Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

Résumé

Les biofilms ont des interactions complexes avec leur environnement. Pour étudier de manière exhaustive les interactions biofilm-environnement, nous présentons ici une série de méthodes permettant de créer un environnement chimique hétérogène pour le développement de biofilms, de quantifier la vitesse d’écoulement locale et d’analyser le transport de masse dans et autour des colonies de biofilms.

Résumé

Les biofilms sont des communautés microbiennes attachée surface qui ont des structures complexes et produisent hétérogénéités spatiales importantes. le développement du biofilm est fortement réglementé par le flux environnante et l'environnement nutritionnel. la croissance du biofilm augmente également l'hétérogénéité du microenvironnement local en générant des champs d'écoulement complexes et des structures de transport de solutés. Pour étudier le développement de l'hétérogénéité dans les biofilms et les interactions entre les biofilms et leur micro-habitat local, nous avons grandi biofilms mono-espèces de Pseudomonas aeruginosa et les biofilms double-espèces de P. aeruginosa et Escherichia coli sous gradients nutritionnels dans une cellule d'écoulement microfluidique. Nous fournissons des protocoles détaillés pour la création de gradients de nutriments dans la cellule d'écoulement et pour la culture et la visualisation de développement du biofilm dans ces conditions. Nous avons également des protocoles actuels pour une série de méthodes optiques de quantifier la répartition spatiale de la structure du biofilm, distri circulerbutions sur les biofilms, et le transport de masse autour et à l'intérieur des colonies de biofilm. Ces méthodes prennent en charge des enquêtes approfondies de la co-développement du biofilm et l'habitat hétérogénéité.

Introduction

Les micro-organismes se fixent aux surfaces et forment des biofilms - des agrégats cellulaires enfermés dans une matrice polymère extracellulaire¹. Les biofilms se comportent très différemment des cellules microbiennes individuelles, car les biofilms présentent une hétérogénéité spatiale spectaculaire résultant d’une combinaison de limitations internes du transport de solutés et de variations spatiales du métabolisme cellulaire^2,3. Les concentrations d’oxygène et de nutriments diminuent considérablement à l’interface entre le biofilm et le liquide environnant et s’épuisent davantage à l’intérieur du biofilm². Des variations spatiales dans la respiration du biofilm et la synthèse des protéines peuvent également se produire en réponse à la disponibilité localisée de l’oxygène et des nutriments².

Dans les environnements aquatiques et pédologiques, la plupart des bactéries résident dans les biofilms. Les biofilms naturels effectuent d’importants processus biogéochimiques, notamment le cycle du carbone et de l’azote et la réduction des métaux^4,5. Cliniquement, la formation de biofilm est responsable d’infections pulmonaires et urinaires prolongées⁶. Les infections associées aux biofilms sont très problématiques car les cellules des biofilms ont une résistance extrêmement élevée aux antimicrobiens par rapport à leurs homologues planctoniques⁶. Parce que les biofilms sont importants dans divers contextes, une quantité importante de recherches a été axée sur la compréhension des facteurs environnementaux qui contrôlent les activités du biofilm et l’hétérogénéité spatiale des biofilms et du microenvironnement environnant.

Des études antérieures ont montré que le développement du biofilm est fortement régulé par un certain nombre de facteurs environnementaux : les biofilms développent différentes morphologies dans diverses conditions d’écoulement ; la disponibilité de l’oxygène et des nutriments influence la morphologie du biofilm ; et le stress de cisaillement hydrodynamique affecte la fixation des cellules planctoniques aux surfaces et le détachement des cellules des biofilms^7-9. De plus, les conditions d’écoulement externe influencent l’apport de substrats dans et à l’intérieur des biofilms¹⁰. La croissance des biofilms modifie également les conditions physiques et chimiques environnantes. Par exemple, la croissance du biofilm entraîne un appauvrissement local en oxygène et en nutriments² ; les biofilms accumulent des composés inorganiques et organiques de l’environnement^{environnant 11} ; et les grappes de biofilm détournent l’écoulement et augmentent la friction de surface^12,13. Étant donné que les biofilms interagissent avec leur environnement de manière très complexe, il est essentiel d’obtenir simultanément des informations sur les propriétés du biofilm et les conditions environnementales, et des approches multidisciplinaires doivent être utilisées pour caractériser de manière exhaustive les interactions entre le biofilm et l’environnement.

