Le diagnostic de l’infection à Eimeria chez les poulets reste exigeant. Les approches basées sur la morphologie du parasite et la pathologie de l’hôte sont souvent peu concluantes, tandis que les approches moléculaires basées sur la PCR se sont avérées exigeantes en termes de coût et d’expertise. L’objectif de ce protocole est d’établir l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) comme diagnostic moléculaire simple de l’infection eimérienne.
Article de méthode
amplification isotherme (LAMP) Essais de boucle médiation pour la détection des espèces spécifiques de
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les parasites des espèces Eimeria, les protozoaires qui causent la maladie entérique coccidiose, constituent une menace sérieuse pour la production et le bien-être des poulets. En l’absence d’un contrôle efficace, la coccidiose clinique peut être dévastatrice. La résistance aux chimioprophylactiques fréquemment utilisées pour lutter contre Eimeria est fréquente et l’infection subclinique est répandue, influençant les taux de conversion alimentaire et la sensibilité à d’autres agents pathogènes tels que Clostridium perfringens. Malgré la disponibilité d’outils basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le diagnostic de l’infection à Eimeria repose encore presque entièrement sur des approches traditionnelles telles que le score des lésions et la morphologie des oocystes, mais aucune n’est simple. Les limites des outils moléculaires existants comprennent la nécessité d’un équipement spécialisé et des difficultés d’accès à l’ADN comme modèle. En réponse, un protocole simple de préparation de l’ADN sur le terrain et un panel de tests d’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) spécifiques à l’espèce ont été développés pour les sept Eimeria reconnus pour infecter le poulet. Nous fournissons maintenant un protocole détaillé décrivant la préparation de l’ADN génomique à partir de tissus intestinaux prélevés post-mortem, suivie de la mise en place et de la lecture des tests LAMP. Le LAMP spécifique à l’espèce Eimeria peut être utilisé pour surveiller l’apparition de parasites, évaluer l’efficacité de la stratégie anticoccidienne d’une ferme et pour diagnostiquer une infection subclinique ou une maladie clinique, ce qui est particulièrement utile lorsqu’une surveillance experte n’est pas disponible.
Introduction
La production de poulet mondial a été multiplié par dix au cours des dernières 50 années avec le monde en développement qui accueillent près de quatre fois l'expansion assisté dans le monde développé (www.faostat.org) . Comme la pertinence de la production de poulet à la sécurité alimentaire mondiale a augmenté de façon trop a le profil d'agents pathogènes qui peuvent causer une maladie grave chez les poulets. Un excellent exemple est l'espèce Eimeria, protozoaires parasites omniprésents qui peuvent causer la maladie entérique une coccidiose. Partout où les poulets sont élevés une ou plusieurs espèces d'Eimeria sont susceptibles d'être commune 2-4. Dans le monde développé Eimeria sont principalement contrôlée par la chimioprophylaxie, employant programmes de navette ou de rotation pour minimiser l'impact de la résistance 5. Les vaccins vivants sont également utilisés dans les systèmes où la valeur des oiseaux est suffisant pour justifier le coût (par exemple, les animaux reproducteurs, des couches et des poulets de chair 5). En resull de ces mesures coccidiose clinique est souvent bien contrôlé, bien que l'infection sous-clinique est commune 5. Dans le monde en développement de la vaccination est rare et la demande de drogues souvent moins bien informé. En conséquence coccidiose sous-clinique et clinique est plus fréquente et exerce un impact économique significatif 3.
Diagnostic de l'infection eimerian a toujours compté sur lésion totalisant post-mortem, bien que même les auteurs de le système de notation plus largement utilisé remarquer que pour certaines espèces "il semble douteux qu'une telle procédure devrait être tentée dans tout mais modérément sévères infections" 6. Preuve supplémentaire peut être recueillie grâce à la détection au microscope au stade résistant à l'environnement du cycle de vie des oocystes dans des échantillons fécaux ou litière, bien que se chevauchant morphologie peut confondre tous, mais l'expert 6,7. Alternatives moléculaires utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR), amplificatio aléatoiren de l'ADN polymorphe PCR (RAPD-PCR) et des technologies de PCR quantitative ont été disponibles pour un maximum de 20 années 8-10, mais à ce jour ils ne ont pas réussi à devenir populaire. Coût relatif et l'exigence de l'équipement de laboratoire spécialiste ou traitement ont limité leur adoption, en dépit de la nature souvent subjective et techniquement exigeante de la pathology- plus âgés et les approches basées sur la microscopie-10,11. Ces limitations peuvent être exagérées dans la plupart des régions les plus pauvres du monde comme l'Asie du Sud-Est, où l'impact de la coccidiose sur la pauvreté peut être proportionnellement plus 12. En réponse il ya une demande claire pour des tests de diagnostic, nouvelle Eimeria espèces spécifiques simple et sensible, mais rentable.
