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Article de méthode

Neural activité Propagation dans un hippocampe Préparation déplié avec un pénétrant Micro-réseau d'électrodes

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DOI :

10.3791/52601

⸱

27 mars 2015

 ,  ,  , 
1Neural Engineering Center, Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un dépliée hippocampe in vitro qui préserve CA1-CA3 réseau de neurones. En combinaison avec le réseau de pénétration de micro-électrode, l'activité neuronale peut être contrôlée dans les deux orientations longitudinale et transversale. Cette méthode présente des avantages par rapport aux préparations de tranche de l'hippocampe que la propagation dans tout l'hippocampe peuvent être enregistrées simultanément.

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour la préparation d'une nouvelle préparation in vitro de l'hippocampe plat combiné avec une matrice de micro-usiné pour cartographier l'activité neuronale dans l'hippocampe. La préparation de l'hippocampe transversale de tranche est la préparation la plus courante de tissus pour étudier hippocampe électrophysiologie. Une tranche hippocampique longitudinale a également été élaboré afin d'enquêter sur les connexions longitudinales dans l'hippocampe. Les hippocampe de souris intactes peuvent également être maintenues in vitro parce que son épaisseur permet une diffusion adéquate de l'oxygène. Cependant, ces trois préparations ne fournissent pas un accès direct à la propagation de neurones depuis une partie du tissu est manquant ou plié. L'hippocampe intacte déplié fournit à la fois transversale et liaisons longitudinales dans une configuration à plat pour un accès direct au tissu d'analyser toute l'étendue de la propagation du signal dans l'hippocampe in vitro. Afin de surveiller efficacement l'activité neuronale de til couche de cellules, une coutume fait pénétrer réseau de micro-électrodes (PMEA) a été fabriqué et appliqué à l'hippocampe dépliée. Le PMEA avec 64 électrodes de 200 um de hauteur pourrait enregistrer l'activité neuronale au fond de l'hippocampe de souris. La combinaison unique d'une préparation hippocampique déplié et la PMEA fournit un nouvel outil in vitro pour étudier la vitesse et la direction de propagation de l'activité neuronale dans les régions bidimensionnelles CA1-CA3 de l'hippocampe avec un signal haute par rapport au bruit.

Introduction

La compréhension de la conduction nerveuse ou la propagation des signaux neuronaux est essentielle pour la détermination du mécanisme neuronal de la communication à la fois le fonctionnement normal et des états pathologiques dans le cerveau 1-3. L'hippocampe est l'une des structures les plus étudiés dans le cerveau, car il joue un rôle fondamental dans plusieurs fonctions cérébrales comme la mémoire, et le suivi spatial et est impliqué dans plusieurs changements pathologiques qui influent considérablement le comportement ainsi 1,6. Bien que, l'hippocampe présente une organisation complexe, les différents éléments de sa structure peuvent être facilement identifiés et accessibles dans la préparation de tranches 4-6. Dans le sens transversal de l'hippocampe, l'activité neuronale est connu pour se propager à travers la voie de tri-synaptique qui comprend le gyrus denté (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. On croit que la transmission synaptique et la conduction axonale jouent un rôle majeur pour communicatidans ce circuit transversal 4,6. Cependant, la propagation d'un signal neuronal a lieu dans les deux directions transversale et longitudinale 4,6. Cela implique que l'hippocampe ne peut pas être entièrement étudiée en utilisant des préparations de tranche qui limitent l'observation à une direction de propagation particulier quatre. La tranche longitudinale a été développé pour étudier les voies axonales long de l'axe longitudinal 5. Les chercheurs ont observé gamma et thêta oscillations spécifiques comportement principalement le long de la transversale et axes longitudinaux respectivement 6. Ces comportements ont été étudiés séparément, mais l'accès simultané à deux sens est crucial de comprendre ces comportements. Même avec le développement de la préparation de l'hippocampe intact, il est difficile de contrôler la propagation à travers le tissu en raison de l'ensemble de la structure repliée de l'hippocampe 4. L'hippocampe dépliée permet d'accéder aux neurones emballéssous une forme d'une couche de cellules à deux dimensions 7,8 plat.