Nous présentons ici une série de méthodes intégrées pour caractériser les modèles spatiaux de croissance microbienne au sein de biofilms mono-espèces et bi-espèces sous un gradient nutritionnel imposé, et pour observer la modification résultante du microenvironnement chimique et fluide local. Nous décrivons d’abord l’utilisation d’une cellule d’écoulement microfluidique à double entrée récemment développée pour observer la croissance du biofilm sous des gradients chimiques bien définis. Nous démontrons ensuite l’utilisation de cette cellule d’écoulement microfluidique pour observer la croissance de deux espèces de bactéries, Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli, dans des biofilms sous diverses conditions nutritionnelles. Nous montrons comment la visualisation in situ de la propagation de traceurs fluorescents dans les colonies de biofilms peut être utilisée pour évaluer quantitativement les modèles de transport de solutés dans les biofilms. Enfin, nous montrons comment la vélocimétrie de suivi des particules à l’échelle microscopique, réalisée en microscopie confocale, peut être utilisée pour obtenir un champ d’écoulement local autour des biofilms en croissance.

Protocole

1. Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement

REMARQUE : Utilisez une cellule d’écoulement microfluidique à double entrée décrite dans Song et al., 2014¹⁴ pour cultiver des biofilms. Cette cellule d’écoulement est capable de créer des gradients chimiques lisses bien définis. La conception de la cellule d’écoulement est illustrée à la figure 1 et la fabrication de la cellule d’écoulement a été décrite précédemment dans Song et coll., 2014¹⁴. Ici, nous détaillons nos méthodes en utilisant P. aeruginosa et E. coli pour former des biofilms, mais d’autres espèces peuvent également convenir. Nous avons utilisé P. aeruginosa PAO1-gfp, qui exprime constitutivement une protéine fluorescente verte (GFP), comme organisme modèle pour le développement du biofilm. De plus, nous avons utilisé E. coli DH5α pour former des biofilms d’espèces mixtes avec P. aeruginosa. Les souches de P. aeruginosa et d’E. coli ont été cultivées sur des plaques de gélose LB.