Boucle amplification isotherme facilitée (LAMP) est une technique facile à préparer entraînée par polymérase-ADN qui est capable d'amplifier de grandes quantités d'ADN. Plus important encore, LAMP utilise un polymera Bst ADNSE au lieu de l'ADN polymerase Taq utilisée dans la PCR, ce qui facilite l'amplification d'ADN à une température constante sans la seule exigence pour le cyclage thermique 13,14. LAMP peut se prêter à l'application même dans le laboratoire le plus rudimentaires ou dans le domaine. Caractérisée par la résistance par rapport à de nombreux inhibiteurs de la PCR, haute sensibilité et spécificité, des tests de LAMP ont été élaborés pour un large éventail d'agents pathogènes y compris le virus de la maladie de Gumboro, Clostridium perfringens et Cryptosporidium 15-17. En réponse à la demande pour de nouveaux diagnostics Eimeria rentables espèces spécifiques d'un panel de tests LAMP spécifiques à chacune des sept espèces d'Eimeria qui infectent les poulets a été développé 18. Applications pour les nouveaux tests comprennent la surveillance parasite occurrence, d'une valeur particulière donnée l'association d'espèces telles que Eimeria maxima ou Eimeria necatrix avec une mauvaise pe économiquerformance 3,4. D'autres applications comprennent l'évaluation de l'efficacité de la stratégie anticoccidienne d'une ferme, le diagnostic de l'infection sous-clinique ou clinique de la maladie et l'évaluation des risques posés par Eimeria à une ferme.
Protocole
1. Préparation modèle
NOTE: Toute matrice d'ADN génomique soupçonné de contenir de l'ADN dérivé de l'un des sept espèces d'Eimeria qui infectent les poulets peut être utilisé comme matrice à base de LAMP-identification de l'espèce Eimeria. Des échantillons de tissus intestinaux pour l'analyse de diagnostic sur le terrain doivent être recueillies pendant post-mortem de routine comme décrit ici.
- Choisir l'article (ou les articles) de l'intestin à tester. Voir le tableau 1 pour un guide à la sélection du site de l'échantillon et les espèces Eimeria les plus susceptibles d'être présents 18 et Figure 1 pour l'aire de répartition et l'emplacement des sites d'échantillonnage spécifiques à l'espèce.
NOTE: Ce est d'une importance capitale depuis Eimeria sont notamment site hôte spécifique. Chaque espèce qui infecte des poulets est défini par la région intestinale qu'il cible 19. La décision peut être influencée par l'expérience précédente de la ferme, l'intérêt pour un ou more espèces Eimeria spécifiques ou d'autres indicateurs de diagnostic 6. - Accise 5 cm ou plus grandes longueurs de la section intestinal (s) sélectionné pour tester Eimeria l'aide de ciseaux ou d'un scalpel stérile. Eventuellement, stocker les échantillons pour une analyse ultérieure dans un fixateur tel que par exemple dans le RNAlater 18 ou 95% d'éthanol.
NOTE: Si le stockage dans de l'éthanol, l'échantillon doit être soigneusement lavés à l'acide tris-éthylènediaminetétraacétique stérile (TE) tampon avant de les utiliser. - Couper l'échantillon ouverte longitudinalement, retirer contenus les plus intestinales (si présente) et gratter les cellules de la couche de muqueuse gratuitement en utilisant soit le bord d'une lame de microscope en verre stérile ou une lame de ciseaux éthanol / flamme stérilisé. Eventuellement pour un échantillon groupé inclure les cellules de tous les quatre des sites intestinales spécifiques à l'espèce dans un seul tube.
- Mettez le matériau raclé dans un tube de centrifugation de 1,5 ml vis-top stérile contenant tampon TE stérile 100 pi y compris une0% (p / v) de résine Chelex 100.
- Agiter chaque échantillon vigoureusement pendant 1 min. Assurez-vous que le haut de la vis est bien fermé, puis incuber dans un bain d'eau bouillante pendant 10 min.
- Après avoir fait bouillir permettre à chaque échantillon à refroidir à la température ambiante pendant 1 à 2 min.