Par déplier le gyrus denté (DG) (figure 1), l'hippocampe adopte une forme aplatie avec une configuration rectangulaire dans laquelle les deux transversal et liaisons longitudinales restent intactes avec la couche de cellules pyramidales disposé dans une feuille à deux dimensions contenant à la fois CA3 et CA1, laissant un morceau plat de tissu neural qui peut être utilisée pour étudier la propagation neural (figure 2) 8. L'activité neuronale peut alors être contrôlée avec des pipettes individuelles de verre, des réseaux de microélectrodes, des électrodes de stimulation, ainsi que des colorants sensibles à la tension (VSD) 3,7,8. En outre, l'indicateur de tension génétiquement codé à partir de souris transgéniques peut être utilisé pour suivre le motif de propagation neuf.

La configuration à plat du réseau hippocampique déplié est bien adapté pour enregistrement optique de la méthode mais aussi pour une matrice de microélectrodes. Most des tableaux disponibles dans le commerce sont fabriqués avec un profil plat ou à faible électrodes et peut enregistrer l'activité neuronale dans les deux tranches de tissu et des neurones en culture de 10 à 12. Cependant, le rapport signal-sur-bruit (SNR) diminue lorsque les signaux sont obtenus à partir d'un tissu intact depuis le soma des neurones sont situés plus profondément dans le tissu. matrices d'électrodes de microélectrodes avec des rapports d'aspect élevés sont nécessaires pour améliorer le SNR.

A cet effet, un réseau de microélectrodes de pénétration (PMEA) a été développé dans notre laboratoire, et fournit la capacité de la sonde directement dans le tissu 64 par l'insertion des pointes d'un diamètre de 20 um et 200 um de hauteur dans l'hippocampe 7,13 dépliées . Ce réseau de microélectrodes a SNR plus élevé par rapport à la formation d'image de colorant sensibles à la tension et le SNR reste stable lors d'une expérience 7,13. La combinaison de la préparation de l'hippocampe déplié et la PMEA fournit une nouvelle façon d'investirIgate la propagation neural sur un plan à deux dimensions. Des expériences utilisant cette technique ont déjà donné des résultats significatifs sur les mécanismes de propagation du signal neuronal dans l'hippocampe lequel l'activité neuronale peut se propager indépendamment des synapses synaptiques ou électriques 7.

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Protocole

NOTE: Animal protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'université. Souris CD1 des deux sexes à l'âge de P10 à P20 sont utilisés dans cette étude.

1. Les solutions pour la chirurgie expérimentale et enregistrement

  1. Préparer normale tampon liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) contenant (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, dextrose 10, et CaCl 2 2. Utiliser cette aCSF normale pour la récupération des tissus après dissection, ainsi que pour le système de lavage au début de l'expérience.
  2. Préparer aCSF saccharose qui est utilisé lors de la dissection de l'hippocampe et contient (mM): Saccharose 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1.3, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, dextrose 10, et CaCl 2 2. Afin d'induire une activité épileptiforme dans la préparation de tissu hippocampique intact, ajouter 4-aminopyridine (4-AP) à la normale à aCSFla concentration de 100 uM.

