Analyse de l&#39;autophagie dans<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; À l&#39;aide de famine Pads en association avec microscopie de fluorescence

Résumé

Une méthode pratique et puissante pour étudier l’autophagie chez Penicillium chrysogenum en utilisant des coussinets de famine (mélanges d’agarose et d’eau du robinet dans une lame de microscope contenant une cavité centrale) est présentée ici.

Résumé

L’étude des systèmes cellulaires de contrôle de la qualité est apparue comme un domaine de recherche contemporain très dynamique et pertinent. Il est devenu clair que les cellules possèdent plusieurs lignes de défense contre les dommages causés aux molécules biologiquement pertinentes comme les acides nucléiques, les lipides et les protéines. En plus de la dynamique des organites (fusion/fission/motilité/hérédité) et de l’activité étroitement contrôlée de la protéase, la dégradation des organites excédentaires, endommagés ou compromis par l’autophagie (« auto-alimentation » cellulaire) a reçu beaucoup d’attention de la part de la communauté scientifique. La régulation de l’autophagie est assez complexe et dépend de facteurs génétiques et environnementaux, dont beaucoup n’ont pas encore été élucidés. Ici, une nouvelle méthode est présentée qui permet d’étudier facilement l’autophagie chez le champignon filamenteux Penicillium chrysogenum. Il est basé sur la croissance du champignon sur ce que l’on appelle des « coussinets de famine » pour stimuler l’autophagie de manière reproductible. Les échantillons sont directement dosés par microscopie et évalués pour l’induction / la progression de l’autophagie. Le protocole présenté ici n’est pas limité à une utilisation avec P. chrysogenum et peut être facilement adapté pour une utilisation chez d’autres champignons filamenteux.

Introduction

Les champignons filamenteux sont d'excellents systèmes modèles pour l'étude des processus de développement. Ils offrent plusieurs avantages expérimentaux comme la culture pas cher, un grand nombre de descendants et l'accessibilité génétique. Le dernier point est particulièrement important pour la construction de transformants qui permettent enquête l'importance des gènes so-far non caractérisées pour divers mécanismes cellulaires. Les champignons filamenteux ont joué un rôle pour l'élucidation de plusieurs éléments et les mécanismes de voies cellulaires de contrôle de la qualité comme l'activité de la protéase de la dégradation des protéines a....

Protocole

1. Préparation de P. chrysogenum pour les expériences de famine

1. Si l'P. chrysogenum souche d'intérêt est maintenu sur le riz ('de riz vert »), placez 2-3 grains de riz recouvertes de sporulation mycélium dans un tube de 1,5 ml. Remplir avec 500 ul YGG (10 g / l de KCl, 20 g / l de glucose, 10 g / l de base azotée de levure, 5 g / l K ₂ HPO _4, 20 g / l d'extrait de levure).
   1. Vortex le tube pendant 30 secondes afin que les spores peuvent se détacher du riz efficacement.
   2. Incuber le tube pendant 1 jour à la température ambiante (par exemple entre 20 et 25 ° C).
   3. Prépare....

Résultats

Pour démontrer l'utilité du protocole détaillé ci-dessus dégradation des peroxysomes dans le P. chrysogenum souche Ws54-1255 (GFP-SKL) a été analysée. Dans cette souche GFP-SKL est généralement importé dans les peroxysomes ^neuf. Cela se traduit par l'apparition de multiples formes sphériques quand l'échantillon est analysé par microscopie à fluorescence. Si l'autophagie se produit, vacuoles agrandir. GFP-SKL est incorporé dans des vacuoles par autophagie (pexophagy). En raison du fait.......

Discussion

La méthode présentée ici permet l'étude pratique et reproductible de l'autophagie dans P. chrysogenum. Par exemple, il peut être utilisé pour le criblage de l'efficacité des différents composés se ils sont capables de moduler la réponse de l'autophagie de ce champignon ou non. Les résultats démontrent que la rapamycine avec inhibition de la signalisation TOR conduit à une induction marquée de l'autophagie dans P. chrysogenum qui a également été démontré pour d'autres organismes .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames de microscope avec cavité centrale	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne	H884.1	Celles-ci peuvent être utilisées plusieurs fois après le nettoyage.
Perles de verre	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne	A553.1	Diamètre : 0,25 - 0,50 mm