La souris fil de l'artère fémorale modèle de lésion de resténose est techniquement difficile. Dans ce protocole, nous détaillons les principaux détails techniques essentiels à l'exécution avec succès des blessures de fil pour induire la néo-intima cohérente pour les études de la resténose.
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Article de méthode
Un modèle murin de la resténose artérielle: les aspects techniques de fémur fil blessures
Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie cardiovasculaire causée par l'athérosclérose est la principale cause de décès dans le monde développé. Rétrécissement de la lumière du vaisseau, en raison du développement de la plaque d'athérome ou la rupture de plaques établies, interrompt le flux sanguin normal menant à diverses morbidités telles que l'infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Dans les procédures endovasculaires cliniques telles que l'angioplastie sont couramment effectuées à rouvrir la lumière. Cependant, ces traitements inévitablement endommager la paroi du récipient ainsi que l'endothélium vasculaire, le déclenchement d'une réponse de cicatrisation excessive et le développement d'une plaque néo-intimale qui se étend dans la lumière provoquant la resténose des vaisseaux (re-rétrécissement). Resténose reste une cause majeure de l'échec des traitements endovasculaires pour l'athérosclérose. Ainsi, les modèles animaux précliniques de resténose sont d'une importance vitale pour l'étude des mécanismes physiopathologiques ainsi que la traduction des approches aux interventions vasculaires. Parmi plusieurs experime murinmodèles NTAL, blessures de fil de l'artère fémorale est largement acceptée comme le plus approprié pour les études de la resténose post-angioplastie parce qu'il ressemble étroitement à la procédure d'angioplastie qui blesse deux endothélium et paroi de la cuve. Cependant, de nombreux chercheurs ont de la difficulté en utilisant ce modèle en raison de son haut degré de difficulté technique. Ce est principalement à cause d'un fil métallique doit être insérée dans l'artère fémorale, ce qui est environ trois fois plus mince que le fil, pour générer une blessure suffisamment importante pour induire la néo-intima. Ici, nous décrivons les détails chirurgicaux essentiels pour surmonter efficacement les difficultés techniques majeures de ce modèle. En suivant les procédures présentées, effectuer la blessure de fil de l'artère fémorale de la souris devient plus facile. Une fois familiarisé, toute la procédure peut être terminée en 20 min.
Introduction
À l’ère de l’application élargie des traitements endovasculaires pour diverses maladies cardiovasculaires, la resténose après angioplastie est l’un des problèmes majeurs pour les patients subissant de tels traitements. Les dommages à l’endothélium vasculaire au moment de l’angioplastie, de concert avec le fond athérosclérotique, induisent une prolifération excessive de cellules musculaires lisses dans la couche médiale, entraînant une hyperplasie néointimale. 1,2 Un modèle animal viable qui récapitule l’hyperplasie néo-intimale post-angioplastie est donc important non seulement pour l’étude des mécanismes de la maladie, mais aussi pour le développement de traitements efficaces pour traiter cette pathologie.
Les souris représentent un excellent animal modèle pour récapituler l’hyperplasie néointimale pour les raisons suivantes : les antécédents génétiques des souris expérimentales sont bien établis ; une grande variété de souches génétiquement modifiées sont disponibles ; 2 obtenir des compagnons de portée du même milieu est facile ; Et le coût des animaux est relativement faible. Le modèle de ligature artérielle et le modèle de lésion par fil sont les deux modèles murins les plus courants d’hyperplasie néo-intimale induite mécaniquement. Le modèle de ligature artérielle est facile à créer, mais physiologiquement différent de la procédure d’angioplastie réelle. Le modèle de lésion par fil imite étroitement les procédures d’angioplastie réelles, mais est techniquement difficile en raison de la petite taille des artères de souris. 2,3 Sata et al. ont d’abord décrit une méthode de lésion par fil pour les artères fémorales de souris basée sur la structure anatomique du système vasculaire et l’utilisation d’un fil flexible de taille appropriée. En utilisant cette technique, ils ont réussi à induire de manière reproductible une hyperplasie néo-intimale chez diverses souches de souris. 4
Bien que la lésion par fil fémoral soit un modèle bien établi, certains des aspects techniques de la technique sont très difficiles par rapport à d’autres modèles tels que la ligature. 5 Le but de cet article est de décrire en détail les procédures de notre modèle de blessure au fil de souris, qui est une version modifiée de la méthode originale de Sata. Nous avons apporté deux modifications principales : 1) Boucler uniquement les artères, et 2) Pas d’utilisation de lidocaïne.