2. Procédure chirurgicale pour la Hippocampus Préparation Intact

  1. Déposez isoflurane (1 ml) dans la chambre au fond d'un bocal en verre de dessiccateur (n ° 1 des matières et équipements spécifiques) et utilisez une serviette en papier ordinaire pour couvrir la surface de l'étage inférieur si l'animal ne reçoit pas en contact avec le liquide. Ensuite, placez la souris CD1 dans le bocal et fermer le couvercle. Gardez l'animal dans le bocal fermé pendant environ 1 min à 2 min. Lorsque la fréquence de la respiration est d'environ un par seconde, enlevez la souris de la jarre.
  2. Placez la souris sur la scène de la chirurgie et de décapiter avec des ciseaux appropriés. Immédiatement après la décapitation, placer la tête dans la glace-froid (3-4 ° C), le saccharose oxygénée aCSF pendant environ 30 secondes.
  3. Utilisez des ciseaux fins (No.5 des matières et équipements spécifiques) pour enlever la peau sur le dessus du crâne et de couper le crâne long de la ligne médiane de la tête ainsi qu'à deux extrémités près le tempolobe ral. Utilisez une pince (n ° 6 des matières et équipements spécifiques) pour peler le crâne coupée vers chaque côté de la tête afin d'exposer le cerveau.
  4. Insérez un laboratoire micro spatule (n ° 8 des matières et équipements spécifiques) dans l'espace entre les lobes pariétaux du cerveau et du crâne, retirez avec précaution le cerveau à partir du bas du crâne, puis déposez-le sur un glacée préparée (3 -4 ° C) étape chirurgicale recouverte de papier filtre humide (n ° 2 dans les Matériaux et équipements spécifiques). Retirer le cervelet avec une lame refroidissement à la glace et on sépare les deux hémisphères en coupant la ligne médiane du cerveau. Ensuite, placer les deux hémisphères séparés dans un bécher rempli du saccharose aCSF glacée barboter avec 95% O 2/5% CO 2.
  5. Prenez la moitié de l'hémisphère et de place sur la scène de papier filtre glacée. Placez des serviettes en papier réguliers ou papier filtre autour du cerveau à sucer la solution supplémentaire. Utilisez deux outils de pipette en verre polies au feu (n ° 10 dans les matériaux etÉquipement) pour séparer le cortex du reste de la partie centrale du cerveau.
  6. Après l'hippocampe est exposée à l'intérieur du cortex et de mettre sur la scène glacée, placez deux ou trois gouttes de glacée de saccharose aCSF sur le tissu, puis enlever la solution supplémentaire autour de l'hippocampe. Couper les connexions avec le cortex à deux extrémités de l'hippocampe. Puis, disséquer l'hippocampe sur le cerveau avec le feu poli outils de verre et retirer la partie restante du cerveau.
  7. Séparer l'ensemble hippocampe avec son côté tourné vers le haut et alveus hippocampique sillon vers le bas. Déposer rapidement deux ou trois gouttes de glacée de saccharose aCSF sur le tissu nouveau et retirer la solution supplémentaire autour du tissu en utilisant un morceau de serviette en papier. Utilisez un outil de verre polies au feu de tourner sur l'ensemble hippocampe pour exposer le sillon (figure 1B, C).
  8. Sous un microscope optique normale, insérer une aiguille de verre sur mesure (n ° 11 dans Materi spécifiqueals et matériel) dans une extrémité du sillon et couper les connexions de fibres, de gyrus denté (DG) à subiculum ou le champ CA1, le long de la direction de sillon (figure 1C). Appliquer une lame glacée pour couper les extrémités du septum et temporelles de l'hippocampe si nécessaire. Insérez une boucle de fil métallique sur mesure (n ° 12 des matières et équipements spécifiques) dans le sillon de coupe et tirez sur la DG loin du tissu tout en maintenant la fin subiculum / CA1 de l'hippocampe par un outil feu de verre poli (figure 1D) .
  9. Suite à la procédure qui se déroule au-dessus, ajouter deux ou trois gouttes de saccharose aCSF glacée sur le tissu et retirer la solution supplémentaire autour du tissu. Ensuite, couper l'hippocampe dépliée avec la lame glacée sur les bords (figure 1E) et placez la préparation avec une spatule dans la chambre de récupération rempli de aCSF normale et barboter avec 95% de O 2/5% de CO 2 à la température ambiante (environ 25 ° C). Laisserle tissu de l'hippocampe dépliée pour récupérer environ 1 heure avant de le placer dans la chambre d'enregistrement.
  10. Prenez l'autre hémisphère du cerveau et l'utiliser pour passer par étapes de 2,5 à 2,9. Habituellement, prendra environ 1-2 min pour terminer toute la procédure se dérouler un seul hippocampe et déposez glacée de saccharose aCSF continuellement pour maintenir le tissu oxygénée et hydratée.

Configuration 3. Système Expérimental

  1. Collez un PMEA fabriqué sur mesure sur un paquet réseau de grille de broches (PGA) et utiliser micro soudure de fils pour connecter chaque pad d'un seul microélectrodes au pad d'une broche sur l'emballage (figure 3B). Ensuite, insérez le paquet dans la prise sur une carte de circuit sur-mesure 13.
  2. Se connecter individuellement chaque microélectrodes à ses filtres passe-bande avec fréquence de coupure de 1 Hz à 4 KHz et amplificateurs avec un gain de 100 sur la carte de circuit sur ​​mesure 13. Numériser la sortie analogique de la carte de circuit par un A / D convErting système, et acquérir et stocker les données sur un ordinateur.
  3. Colle une chambre d'enregistrement en matière plastique sur mesure autour de la matrice avec des tubes d'entrée et de sortie pour l'écoulement de solution (Figure 4A). Utilisation d'au moins deux bouteilles de maintenir des solutions différentes dans le système, et joindre et de contrôler la tubulure de sortie des bouteilles par une vanne à trois. Connecter la sortie de la vanne à trois à un système de tuyauterie avec une chambre de perfusion IV qui guide la solution dans la chambre d'enregistrement.
  4. Entre le tri-vanne et l'entrée de la chambre d'enregistrement, ajouter un élément chauffant électrique pour chauffer la solution à une température contrôlée (35 ° C) avant que la solution est guidée vers la chambre d'enregistrement. Attacher la sortie de la chambre d'enregistrement à un tube à vide pour recueillir la solution dans un tube à vide relié ballon. Ne importe quelle solution recycler dans toute expérience dans cette étude.

