μl de matrice de l’étape 4.5, 0,5 μl d’Herculase II, 0,5 μl de DMSO, 10 μl de tampon 5x, 0,5 μl de mélange dNTP et 1 μl de mélange d’amorces avant et arrière.
- Utilisez les paramètres PCR suivants : 98 °C pendant 2 min, 35 cycles de 98 °C pendant 20 sec, 59 °C pendant 20 sec, 72 °C pendant 1 min, avec une extension finale à 72 °C pendant 5 min
Remarque : Les paramètres de PCR décrits ici produisent des produits spécifiques pour plusieurs gènes testés. Cependant, ces conditions dépendent des gènes d’intérêt choisis par l’utilisateur. Les PCR utilisant l’ADN génomique comme matrice nécessitent souvent une optimisation pour s’assurer qu’aucune bande supplémentaire n’apparaît. Ces bandes supplémentaires peuvent être confondues avec des produits de clivage après le test T7E1. - Mesurer la concentration d’ADN des produits de PCR à l’aide d’un spectromètre à A260.
- Ajouter 400 ng de produits PCR à 2 μl de tampon de digestion 2. Ajouter du ddH2O à un volume de réaction final de 19 μl. Incuber dans de l’eau bouillante pendant 5 min. Laissez la réaction reposer sur le banc et refroidir naturellement jusqu’à RT (45-60 min).
- Ajouter 1 μl (10 unités/μl) de T7E1, incuber à 37 °C pendant 15 min. Arrêter la réaction en ajoutant 2 μl d’EDTA 0,25 M mélangé à un colorant de charge d’ADN 6x.
- Dissoudre 2,5 g de poudre d’agarose dans 100 ml de 1xTAE. Passez le mélange au micro-ondes et versez le gel dans une boîte de gel. Lorsque le gel est formé, chargez toute la réaction de 20 μl dans le gel d’agarose à 2,5 %. Faites fonctionner le gel à 100-150 V pendant 30 min.
- Inspectez le gel sous une lumière UV (Figure 3). T7E1 coupe aux sites non appariés. Pour les ARNsg qui ont provoqué une jonction d’extrémité non homologues, les produits PCR montreront des bandes de migration rapide supplémentaires (de plus petite taille) par rapport au contrôle négatif (décrit à l’étape 4.3).
- Estimez et classez l’efficacité de coupe de l’ARNsg et le pourcentage d’insertion et de délétion (indel %) en comparant la densité de bande à l’aide du logiciel Image J.
- Pour chaque échantillon qui s’écoule sur le gel, désignez les bandes de gel comme bande non coupée, bande coupée 1 et bande coupée 2.
- Mesurez la densité de chaque bande à l’aide d’ImageJ conformément au manuel du logiciel.
- Calculez lacoupe f à l’aide de la formule suivante : coupe f = (bande coupée 1 + bande coupée 2) / (bande non coupée + bande coupée 1 + bande coupée 2)
- Calculez Indel % à l’aide de la formule suivante : Indel=1- √(1-fcoupe).
5. Prédiction in silico de sites potentiels hors cible
Remarque : Les sites potentiels hors cible peuvent être prédits à l’aide d’un outil open source en ligne appelé CasOT17, qui est un programme basé sur Perl.
- Pour un système Windows, téléchargez le programme CasOT et les fichiers de la base de données du génome humain sur le disque dur local.
- Préparez le fichier cible de l’ARNsg conçu au format FASTA.
- Ouvrez le fichier nommé « casot ». Une fenêtre de commande s’affiche. Laissez-le tel quel pour l’instant.
- Ouvrez le fichier nommé « opt-generator » pour générer la chaîne d’option. Collez le chemin d’accès et le nom du fichier cible dans la boîte de dialogue de l’option « -t » ou « -target ».
- Collez le chemin du fichier de séquence du génome dans la boîte de dialogue de l’option « -g » ou « -genome ».
- Valeurs d’entrée de –s ou –seed (la valeur par défaut est 2) et –n ou -nonseed (la valeur par défaut est 255). La chaîne d’options est générée et apparaît dans la zone en haut de la page.
- Copiez la chaîne d’options et collez-la dans la fenêtre de commande CasOT décrite à l’étape 5.3.