- Centrifugeuse chaque échantillon en utilisant une microcentrifugeuse à vitesse de pointe (par exemple, ~ 10 000 xg) pendant 1 min.
- Recueillir 2 pi du surnageant résultant d'être modèle dans chaque test LAMP à entreprendre. Eventuellement, en commun plus d'un site intestinale dans un seul tube pour fournir un dosage multi-site.
2. Eimeria LAMP Primer Préparation (pré-test)
- Préparer Eimeria LAMP stocks amorces adéquates pour 100 dosages:
- Reconstituer chaque amorce Eimeria LAMP lyophilisée par addition d'eau moléculaire de qualité à une concentration de 100 uM (comme spécifié par le fabricant). Si non spécifié, calculer le volume d'eau nécessaire pour la biologie moléculaire using les Les poids physiques et moléculaires de chaque amorce.
- Pipette 60 pi d'eau de la biologie moléculaire dans un 0,5 ml flip-top microtube distinct pour chaque espèce Eimeria à doser.
- Ajouter amorces FIP, BIP, F3, B3, LF et LB spécifique de l'espèce Eimeria cibles à l'eau en utilisant les volumes indiqués dans le tableau 2, la création d'une série de mélanges d'amorces spécifiques sept espèces.
- Brièvement vortex mélanger la solution d'apprêt, puis impulsion microcentrifugeuse et congeler jusqu'à utilisation.
- Préparer un mélange maître de réaction de LAMP pour chaque espèce Eimeria à tester. Multipliez les volumes sont indiqués dans le tableau 3 par le nombre d'échantillons et ajouter trois à un contrôle positif, le contrôle négatif et pipetage rechange. Pipette, dans un 0,5 ou 1,5 ml flip-top microtube.
3. Eimeria LAMP Assay
- Espèces spécifiques ADN polymérase Bst / LAMP pipette 23 ul Eimeria Mastermix dans un 0.5 ml de tube à centrifuger.
- Ajouter matrice d'ADN de 2 pi (préparé à l'article 1), soit un volume de réaction final de 25 ul.
- Ajouter ADN génomique 2 pl Eimeria espèces spécifiques à une réaction (contrôle positif). Ajouter de l'eau pour la biologie moléculaire 2 pi à la réaction (contrôle négatif).
NOTE: Si l'ADN génomique spécifique de l'espèce ne est pas disponible LAMP précédente positif ou un produit PCR standard peuvent être utilisés à la place. - Incuber dans un bain d'eau ou d'un bloc thermique à 62 ° C pendant 30 min. Eventuellement, de réactiver la polymérase Bst ADN par chauffage à 80 ° C pendant 10 min si la réaction ne est pas va être lu immédiatement.
4. LAMP Lire test-out
- À la fin de l'incubation d'évaluer la couleur de chaque réaction à l'œil sous la lumière intérieure. Les résultats négatifs sont en rose au violet en couleurs, des résultats positifs apparaissent ciel bleu 20.
- Eventuellement, confirmer le résultat d'analyse de LAMP dans un laboratory en mélangeant le produit réactionnel d'LAMP 5 ul avec une pi de tampon de gel de l'ADN de chargement pour l'électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant un gel d'agarose à 2% dans 1 x Tris / Borate / EDTA (TBE), pré-colorées en utilisant un colorant d'acide nucléique (5 ul par 50 ml d'agarose). Ajouter 5 ul d'une moléculaire échelle d'ADN de taille 1Kb à la piste 1 du gel pour permettre le calcul de la taille des fragments.
Résultats
la validation de la Assay
Lors de la validation de chaque test LAMP spécifique de l'espèce Eimeria été testé en utilisant un panel d'échantillons d'ADN pur représentant les sept espèces d'Eimeria qui infectent le poulet, ainsi que l'ADN génomique de poulet comme un contrôle hôte. Une électrophorèse sur gel d'agarose a été utilisée pour chaque essai et résoudre démontré absolue spécificité d'espèce hôte sans réactivité croisée 18. Ensuite, une fois dix séries de dilution en série préparé en utilisant Eimeria tenella purifié l'ADN génomique a révélé une limite de sensibilité du dosage comprise entre un et dix copies de génome 18. Aucune limite supérieure a été déterminée avec des résultats positifs obtenus jusqu'à et y compris la plus forte concentration (100 000 copies du génome) 18.