4. Placer le déplié Hippocampus sur la PMEA pour enregistrer l'activité neurale

  1. Pour préparer le montage expérimental, remplissez une bouteille avec aCSF normale et une autre bouteille avec 4-AP aCSF. Dans les deux bouteilles, bulle 95% O 2/5% de CO 2 dès le début de chaque expérience. Utilisez un connecteur tri-vanne pour contrôler la solution qui sera sélectionné lors d'une expérience. Connecter un tube de vide à la sortie de la chambre pour pomper la solution dans un récipient à poussière. Chauffer le pipeline avant de le distribuer dans la chambre d'enregistrement et de maintenir la solution à un niveau de température contrôlée (35 ° C).
  2. Lorsque l'entrée et la sortie de la chambre d'enregistrement sont fermés, utiliser un rendu compte-gouttes pipette en verre de transférer et de placer l'hippocampe déplié dans la chambre d'enregistrement. Sous le microscope, positionner l'hippocampe déplié l'aide d'un petit pinceau régulière alors que le tissu est flottant dans la solution. Placez l'hippocampe déplié avec son côté alveus vers le bas, la zone CA3 pointant vers l'extérieur, et le champ de CA1 pointant vers le chercheur.
  3. Aspirer la solution avec précaution loin dans la chambre en utilisant une pipette à vide à partir du bord de la chambre d'enregistrement à abaisser le niveau de la solution jusqu'à ce que la chambre est sèche et le tissu est abaissé sur le tableau. Ensuite, placer soigneusement une ancre pour tissu sur mesure (figure 4) (n ° 14 des matières et équipements spécifiques) sur le dessus du tissu pour maintenir l'hippocampe déplié sur le tableau. Mettez quelques gouttes de solution dans la chambre d'enregistrement de la remplir, et peu à peu ouvrir l'entrée et la sortie pour ajuster le taux à environ deux gouttes par seconde dans la chambre IV goutte à goutte de flux.
  4. Incuber le tissu dans la chambre d'enregistrement avec aCSF normale pendant environ 1 min récupérer, puis basculer la fourniture de solution à la 4-AP aCSF dissous et ajuster le débit correctement. Incuber le tissu dans la 4-AP dissous aCSF pendant environ 5 à 10 minutes, puis le chercheur pourrait lancer le logiciel pour enregistrer le signal lorsque l'activité spontanée apparaît.

5. Retrait de laTissu de la PMEA Après une expérience

  1. Contrôler l'ancre pour tissu par un micromanipulateur et soulever progressivement le tissu de la chambre d'enregistrement. Arrêtez les deux entrée et de sortie pour arrêter l'écoulement dans la chambre d'enregistrement. La chambre d'enregistrement devrait être plein avec une solution ou ajouter quelques gouttes de solution pour remplir la chambre si la chambre d'enregistrement ne est pas plein.
  2. Utilisez un petit pinceau pour soulever chaque coin du tissu. Si le tissu ne est pas flottant dans la solution, puis utiliser le tube à vide pour sécher la chambre attentivement avec le tissu toujours assis sur le tableau. Ensuite, ouvrez soigneusement l'entrée pour remplir progressivement la chambre et fermer l'entrée pour arrêter l'écoulement lorsque la chambre d'enregistrement est plein. Appliquer le petit pinceau pour soulever chaque coin du tissu nouveau.
  3. Répétez l'étape 5.2 jusqu'à ce que le tissu se détache de la matrice et flottant dans la solution. Si le tissu est flottant dans la solution, puis utilisez le tube de vide pour aspirer le tissu loin. Ouvrir til se écouler dans l'orifice d'entrée et ouvrir le vide dans la sortie. Laver le système avec de l'eau distillée et sécher.

