Automated quantification des cellules hématopoïétiques - Interactions cellulaires stromales dans les images histologiques de décalcifiées os

Résumé

Une stratégie d’analyse quantitative des données histologiques dans la moelle osseuse est présentée. La microscopie confocale de cellules marquées par fluorescence dans des coupes de tissus permet d’obtenir des images en 2 dimensions, qui sont automatiquement analysées. Les analyses de co-localisation de différents types de cellules sont comparées aux données d’images simulées, ce qui donne des informations quantitatives sur les interactions cellulaires.

Résumé

La microscopie confocale est la méthode de choix pour l'analyse de la localisation des multiples types de cellules au sein des tissus complexes tels que la moelle osseuse. Cependant, l'analyse et la quantification de localisation cellulaire est difficile, comme dans de nombreux cas, il se appuie sur le comptage manuel, portant ainsi le risque d'introduire un biais de l'évaluateur-dépendante et réduire fiabilité inter. En outre, il est souvent difficile de juger si la co-localisation entre deux cellules résulte de positionnement aléatoire, en particulier lorsque des types de cellules diffèrent fortement de la fréquence de leur occurrence. Ici, un procédé de quantification non biaisée de la co-localisation cellulaire dans la moelle osseuse est introduite. Le protocole décrit la préparation de l'échantillon utilisé pour obtenir des coupes histologiques de entiers os longs murins y compris la moelle osseuse, ainsi que le protocole de coloration et l'acquisition d'images à haute résolution. Un flux de travail d'analyse allant de la reconnaissance de hématopoïétiques et non-hematopoietic types de cellules dans deux dimensions des images de moelle (2d) de l'os à la quantification des contacts directs entre les cellules est présentée. Cela inclut également une analyse de voisinage, afin d'obtenir des informations sur le microenvironnement cellulaire entourant un certain type de cellule. Afin d'évaluer si la co-localisation de deux types de cellules est la simple conséquence de positionnement cellulaire aléatoire ou reflète associations préférentielles entre les cellules, un outil de simulation qui permet de tester cette hypothèse dans le cas d'hématopoïétiques ainsi que des cellules stromales, est utilisé. Cette approche ne est pas limitée à la moelle osseuse, et peut être étendue à d'autres tissus pour permettre une analyse reproductible, quantitative des données histologiques.

Introduction

En raison des récents développements technologiques rapides dans la microscopie, y compris l'imagerie optique, l'analyse de cellules dans le contexte du tissu entier est devenu de plus en plus accessible pour les immunologistes. La caractérisation des cellules individuelles en suspension représente une méthode utile et indispensable pour comprendre la fonction cellulaire et moléculaire. Cependant, l'analyse des cellules au sein de leur (micro) -anatomical environnement est essentielle pour comprendre les interactions entre les différents types de cellules qui collaborent dans des processus complexes tels que le développement des réponses immunitaires.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été approuvés par les commissions compétentes de l'État pour la protection des animaux (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) et ont été réalisées conformément aux lignes directrices actuelles et les règlements (licence d'expérimentation animale G0194 / 11).

1. Production de souris fluorescent moelle osseuse chimériques

REMARQUE: La production de souris chimériques fluorescent de la moelle osseuse de visualiser les cellules stromales de la moelle osseuse est effectuée comme décrit ^ci-9.

1. Commencer à traiter Del-Cre x souris ROSA-tdRFP (s....

Résultats

Cryosections d'os non décalcifié de coupe avec la méthode de la bande Kawamoto permet à l'ensemble de l'os à couper en tant que partie intacte, avec de la moelle osseuse de la région endo-osseux encore attaché à l'os minéralisé, à la fois dans la diaphyse, ainsi que dans les zones de épiphysaires avec leur forte densité de l'os trabéculaire (Figure 1). Coloration nucléaire des sections révèle que, bien que de petites fissures dans la préparation ne peuvent pas être entièrement évités.......