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Protocole
Déclaration de l'éthique: NOTE: Toutes les procédures sont conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press, 8e édition, 2011), et les protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université du Wisconsin. Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie à l'isoflurane (par inhalation, débit 2 ml / min), et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Les animaux ont été euthanasiés dans une chambre progressivement rempli de CO 2.
1. L'induction de l'anesthésie générale et incision de la peau
- Utilisez mâle C57BL / 6 avec un âge de 12 à 16 semaines et le poids de 23-28 g. Anesthésier l'animal par l'isoflurane à travers un appareil d'anesthésie en circuit fermé. Confirmez anesthésie appropriée en pinçant son orteil. Appliquer un peu de larmes pommade artificielle sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
- Placez la souris dans une position couchée avec le membre postérieur gauche légèrement enlevé et l'articulation du genou slightly fléchie. Raser les cheveux autour de la partie supérieure de la cuisse gauche et désinfecter la peau avec de chlorhexidine, appliqué trois fois à l'aide de coton stérile applicateurs à pointe. Utilisez un stérilisateur à billes chaude pour garder les instruments stérilisés pendant la chirurgie.
- Placez un drap de gaze stérile sur la jambe gauche. Faire une incision de la peau longitudinale 1,5 cm droite sur la cuisse gauche médial de l'articulation du genou à l'aine (figure 1A).
2. L'exposition de l'artère fémorale et Branches
REMARQUE: la figure 1B montre l'anatomie du système vasculaire brute dans le haut de la cuisse. L'artère fémorale superficielle (AFS) peut être observée à travers un microscope à dissection lorsque l'incision de la peau est correctement établie le long de la ligne médiane de la cuisse médiale.
- Ouvrez l'aponévrose mince recouvrant la SFA avec des pincettes fines et ensuite en boucle avec la SFA 9-0 suture en nylon.
NOTE: Dans ce processus, le nerf fémoral est facilement mis enide, mais la veine fémorale adjacente nécessite une attention particulière parce que son mur est si mince qu'il perfore facilement et saigne. La technique est essentiel de se concentrer sur l'artère elle-même; tant que la dissection est réalisée tout près de l'artère, la veine tout dommage accidentel est évitable. - Une fois la SFA est bouclée, maintenez la suture avec une pince de moustiques et tirez-le légèrement vers le bas. Cette manœuvre permet en outre la dissection plus facile, mais pour éviter d'endommager l'artère ne tirez pas trop fort.
- Continuer dissection de l'artère proximale pour exposer et boucle l'artère fémorale commune (CFA) avec 9-0 suture en nylon.
NOTE: Habituellement, bouclage de la CFA à un point en aval de l'artère épigastrique (figure 1B) est assez pour l'insertion de fil. Maintenez la boucle de suture CFA avec une pince de moustiques de la même façon. - Tirez la boucle de suture CFA vers le haut et la boucle de suture SFA vers le bas pour découvrir la bifurcation de SFA et l'artère fémorale profonde (DFAE). Le DFAE, la branche principale de la CFA,va vers le muscle de la cuisse (figure 1B).
NOTE: Le fil sera inséré de la DFA tard. - Boucle de la DFA avec prudence parce que la veine adjacente est emmêlé sous l'artère. En cas de saignement de la veine, un 30 à 60 sec compression simple avec de la gaze est généralement suffisante pour produire l'hémostase.
- Une fois que le DFAE est bouclée avec 9-0 suture en nylon, assurez-vous tous les trois boucles de suture sont à leurs positions correctes (figure 2A).
- Procéder à la dissection de la DFA distale pour ligaturer l'artère en un point aussi loin que possible de la bifurcation. Couper suture supplémentaire, mais laisser une certaine longueur de sorte que les deux extrémités peuvent être tenus avec des pinces de moustiques, qui stabilisent le DFAE que l'insertion de fil plus facile.
3. Création fil blessures
- Insérez fil via DFA
- Égoutter les sutures CFA, SFA et DFA d'établir un hémostatique temporaire.
- Faire un petit trou dans le DFA avec microciseaux. Insérez les conseils des courbes micropince pour dilater le trou assez grand pour un fil d'un diamètre de 0,015 pouces (figure 2B montre la différence de taille entre l'artère et le fil).
- Avant de faire un trou dans le DFA, desserrer la boucle de suture CFA et doucement serrer / presser le DFAE plusieurs fois avec micropince ternes pointe. Cette manœuvre élargit le diamètre artériel remarquable pour faciliter l'insertion de fil. Humidifiant à fond le fil avec du PBS est également important pour une insertion en douceur.
- Lorsque vous faites un trou dans le DFAE, ne pas recadrer la paroi artérielle, mais faire un petit pincement en forme de V et pincer le rabat avec micropince bout pointu pour la manipulation.