Application aux échantillons de terrain
Les échantillons prélevés pour les tests Eimeria sont susceptibles d'être dérivé de poulets trouvés morts, abattus à la suite de pplancher santé ou abattus pour la surveillance de la santé sentinelle, indiquant une taille de l'échantillon susceptible d'entre un et trois lorsqu'une partie d'une routine. Test de trois oiseaux prélevés dans une ferme de poulets de chair US dans le cadre d'un programme de surveillance a donné trois séries d'échantillons intestinaux. Application des spécifiques aux espèces LAMP essais ciblée, la priorité des sites intestinaux préférés pour chaque espèce Eimeria (tableau 1), a permis l'identification visuelle de l'infection eimerian chez tous les oiseaux testés en utilisant hydroxynaphthol bleu comme un indicateur (figure 2A). La couleur obtenue avec une réaction LAMP négative lors de l'utilisation du bleu de hydroxynaphthol peut varier du violet au rose, mais est toujours distinct du bleu réalisé par un résultat positif. Confirmation par électrophorèse sur gel d'agarose a donné des résultats comparables (figure 2B). Lors de l'application sur le terrain, l'utilisateur peut choisir d'appliquer le plein écran contre tous les sept espèces, ou cibler uniquement les espèces prioritaires queimportante ou connue circulant sur la ferme ou dans les environs.
L'échec des approches basées sur la PCR de se établir en tant que diagnostic de l'apparition de Eimeria souligne l'exigence de simplicité dans tout nouveau test. Alors que LAMP propose une préparation simple et le traitement que la PCR, l'obligation de tester plusieurs sites intestinaux par oiseau reste décourageant. La production d'un seul échantillon d'ADN groupé par oiseau, qui peut ensuite être testé avec un ou plusieurs tests de lampe, est susceptible d'être plus attrayant. Traitement d'un échantillon regroupé par oiseau, la matière recueillie à partir de chacun des sites intestinaux spécifiques décrites dans le tableau 1 et regroupées avant la préparation de l'ADN, pour l'essai avec l'ensemble des sept essais de LAMP représentant à condition que le même résultat que lorsque chaque site intestinal a été générée séparément (figure 2 par rapport à la figure 3).
Figure 1. intestinaux sites d'échantillonnage pour la détection de LAMP de Eimeria parasites des espèces qui infectent les poulets. Les régions intestinales ciblées par chaque espèce Eimeria est mis en évidence par les lignes colorées, avec les sites préférés d'échantillonnage indiquée par le nombre entre les lignes noires pointillées (E. acervulina: jaune / 1, E. brunetti: rose / 2, E. maxima: bleu / 3, E. mitis: orange / 4, E. necatrix: rouge / 5, E. praecox: vert / 6 et E. tenella: gris / 7). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. LAMP diagnostic de l'infection vient eimerianm trois poulets de chair commerciaux. réactions LAMP résolus en utilisant (A) hydroxynaphthol bleu, où une réaction bleu ciel était positif et un violet au rose réaction était négative, et électrophorèse sur gel (B) d'agarose. Les sites de l'intestin de l'échantillon étaient présentés dans le tableau 1 pour chaque espèce de parasite. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. Mitis, N = E. necatrix, E. P = praecox et E. T = tenella. Lane 1 contenait l'échelle GeneRuler ADN 1Kb. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. LAMP diagnostic de l'infection en utilisant eimerian réac LAMP rassemblé des échantillons de trois poulets de chair commerciaux distincts.tions résolu en utilisant bleu hydroxynaphthol, où une réaction bleu ciel était positive et violet au rose réaction était négative. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. Mitis, N = E. necatrix, E. P = praecox et E. T = tenella. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| site de l'échantillon | Eimeria dosage des espèces (le plus probable) |
| Duodénum (D) | E. acervulina, E. praecox |
| Jéjunum / iléon * (J / I) | E. maxima, E. necatrix |
| Caecum (C) | E. necatrix, E. tenella |
| Iléon terminal (TI) | E. brunetti, E. mitis |
| Échantillon groupé (P) | E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella |
Tableau 1. intestinale sélection spécifique à la région du candidat Eimeria essais d'espèces. Le choix de la région à échantillonner varie pour chaque espèce Eimeria comme illustré sur la figure 1. Échantillons communs comprennent matériel recueilli des quatre sites spécifiques qui ont ensuite été combinés pour la préparation d'ADN.