Discussion

Malgré les progrès dans les méthodes modernes d'imagerie optique, l'analyse des données histologiques est encore souvent entravé par le manque d'outils de quantification appropriés et des méthodes, ou par des analyses biaisées qui se concentrent sur une petite zone d'intérêt. L'approche synergique présenté ici combine l'analyse d'image couvrant la région de la moelle osseuse entière, la segmentation automatique et la reconnaissance d'objets de divers types de cellules hématopoïétiques et .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Néomycine	Sigma	N6386 SIGMA	Sel hydraté de trisulfate de néomycine, codes de danger UE : GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml contient : 50 000 U.I. de palmitate de rétinyle, 5 000 U.I. de cholécalciférol, 30 mg d'acétate de tocophéryle, 100 mg d'acide ascorbique, 1 mg d'acide sorbique, 200 mg d'huile de ricin polyoxylée 35, 0,5 mg de gallate de propyle
Solution de transfert (100 ml PBS, 1 ml HEPES 1 M, 50 U/ml pénicilline/streptomycine)	Sigma	P4333, H3375
Haptène 4-hydroxy-3-nitrophénylacétyle conjugué à la gamma globuline de poulet
Gamma globuline de poulet (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
Solution de paraformaldéhyde à 20 % (qualité EM)	Science Services	15713	Codes de danger UE : GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
Saccharose D(+)	Carl Roth	4621.1
Glace sèche
Acétone	Sigma-Aldrich	179124 SIGMA-ALDRICH	Codes de danger UE : GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	Codes de danger UE : GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Moules cryogéniques Tissue-Tek (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
Milieu d'encapsulation SCEM de Kawamoto	Section-Lab, JP
Kits de préparation de cryosections de Kawamoto	Section-Lab, JP
Cryofilm type 2C(9) de Kawamoto	Section-Lab, JP
Lame de microtome MX35 premier plus, profil bas	Thermo Scientific	3052835	L x l : 80 x 8 mm (31,5 x 3,13 po), épaisseur : 0,25 mm (0,01 po)
Anticorps polyclonal de lapin anti-RFP, biotinylé	Rockland	600-406-379
Streptavidine Alexa Fluor 555	Life Technologies	S-32355
Anticorps de rat anti-MBP	J. et N. Lee		disponible auprès de : J. et N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, États-Unis, clone MT-14.7
Anticorps secondaire de chèvre anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Anticorps de rat anti-B220 - Alexa Fluor 594			produit et conjugué en interne (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 de Life Technologies
Anticorps de souris anti-chaîne légère l1 - FITC			produit et conjugué en interne (DRFZ), clone LS136
Anticorps de rat anti-chaîne légère k - FITC			produit et conjugué en interne (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure)	Sigma	D9542 SIGMA
Milieu de montage fluorescent	DAKO	S3023
Coverslips (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)	Carl Roth	H875.2
Lames porte-objets Superfrost (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Microscope confocal à balayage laser			équipé de lignes laser à 405, 488, 561, 594, 633 nm et d'un objectif à immersion dans l'air 20X/0,8 NA. Nous avons utilisé un Zeiss LSM710 et le logiciel Zen 2010 version 6.0.
Outils d'analyse d'images automatisés pour la moelle osseuse	Wimasis, Munich		L'outil de contact cellulaire et l'outil de proximité cellulaire seront mis à disposition par Wimasis sur demande.
Runtime VC2012	Microsoft		téléchargement gratuit
Outil de simulation pour le positionnement aléatoire des cellules			disponible auprès de nous, sur demande
Logiciel d'analyse d'images avec fonctions de segmentation d'images			Nous avons utilisé Volocity (Perkin Elmer) pour mesurer les distributions de taille des types cellulaires hématopoïétiques dans la moelle osseuse (Figure 5). Des alternatives sont Definiens Image Analysis (Definiens) ou Cell Profiler (téléchargement gratuit)
Logiciel d'analyse d'images Fiji			téléchargement gratuit. Fiji a été utilisé par des évaluateurs formés pour le comptage manuel des cellules (Figure 3).