- Insérez le fil dans le trou suffisamment dilaté sur la DFA. Avancer doucement le fil vers l'artère iliaque tout en desserrant la boucle de suture autour de la CFA. 5-8 mm est suffisant pour couvrir toute la longueur CFA dans la plupart des cas (figure 2C ). Ne pas insérer le fil de force comme une perforation artérielle se traduit généralement par la perte de la souris. Raccourcir le fil à environ 15 mm de longueur aide à la manutention.
- Laisser le fil à l'intérieur pour une Min
- Après avoir inséré le fil à la longueur optimale, laisser pendant 1 min de surexploiter la paroi artérielle. Humidifiez le fil et les artères avec du PBS pour éviter le dessèchement. Un autre suture 9-0 en nylon peut être placé autour de la DFA proximale au point d'insertion de fil pendant ce temps d'attente. Cette suture sera utilisé plus tard pour fermer le trou sur le DFAE après le retrait du fil.
- Récupérer fil et reprendre le flux sanguin
- Maintenez le fil avec une pince navire de cathétérisme, et tirez doucement le dos; le fil doit être récupéré en douceur. Pour surmonter toute résistance, généralement causée par l'adhésion du fil à la paroi artérielle, tirant le fil avec une légère rotation est utile. Encore une fois, une manœuvre de force pourrait entraîner la perte de l'animal.
- Unprès avoir récupérer le fil, ligaturer les DFA au point de bifurcation avec une suture 9-0 en nylon. Ne pas ligaturer trop près de la bifurcation, ce qui mettrait en péril l'écoulement du sang à la SFA.
- Desserrez les boucles de suture SFA et CFA de reprendre le flux sanguin normal. Notez que le CFA est bien élargi par insertion de fil (figure 2D).
4. peau fermeture et Soins postopératoires
- Contrôle saigne. Suintement mineur peut être arrêté par compression simple; certains saignements majeurs artérielles nécessiteront points avec une suture de nylon 11-0. Ces artères suturées finiront par entraîner une occlusion artérielle.
- Fermez la peau enroulée avec agrafeuses cutanées (habituellement 3-4 agrafes). Gardez la surface de la plaie stérilisé par application de la solution de chlorhexidine chirurgicale.
- Appliquer les traitements post-opératoires. Contrôler la douleur de la souris avec des injections sous-cutanées de la buprénorphine. Garder la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu'il ait retrouvé sufFicient conscience de maintenir décubitus sternal. Maison dans une cage propre, sans compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que complètement rétabli.
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Résultats
Quatre semaines après la chirurgie, récoltent l'artère fémorale fil blessés et font un spécimen de blocs de paraffine pour analyser la formation de néo-intima. Induire une anesthésie générale comme décrit ci-dessus. Ouvrir la poitrine immédiatement et insérer une aiguille de papillon de calibre 20 au ventricule gauche. Connectez la ligne à une bouteille de perfusion. Effectuer perfusion fixation par perfusion goutte à goutte de PBS suivi par 4% de paraformaldéhyde (généralement de 10 à 20 ml chacune). La bo...
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Discussion
La procédure de blessures de fil est applicable à toutes les souches de souris aussi longtemps que leurs structures anatomiques sont similaires. 4 Dans cet article, nous avons utilisé mâle C57BL / 6 avec un âge de 12 à 16 semaines. Comme nous l'avons appris de nos études préliminaires, les artères fémorales de souris âgés de moins de 10 semaines sont souvent si petite que l'insertion de fil est assez difficile. D'autre part, l'insertion du fil dans des souris âgées de 16 semaines est technique...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une bourse de nouveau chercheur du programme de partenariat du Wisconsin (ID 2832), une subvention R01 du National Heart, Lung, Blood Institute (HL-068673) et une subvention de formation T32 (HL-110853). Nous remercions le groupe de la Dre Melina Kibbe de l’Université Northwestern de nous avoir fourni des informations utiles.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Guide de fil à âme fixe | Cook | G02426 | Diamètre 0,015 pouce, |
| Pince à dilatation | Roboz | RS-4927 | Pointes incurvées, émoussées |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Pointes droites, pointues |
| Dumont Vessel Cantile Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Ciseaux | World Precision Instruments | 501234 | |
| Pince à moustiques | World Precision Instruments | 501291 | |
| Suture en nylon Ethilon 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Monofilament en nylon noir |
| Micro AROSuture, Stérile 11-0, 70 micromètres, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Monofilament en nylon noir |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Agrafeuse | 3M | DS-25 |
Références
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
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