| Primer * | concentration en Stock (M) | Volume (pi) |
| Eau | - | 60 |
| Amorce interne avancée (FIP) | 100 | 40 |
| Pri arrière intérieuremer (BIP) | 100 | 40 |
| Primer externe avancée (F3) | 100 | 10 |
| Primer extérieur vers l'arrière (B3) | 100 | 10 |
| Boucle avant (LF) | 100 | 20 |
| Boucle arrière (LB) | 100 | 20 |
| Total | 200 |
Tableau 2. Préparation d'un prémélange LAMP primaire. Les composants et les proportions nécessaires pour préparer un prémélange amorce pour LAMP. Les volumes sont présentés pour 100 réactions LAMP. * Identités Primer comme indiqué dans les matériaux et Barkway et al (2011) 18.
| Stock conc n | Réaction final n conc | Volume par réaction (ul) | |
| DDW | - | - | 10,1 |
| Tampon Thermopol | 10 x | X 1 | 2,5 |
| MgSO 4 | 100 mM | 2 mM | 0,5 |
| Mélange Primer * | Tableau 2 | 2,5 | |
| dNTP | 25 mM | 400 uM | 0,4 |
| Bétaïne | 5 M | M 1 | 5 |
| Hydroxynaphthol bleu | 3 mM | 120 pM | 1 |
| L'ADN polymerase de Bst | 8000 U / ml | 8 U | 1 |
| Total | 23 | ||
Tableau 3. Préparation d'un LAMMastermix P de réaction. * Eimeria spécifique à l'espèce.
Discussion
Les tests LAMP spécifiques à l’espèce Eimeria décrits dans cet article offrent une nouvelle trousse d’outils de diagnostic à l’appui d’un contrôle efficace des coccidies et de la maladie coccidiose. Les conséquences de l’infection par l’infection à Eimerian peuvent inclure de graves pertes économiques ainsi qu’une grave compromission du bien-être des oiseaux et une sensibilité accrue à la colonisation par des agents pathogènes zoonotiques21. La possibilité de surveiller les troupeaux pour détecter la présence de certaines ou de toutes les espèces d’Eimeria peut fournir un avertissement précoce d’une défaillance de l’efficacité de la lutte contre les anticoccidians. Les principaux avantages de LAMP comprennent une spécificité de cible robuste, résultant de la nécessité de six cibles de séquence d’ADN différentes, ainsi qu’une sensibilité élevée, renforcée par l’inclusion d’amorces de boucle13, bien que la nature qualitative et non quantitative de LAMP puisse être considérée comme une limitation. Il n’est actuellement pas possible de distinguer l’échappement parasitaire de faible niveau de la chimioprophylaxie de routine ou la réplication du vaccin vivant de la réplication eimérienne non contrôlée. Néanmoins, la facilité technique du protocole et la lecture définitive offrent une amélioration considérable par rapport aux approches spécialisées existantes et souvent subjectives axées sur la pathologie et la morphologie6,7. Chaque test peut être réalisé pour un coût de ~0,75 £ par échantillon, indépendamment des dépenses de main-d’œuvre et d’installation de l’équipement. Ainsi, les tests LAMP sont également plus rentables que d’autres diagnostics moléculaires tels que la PCR, car ils nécessitent une incubation isotherme sans avoir besoin d’équipement spécialisé.
Pendant de nombreuses années, l’accès à l’ADN génomique d’Eimeria en tant que matrice a limité le développement et l’application des diagnostics moléculaires sur le terrain. L’oocyste est la phase la plus facilement accessible du cycle de vie de l’Eimerian, mais l’extraction régulière de l’ADN nécessite des installations de laboratoire22. D’autres étapes du cycle de vie intestinal, plus labiles, nécessitent une purification avant la préparation de l’ADN pour prévenir l’inhibition de la PCR et une perte de sensibilité conséquente23,24. La capacité d’extraire de l’ADN eimérien d’une qualité adaptée au LAMP à l’aide d’un équipement pas plus spécialisé qu’une microcentrifugeuse et un bain-marie, complété par une adsorption inhibitrice à l’aide de résine chelex, favorise désormais l’utilisation plus large de la biologie moléculaire dans le diagnostic eimérien. Curieusement, la détection rapportée d’ADN d’Eimeria mesurable par PCR quantitative dans le tissu intestinal 20 jours après le début de l’infection parasitaire, 11 jours après la dernière sortie d’oocyste détectable, suggère que la LAMP peut être utilisée pour détecter l’exposition au parasite résolue ainsi que l’infection en cours, même après que toute lésion visible ait pu être résolue25.