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Résultats

Les données présentées sur les figures ici ont été enregistrés dans la préparation de l'hippocampe dépliée avec la 4-AP (100 pM) aCSF ajoutée pendant l'incubation du tissu dans la chambre d'enregistrement à la température ambiante (25 ° C). Normalement l'activité commence dans 5 minutes, mais dans certains tissus de l'hippocampe des animaux plus âgés, il peut prendre plus de temps. Le 4-décharge neuronale induite par des AP observé avec la PMEA est le même que précédemment rapporté 14,15. ...

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Discussion

Le développement de la préparation de l'hippocampe déplié, où les axes longitudinaux et transversaux de l'hippocampe sont conservés en combinaison avec une matrice de microélectrodes pénétrant, fournit un outil puissant pour étudier les connexions d'anatomie ou la propagation de neurones dans l'hippocampe 7. Cette procédure se déroule est également applicable pour l'étude de l'hippocampe chez des souris adultes. Des études récentes avec cette préparation ont montré que l'activité é...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention 1R01NS01NS060757-01 des National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) et par la chaire E.L. Lindseth attribuée à Dominique M. Durand. Nous remercions le laboratoire du Dr Andrew M. Rollins pour son aide sur l’imagerie OCT.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
pot de dessiccateurLABRECYCLERS Inc.5410Placez des serviettes en papier ordinaires au fond du bocal pour l’anesthésie animale.
Une lame et une platine chirurgicale faite sur mesure pour déplier l’hippocampeN/AN/AUne boîte de Pétri est placée à l’envers (au centre) dans la glace avec un papier filtre humide placé par-dessus.
Chambre de récupération de tissus sur mesureN/AN/ALes tubes en plastique ont été collés avec un treillis en plastique au fond et des bulles avec 95 % d’O2 / 5 % de CO2 dans l’aCSF.
Fonctionnement droit  ; CiseauxFisherScientific S17336B   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Medco Instruments No. :81995  ;Ces ciseaux sont utilisés pour  ;   ; Décapitez les souris.
Integra Miltex Goldman-Fox  ; CiseauxFisher Scientific12-460-517  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; MILTEX INC  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; N° :5-SC-320Ces ciseaux sont utilisés pour couper le crâne des souris.
Miltex
Pince d’hystérectomie		Claflin Équipement médicalCESS-722033-00001Cette pince est utilisée pour peler le crâne coupé afin d’exposer le cerveau
Micro SpatuleCardinal HealthCette micro spatule est utilisée pour transférer tout le cerveau d’une demi-sphère dans la chambre de réépinage.  ;
Spatule semi-micro en acier inoxydable Frey ScientificCardinal HealthCette spatule semi-micro est utilisée pour transférer l’hippocampe déplié dans le glucose aCSF dans la chambre de récupération.
petit pinceauLowe’stem # :  ; 105657  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Modèle # :  ; 90219Celui qui a la plus petite taille dans un paquet de pinceau normal
Outil d’aide en verre poli au feuN/A N/ACet outil a été poli au feu et fabriqué à partir des pipettes en verre Pasteur ordinaires.
Aiguille en verre sur mesureN/A N/ACet outil a été poli au feu et fabriqué à partir des pipettes en verre Pasteur régulières.
Outil en verre sur mesure avec une boucle en fil métalliqueN/A N/ACet outil a été poli au feu et fabriqué à partir des pipettes en verre Pasteur ordinaires avec une boucle en fil métallique remodelée.
Compte-gouttes de solution en verre sur mesureN/AN/ACet outil a été fabriqué à partir des pipettes en verre Pasteur ordinaires avec ses pointes coupées et une tête en caoutchouc fixée avec l’extrémité coupée.
Un treillis enfibre de nylon a été collé sur un anneau de fil de cuivre isolé. L’ancre tissulaire était maintenue par un micromanipulateur.
Réseau de microélectrodes fabriqué sur mesureN/A N/APour plus de détails sur le réseau, veuillez vous référer à  ; Kibler, et al, 2011.  ;
Circuits de filtres et d’amplificateurs sur mesure pour le réseauN/A N/APlus de détails sur le réseau, veuillez vous référer à  ; Kibler, et al, 2011.  ;
Processeur d’acquisition de données 3400aMicrostar LaboratoriesN/AIl s’agit d’un système d’acquisition de données complet avec convertisseur A/N.

Références

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