Remarque : L’exécution du programme CasOT peut prendre de 30 à 90 minutes en fonction des options et de l’ordinateur utilisé. Une fois terminé, un dossier nommé '--' sera généré. Deux fichiers seront inclus dans le dossier, un fichier « .stat » décrivant les statistiques et un fichier .csv (valeurs séparées par des virgules) contenant les résultats de recherche détaillés. - Ouvrez le fichier .csv à l’aide d’un tableur. Les informations suivantes sont fournies dans le dossier pour chaque site hors cible : localisation chromosomique et génomique, séquence du site, type de discordance (Mm), nombre total de bases non appariées et informations sur les exons relatives au site hors cible.
- Concevoir des amorces PCR pour les sites qui ont <2 Mm dans la séquence de semences ou non.
- Effectuez une PCR pour le clone positif de hiPSC sélectionné dans les conditions suivantes : 98 °C pendant 2 min, 35 cycles de 98 °C pendant 20 sec, 59 °C pendant 20 sec, 72 °C pendant 1 min, avec une extension finale à 72 °C pendant 5 min><. Remarque : Les paramètres de PCR décrits ici permettent d’obtenir des produits spécifiques pour plusieurs gènes testés dans notre laboratoire. Cependant, ces conditions dépendent des gènes d’intérêt choisis par l’utilisateur. Les PCR utilisant l’ADN génomique comme matrice nécessitent souvent une optimisation pour s’assurer qu’aucune bande supplémentaire n’apparaît.
- Séquencez les produits de PCR, alignez les résultats de séquençage sur les séquences prédites et recherchez les mutations. S’il existe des mutations, des événements hors cible sont identifiés.
6. Électroporation des hiPSC pour fabriquer des rapporteurs de lignée neuronale
- Culture des hiPSC en milieu TeSR-E8 sur des plats enrobés de Geltrex. Changer le milieu en milieu MEF-CM (Mouse embryonic fibroblasts conditioning medium) deux jours avant l’électroporation. Incuber dans 2 ml d’Accutase pendant 5 min et prélever les cellules.
- HiPSC électroporatiques avec vecteur de ciblage linéarisé, vecteur d’expression Cas9-003 et vecteur d’ARNsg dans les conditions suivantes : 1 x 107 hiPSC, co-transfect 2,5 μg d’ARNsg, 2,5 μg de Cas9 et 50 μg de vecteur cible. Pour une stratégie de double nickase, ajouter 50 μg de vecteur cible, 2,5 μg de chaque ARNsg (avec Cas9n co-exprimé par le vecteur).
- Sélectionnez les clones par sélections positives et négatives comme décrit24,25.
- Identifiez les clones positifs par analyse par transfert de Southern ou PCR génomique à longue portée24,25.
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Résultats
Des vecteurs d'adressage contenant tous les éléments nécessaires, y compris les bras d'homologie, la cassette rapporteuse, et les cassettes de sélection positive et négative, sont construits (Figure 1). À partir du locus génomique endogène, plusieurs (2 à 3) ARN guides simples (sgRNA) (en cas d'utilisation du système Cas9) ou paires de sgRNA (en cas d'utilisation de la stratégie de double coupe avec Cas9n) sont conçus et insérés dans les vecteurs d'expression d'ARNg humain MLM3636 ou pX335-U6-Chimeric_BB...