Le coût relativement faible et les faibles exigences techniques des diagnostics LAMP Eimeria peuvent favoriser leur application dans les pays en développement où d’autres approches plus établies peuvent ne pas être disponibles ou appropriées. Pour que cela soit applicable, chaque test doit être capable de détecter toutes les souches qui peuvent circuler dans chaque région. Bien que la compréhension de la diversité génétique prévalant parmi les espèces d’Eimeria soit limitée26, l’utilisation de séquences cibles précédemment validées pour une utilisation en PCR quantitative avec des souches d’Afrique, d’Asie, d’Europe et d’Amérique du Sud fournit des preuves de conservation, soutenant l’utilité de ces tests LAMP dans le mondeentier 10.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les travaux réalisés dans le cadre de cette étude ont été soutenus en partie par le Collège royal vétérinaire par l’intermédiaire du Fonds pour les projets de recherche des étudiants, ainsi que par le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques et le Département du développement international (subvention numéro BB/H009337/2). Ce manuscrit s’est vu attribuer la référence PPB_00795 par la CVR.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RNAlater | Ambion | AM7024 | |
| Éthanol | VWR Chemicals | 20821.321 | Attention, hautement inflammable |
| 100 x Tris-EDTA (TE) concentré | Sigma-Aldrich | T9285 | |
| Chelex 100 | résine Bio-Rad | 142-1253 | |
| Eau de qualité moléculaire | Invitrogen | 10977035 | |
| E. acervulina F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTAACATTTCGCTTCACGGAC |
| E. acervulina B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATGAGCAAGTGGAACACCTTG |
| E. acervulina FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT |
| E. acervulina BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG |
| E. acervulina LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TAAGGTTACACCCGTGGAGG |
| E. acervulina LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCATGCACAACAACAGCGACTT |
| E. brunetti F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GGCCATCAAGTTCCATGAGC |
| E. brunetti B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCAACCCTGAGTGTGTGTT |
| E. brunetti FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | * GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT |
| E. brunetti BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC |
| E. brunetti LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAACGCTCGAACATGGC |
| E. brunetti LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CTTCTCCACAGACCCAGAGGT |
| E. maxima F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | * ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT |
| E. maxima B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG |
| E. maxima FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG |
| E. maxima BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTA |
| E. maxima LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | * CAAGCCTACGCGGACATC |
| E. maxima LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TTATGCAGCTGGGTCAACG |
| E. mitis F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACGATAGCCAAGACACGTAAGG |
| E. mitis B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA |
| E. mitis FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT |
| E. mitis BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG |
| E. mitis LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCCATGCATCCCCTTGTT |
| E. mitis LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGTGGGCACAGATTGATTC |
| E. necatrix F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TGGCTTTCCCGCGTACC |
| E. necatrix B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGGCCCAACACAAAGACTG |
| E. necatrix FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA |
| E. necatrix BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC |
| E. necatrix LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCTGTAACTTGGGACGTTGT |
| E. necatrix LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAACAGCCGGAGCCTCTC |
| E. praecox F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT |
| E. praecox B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCGCACGAATCTGAATCACAC |
| E. praecox FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATCTCCTCAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGGGCTATATCCATAGG |
| E. praecox BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT |
| E. praecox LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAATAGCATTGCCAGGTGG |
| E. praecox LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC |
| E. tenella F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTTGTGAAGGTCAGCGTG |
| E. tenella B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | * E |
| . tenella FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT |
| E. tenella BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT |
| E. tenella LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCATGTGCAGTTGAGACA |
| E. tenella LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG |
| 10 x ThermoPol | buffer New England Biolabs | B9004S | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| dNTPs | Promega | U1330 | |
| Bbetaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Bst polymérase | New England Biolabs | M0275S | |
| Sigma-Aldrich | 33936 | Dissous dans de l’eau de qualité moléculaire. | |
| Agarose UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | |
| 10 x tampon Tris/Borate/EDTA (TBE) | Invitrogen | AM9863 | |
| Colorant de chargement d’ADN bleu/orange (x6) | Promega | G1881 | |
| GeneRuler 1Kb Échelle d’ADN | Thermo Scientific | SM0313 | |
| SafeView colorant d’acide nucléique | NBS Biologicals | NBS-SV |
Références
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- Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M. The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination. Adv Parasitol. 60, 285-330 (2005).
- Fornace, K. M., et al. Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken farms in Africa and indication of economic profitability. PLoS ONE. 8 (12), e84254(2013).
- Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. Genomic analysis of Eimeria spp. populations in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina. J Parasitol. 95 (4), 871-880 (2009).
- Peek, H. W., Landman, W. J. Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other prevention strategies. Vet Q. 31 (3), 143-161 (2011).
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Réimpressions et autorisations