1. Préparez la cellule d’écoulement à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS) lié à une lamelle de verre par un traitement au plasma d’oxygène, comme décrit au^{point 14}. Les dimensions de la chambre de la cellule d’écoulement sont de 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (longueur × largeur × profondeur).
2. Préparez le milieu de croissance FAB modifié¹⁵. Pour observer la croissance du biofilm sous un gradient nutritionnel à l’intérieur de la cellule d’écoulement, introduisez le milieu FAB¹⁵ modifié avec 0,6 μM de glucose dans une entrée et introduisez le milieu FAB sans aucune source de carbone par l’autre entrée. Stérilisez par filtre (taille des pores = 0,2 μm) la solution mère de glucose (60 mM) avant de l’ajouter au milieu FAB. Autoclavez également le milieu FAB avec le cycle 1 (liquide, 15 min ; 121 °C, 17 psi) avant utilisation.
3. Stérilisez le système d’écoulement. Avant l’inoculation, autoclaver l’ensemble de la voie d’écoulement (bouteilles moyennes, tubes, pièges à bulles, cellules d’écoulement) à l’aide du cycle 1, à l’exception des vannes à trois voies en plastique (jetables et pré-stérilisées) situées en amont de la cellule d’écoulement. (Des vannes à trois voies sont utilisées pour l’injection de culture cellulaire, de traceur fluorescent et de microbilles.) Pour éviter toute contamination lors de l’assemblage, couvrez toutes les ouvertures des tubes et des connecteurs avec du papier d’aluminium ou des sacs d’autoclave avant l’autoclavage.
4. Connectez le système d’écoulement. Assemblez soigneusement les composants du système de cellules d’écoulement (voir la vidéo pour l’assemblage du système d’écoulement) et fournissez le fluide de croissance à la cellule d’écoulement via une pompe péristaltique qui contrôle avec précision le débit.
5. Préparez la culture cellulaire pour l’inoculation en transférant une colonie de P. aeruginosa ou d’E. coli des plaques LB dans 3 ml de bouillon LB et agitez la culture O/N à 225 tr/min et 37 °C. Diluez les cultures cellulaires O/N dans 1 ml d’eau stérilisée jusqu’à une DO finale_{de 600} = 0,01 comme inoculum. (Cultivez et diluez les bactéries dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination.)
6. Pour les expériences avec des biofilms d’espèces mixtes, diluer les deux cultures bactériennes dans un rapport de 1:1 dans 1 ml avec une DO équivalente_{de 600} = 0,01 pour chaque bactérie.
7. Inoculer la cellule d’écoulement. Injecter 1 ml d’inoculum à l’entrée de la cellule d’écoulement à partir de la vanne à trois voies. Après l’injection, interrompez le débit pendant 1 heure pour permettre aux cellules bactériennes de se fixer au verre de protection. (Assurez-vous que la cellule d’écoulement est placée avec la lamelle vers le bas pour permettre aux cellules en suspension de se déposer sur la lamelle.)
8. Après 1 heure, reprenez l’écoulement et pompez le milieu de croissance vers la cellule d’écoulement à un débit constant de 0,03 ml/min pour chaque entrée pendant 3 jours.

2. Caractérisation du développement du biofilm en réponse aux gradients de nutriments à l’aide de la microscopie confocale

REMARQUE : P. aeruginosa peut être imagé avec la GFP exprimée de manière constitutive, mais E. coli dans les biofilms d’espèces mixtes doit être imagé par contre-coloration.

1. Observez les biofilms de 3 jours à l’aide de la microscopie confocale. Pour des résultats représentatifs, observez les biofilms à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif 63X. Avant l’imagerie, marquez la cellule d’écoulement à double entrée avec une grille sur le côté du verre de couverture. (Le but de cette grille est de permettre à l’expérimentateur de localiser les régions d’imagerie à l’intérieur de la chambre de la cellule d’écoulement.)
2. Pour contre-colorer, diluez 10 μl de colorant d’acide nucléique fluorescent rouge perméable à la cellule, tel qu’un colorant d’acide nucléique fluorescent vert tel que STYO 62, solution mère (1 mM) dans de l’eau stérilisée de 990 μl, puis injectez lentement le colorant dilué à l’aide d’une seringue dans la chambre de la cellule d’écoulement à partir de la vanne à trois voies en amont. Gardez la cellule d’écoulement stagnante et dans l’obscurité pendant 30 min, puis reprenez l’écoulement pour laver la tache non liée pendant 15 min.
3. Effectuer l’imagerie confocale. Activez le laser à argon de 488 nm pour l’excitation et les canaux de collecte d’émission pour la GFP (500-535 nm) et la coloration des acides nucléiques (pour la coloration des acides nucléiques fluorescents verts, 650-750 nm). Ajustez les gains et les décalages pour les deux canaux afin d’obtenir des images claires et nettes. Sélectionnez xyz et le mode d’imagerie simultanée. Utilisez le bouton de commande z pour identifier le bas et le haut du biofilm sur le terrain. Réglez le pas z sur 0,5 μm pour l’acquisition d’une pile d’images 3D. (Pour garantir une qualité d’image élevée, utilisez une moyenne linéaire de quatre pour l’acquisition d’images.)
4. Pour cartographier les modèles spatiaux de développement du biofilm à l’intérieur de la cellule d’écoulement, imagez les biofilms à trois distances longitudinales (x) ou plus le long de l’entrée de la cellule d’écoulement, et à trois positions transversales (y) par rapport au gradient nutritionnel imposé, comme le montre la figure 1.