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Discussion
Le ciblage génétique est un outil essentiel dans la caractérisation des fonctions des gènes. Cependant, l’efficacité relativement faible exige un travail à forte intensité de main-d’œuvre et chronophage. Récemment, le développement d’outils d’édition du génome tels que le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) a considérablement amélioré l’efficacité du ciblage. Ce manuscrit décrit un protocole de génération d’un rapporteur de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC)...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Département de neurochirurgie, la Fondation Memorial Hermann, le Fonds Staman Ogilvie, le Bentsen Stroke Center du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à Houston et la Fondation Mission Connect TIRR.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 ; | Addgene | 20350 | |
| pKD3 ; | Addgene | 45604 | |
| pKD46 Centre de | stock génétique de Coli, CGSC | 7634 | |
| Séquence PGK-neo-bpA ; | Addgene | 13442 | |
| Clones humains BAC de gènes cibles ; | |||
| JDS246 (Cas9-003), Streptococcus pyogenes optimisé pour les codons de mammifères Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 | |
| MLM3636, Vecteur d’expression de l’ARNg humain avec promoteur U6 ; | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 | |
| conception d’ARNsg, ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | ||
| Outil de prédiction hors cible CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | ||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| sgRNA Primer synthesis | Sigma | ||
| One shot Top10 Electrocomp E. Coli Cellules compétentes | Life Technologies | C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 | |
| Enzymes de restriction | NEB et Life Technologies | ||
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 | |
| Tampon d’extraction rapide de l’ADN ; | Epicentre | QE0905T | |
| Herculase II Fusion DNA polymérases | Agilent Technologies | 600675 | |
| Tampon de digestion 2 | New England Biolab | ||
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| TeSR-E8 Kit pour la maintenance hESC/hiPSC | Stem Cell Technologies | 05940 | |
| Agarose UltraPure ; | Life Technologies | 16500-100 | |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 | |
| Essential 8 medium ; | Life Technologies | A1517001 | |
| Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium | Life Technologies | A12856-01 | |
| D-MEM/F12 avec Glutamax ; | Life Technologies | 10565018 | |
| D-MEM avec Glutamax ; | Life Technologies | 10566040 | |
| Sérum fœtal bovin-ES qualifié pour les cellules ; | Life Technologies | 10439 | |
| Remplacement de sérum knockout ; | Life Technologies | 10828010 | |
| 2-mercaptoéthanol 1000X ; | Life Technologies | 21985023 | |
| Acides aminés Non Essentiels ; | Life Technologies | 11140050 | |
| Stempro Accutase ; | Life Technologies | A1110501 | |
| Dispase ; | Life Technologies | 17105-041 | |
| 0,25 % Trypsine-EDTA solution ; | Life Technologies | 25200-056 | |
| Geltrex ; | Technologies de la vie ; ; ; | 12760-013 | |
| Inhibiteur de ROCK Y-27632 | Millipore | ; ; SCM075 | |
| Réactif SMC4 ; | BD | 354357 | |
| MEF résistant à la néomycine ; | Millipore | PMEF-NL | |
| Résistant à l’hygromycine MEF ; | Millipore | PMEF-HL | |
| G418 (Génétique) | LifeTechnologies | 11811 | |
| Hygromycine B ; | Life Technologies | 10687010 | |
| FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß ;-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil | ; Biochimiques et radiochimiques Moravek | ; ; Électroporateur M251 | |
| : Gene Pulser Xcell ; | Cuvette d’électroporation Bio-Rad | ||
| 0,4 cm ; | Bio-Rad | 165-2088 | |
| DIG-High prime Kit de démarrage pour le marquage et la détection de l’ADN prime II ; | Roche | 11585614910 | |
| Solution de dénaturation par hybridation ; | VWR | 82021-478 | |
| Kit de synthèse de sonde PCR DIG ; | Roche | 11636090910 | |
| Kit de lavage DIG² | Roche | 11585762001 | |
| Anti-Digoxigénine (DIG-AP) | |||
| CSPD ; | Roche | 11755633001 | |
| Kit de tampons de lavage et de bloc DIG© | Tampon | TAE Roche 11585762001 | |
| 50X ; | Life Technologies | 24710030 | |
| Tampon buvard (25 mM Tris pH 7,4, ; 0,15 M NaCl, ; 0,1 % Tween20) | |||
| Hoefer Ultraviolet Crosslinker ; | Fisher Scientific | 03-500-308 | |
| Spermidine ; | Fisher | AC13274-0010 | |
| Tris HCl 2M (pH 7,5) | VWR | ; ; 200064-506 | |
| Denville Scientific film bio bleu 8x10 ; | Fisher | nc9550782 | |
| Marqueur de poids moléculaire d’ADN II ( marqué DIG ) | Roche | 11218590910 | |
| Amersham Membrane buvardage Hybond-N+ ; | Roche | 95038-400 | |
| Plateau de séchage en verre Pyrex ; | Fisher | 15-242A | |
| Kimberly-Clark Essuie-tout plié en C ; | Fisher | 06-666-32B | |
| Papier Whatman 3MM (26X41) | Fisher | ; ; 05-713-336 | |
| Sac d’hybridation ; | Roche | 11666649001 | |
| Tubes d’hybridation ; | Fisher | 13-247-300 | |
| Four à hybridation rôtissoire Shake 'n' Stack ; | Fisher | HBMSOV14110 |
Références
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
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