3. Caractérisation du transport interne de solutés par injections de traceur fluorescent conservateur

REMARQUE : Un traceur fluorescent conservateur, tel que Cy5, peut être utilisé pour caractériser les modèles de transport de soluté dans le biofilm.

1. Dissoudre le Cy5 (ester monoréactif du NHS) dans l’eau jusqu’à une concentration finale de 10 mg/ml sous forme de solution mère. Conservez la solution mère Cy5 dans un congélateur à -20 °C.
   REMARQUE : Comme Cy5 est sensible à la lumière, stockez, diluez et injectez les solutions Cy5 dans l’obscurité.
2. Avant les injections du traceur fluorescent, prendre une pile d’images 3D du biofilm de 3 jours avec microscopie confocale (avec un objectif 63X). (De vastes régions de colonies de biofilm sont idéales pour les observations chronologiques du transport des colorants.) Choisissez également un plan z avec des colonies bien séparées pour l’imagerie (comme le montre la figure 5A).
3. Pour chaque expérience d’injection de Cy5, diluer 2 μl de la solution mère de Cy5 dans de l’eau stérilisée à 998 μl pour obtenir une solution d’injection ayant une concentration de Cy5 de 20 μg/ml.
4. Arrêtez la pompe pour interrompre le débit et injectez la solution Cy5 en amont de la cellule d’écoulement à l’aide d’une seringue via la vanne à 3 voies. (Il est important d’empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le chemin d’écoulement lors de l’injection. Les pièges à bulles doivent être maintenus ouverts pendant l’injection dans le dos.)
5. Après avoir injecté la solution Cy5, fermez les pièges à bulles, ajustez la vanne à 3 voies et redémarrez la pompe pour délivrer la solution Cy5 injectée dans la cellule d’écoulement.
6. Basculez le mode d’imagerie confocale sur xyt. Activez les canaux Cy5 et GFP en mode d’imagerie simultanée. Ajustez les paramètres confocaux sur l’intensité Cy5 (intensité laser, gain et décalage) pour éviter de saturer les signaux, ce qui est essentiel pour la quantification. (Une résolution temporelle élevée est préférable pour visualiser la pénétration du colorant. Cependant, un balayage rapide diminue la qualité de l’image.) Choisissez la vitesse de balayage et la moyenne de ligne appropriées pour équilibrer la résolution temporelle de l’imagerie et la qualité de l’image. Pour ce protocole, utilisez une moyenne de ligne de quatre et une fréquence d’images de 0,15 Hz.
7. Reprendre le débit pour délivrer le Cy5 dans la cellule d’écoulement (toujours à un débit de 0,03 ml/min). Démarrez simultanément l’imagerie confocale de séries chronologiques.
8. Quantifiez la pénétration de Cy5 en faisant la moyenne radiale de l’intensité de Cy5 au sein d’une colonie de biofilm circulaire 2D. Pour faire la moyenne, il faut d’abord identifier le bord d’un amas de biofilm, puis générer une carte de distance pour une section 2D de l’amas, et enfin faire la moyenne des motifs radiaux des intensités Cy5 pour générer une courbe de pénétration (voir Figure 6).
   1. Pour réaliser l’étape 3.8, utilisez le progiciel BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) (non publié, progiciel et manuel disponibles sur demande) ou d’autres programmes d’analyse d’images.
   2. Pour utiliser BioSPA, importez d’abord un ensemble d’images dans BioSPA. Sélectionnez ensuite le seuil approprié pour les canaux GFP et Cy5 afin de créer des images binaires. Dans le menu analyse/calcul, sélectionnez Analyse avancée, puis Analyse de diffusion. Utilisez le canal GFP pour définir le bord d’un cluster et utilisez l’outil Polygone pour sélectionner un cluster comme région d’intérêt (ROI).
   3. Double-cliquez sur le groupe de biofilm sélectionné pour effectuer une analyse de diffusion. Enregistrez les résultats de l’analyse de diffusion et calibrez l’intensité de Cy5 à la concentration de Cy5 à l’aide d’une courbe d’étalonnage.
      1. Pour générer une courbe d’étalonnage de la concentration Cy5, mesurez les intensités Cy5 sur un gradient de concentration Cy5 en microscopie confocale. (L’intensité et la concentration de Cy5 ont une relation linéaire.)

4. Caractérisation du champ d’écoulement environnant par suivi des particules fluorescentes

REMARQUE : Les particules fluorescentes, telles que les microbilles fluorescentes, peuvent être utilisées pour caractériser le champ d’écoulement autour des biofilms. Le champ d’écoulement autour des biofilms peut être calculé à partir des observations chronologiques des positions des particules à l’aide d’un logiciel de vélocimétrie de suivi des particules. Les résultats présentés ici ont été obtenus avec le progiciel Streams 2.02¹⁶ (téléchargement du logiciel et guide d’utilisation disponibles à l’adresse http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml).

1. Diluer les microbilles fluorescentes (diamètre ~1 μm) dans de l’eau stérilisée jusqu’à une concentration finale solide de 0,2 % et un volume final de 0,5 ml. Vortex pour s’assurer que les microbilles sont bien dispersées.
2. Injectez et délivrez les microbilles fluorescentes diluées dans la cellule d’écoulement en suivant les procédures des étapes 3.3 à 3.5. Pour permettre un suivi précis de la trajectoire des particules, utilisez un débit relativement faible (0,01 ml/h pour les résultats de suivi des particules dans cet article).
3. Basculez les paramètres confocaux en mode xyt pour suivre le mouvement des particules en une tranche z et prendre des images chronologiques. (Une fréquence d’images de 1 Hz a été utilisée pour les résultats représentatifs présentés dans cet article.) Répétez l’injection de particules et l’image à différents emplacements z pour générer un champ d’écoulement 3D.
4. Pré-traitez les images confocales de séries temporelles en soustrayant le signal de fluorescence de fond (le signal de la première image acquise de l’ensemble d’images) à l’aide d’ImageJ (téléchargement du logiciel et manuel disponible sur http://imagej.nih.gov/ij/) ou d’autres programmes.
5. Dans ImageJ, ouvrez la première image d’un ensemble d’images, puis importez l’ensemble d’images. Sous Calculateur de processus/image, soustrayez la première image de l’ensemble d’images. Enregistrez l’ensemble d’images prétraitées.
6. Pour calculer des vecteurs d’écoulement, importez des images confocales de séries chronologiques dans Streams 2.02. Sous « Ouvrir la vue du processus », sélectionnez et exécutez « Identifier les particules ». Utilisez le seuil approprié pour identifier les particules. Utilisez 0,5 et 5 μm comme seuils de diamètre minimum et maximum pour les particules de 1 μm.
7. Ensuite, sous « Ouvrir la vue du processus », sélectionnez et exécutez « Pipeline d’analyse PTV » pour générer des chemins de particules. Vérifiez les chemins des particules pour voir s’ils représentent le mouvement des particules. Enfin, sélectionnez et exécutez « Créer un champ de vitesse » pour générer une carte vectorielle d’écoulement.

Résultats

La cellule d’écoulement microfluidique à double entrée permet d’observer la croissance du biofilm sous un gradient chimique bien défini formé par le mélange de deux solutions dans la chambre d’écoulement. Le gradient chimique résultant a été observé par injection de colorant et caractérisé en détail par Song et al.¹⁴. Des gradients de concentration lisses ont été formés dans la direction transversale, comme le montre la figure 1. Le profil de concentration était abrupt près de l’entré...

Discussion

Nous avons démontré une série de méthodes pour caractériser trois interactions importantes entre le biofilm et l’environnement : la réponse du biofilm aux gradients chimiques, les effets de la croissance du biofilm sur le microenvironnement d’écoulement environnant et l’hétérogénéité du biofilm résultant des limitations de transport interne.

Nous avons d’abord montré l’utilisation d’une nouvelle cellule d’écoulement microfluidique pour imposer un gradient chimique bien défini pour le développe...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pompe péristaltique	Gilson	Miniplus 3	Configuration de la cellule d’écoulement et inoculation
Tube de pompe 0,50 mm OVC, Orange/Jaune	Gilson	F117934	Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement
Robinet d’arrêt à trois voies avec serrure Luer mâle pivotante	Smiths Medical  ;	MX9311L	Configuration et inoculation de cellules d’écoulement
Sylgard 184 Encapsulation de cellules solaires pour la fabrication de panneaux solaires	ML Solar LLC		Configuration et inoculation de cellules d’écoulement
Pyrex Medium Bottle, 1  ; L, GL45	VWR	16157-191 Configuration et	inoculation de la cellule d’écoulement
C-FLEX Tubing	Cole-Parmer	06422-02	Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement
1 ml Seringue TB	BD	309659	Configuration et inoculation de la cellule
d’écoulement Tube polymère	IDEX	1520G	Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement
Adaptateur de stub Luer Intramedic stérile Clay	Adams	427564	Configuration et inoculation de cellules d’écoulement
PrecisionGlide Needle	BD	305195	Configuration et inoculation de cellules d’écoulement
Spectrophotomètre	HACH		Configuration et inoculation de cellules d’écoulement
Filtres à seringue - stériles (0,2 &mu ; m)	Fisherbrand	09-719A	Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement
MAXQ Shaker	Thermo Scientific		Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement
Sulfate d’ammonium	Sigma Aldrich	A4418	Milieu de croissance
Phosphate de sodium dibasique anhydre	Sigma Aldrich	RES20908-A7	Milieu de croissance
Phosphate de potassium monobasique	Sigma Aldrich	P5655	Milieu de croissance
Chlorure	de sodium Sigma Aldrich	S7653	Milieu de croissance
Chlorure de magnisium	Sigma Aldrich	M8266	Milieu de croissance
Chlorure	de calcium Sigma Aldrich	C5670	Milieu de croissance
Sulfate de calcium dihydraté	Sigma Aldrich	C3771	Milieu de croissance
Sulfate de fer(II) heptahydraté	Sigma Aldrich	215422	Milieu de croissance
Sulfate de manganèse(II) monohydraté	Sigma Aldrich	M7634	Milieu de croissance
Sulfate de cuivre(II)	Sigma Aldrich	451657	Milieu de croissance
Sulfate de zinc heptahydraté	Sigma Aldrich	Z0251	Milieu de croissance
Sulfate de cobalt(II) heptahydraté	Sigma Aldrich	C6768	Milieu
de croissanceMolybdate de sodium	Sigma Aldrich	243655	Milieux de croissance
Acide borique	Sigma Aldrich	B6768	Milieux de croissance
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	Milieux de croissance
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich L3022		Milieux de croissance
TCS SP2 Microscopie confocale	Leica		Imagerie fluorescente
SYTO 62	Life Technology	S11344	Imagerie fluorescente
Cy5	GE Healthcare Life Sciences	PA15100	Imagerie fluorescente
Rouge Fluorescent (580/605) FluoSphere	Life Technology	F-8801	Imagerie fluorescente
BioSPA	Packman Lab		Traitement d’images
ImageJ	NIH		Image Processing
Volocity	PerkinElmer		Image
Processing Streams 2.02	Université de Cantebury		Traitement d’images