Tumeur primaire et MEF cellule d'isolement pour étudier métastases pulmonaires

Résumé

L’objectif de ce protocole est d’étudier la tumorigenèse mammaire. Avec cette technique, les tumeurs mammaires de souris sont retirées et des cellules primaires sont préparées à partir des tumeurs. Un protocole d’extraction pulmonaire est inclus pour l’étude des métastases pulmonaires. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris à partir de l’embryon de souris est inclus.

Résumé

Dans la tumorigenèse mammaire, le stade métastatique de la maladie constitue la plus grande menace pour l’individu atteint. Les cellules mammaires normales avec des génotypes modifiés possèdent maintenant la capacité d’envahir et de survivre dans d’autres tissus. Dans ce protocole, les tumeurs mammaires de souris sont retirées et des cellules primaires sont préparées à partir des tumeurs. Les cellules isolées de cette procédure sont ensuite disponibles pour des expériences de profilage génétique. Pour que les métastases réussissent, ces cellules doivent être capables d’intravaser, de survivre dans la circulation, d’extravaser vers des organes éloignés et de survivre dans ce nouveau système organique. Les poumons sont la cible typique des métastases du cancer du sein. Un ensemble de gènes a été découvert qui médie la sélectivité des métastases dans le poumon. Nous décrivons ici une méthode d’étude des métastases pulmonaires à partir d’un modèle de souris génétiquement modifié. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de l’embryon de souris est inclus. Les cellules MEF du même type animal fournissent un indice de l’expression des gènes cellulaires non cancéreux. Ensemble, ces techniques sont utiles pour étudier la tumorigenèse mammaire de souris, ses mécanismes de signalisation associés et les voies des anomalies chez les embryons.

Introduction

Les métastases sont la dernière étape de la progression du cancer du sein ¹. Il implique une série d’étapes au cours desquelles les cellules malignes sont libérées de la tumeur primaire et disséminées vers d’autres organes ². Les cellules doivent être capables d’intravaser, de survivre en circulation, d’extravaser vers des organes éloignés et de survivre dans ce nouveau système d’organes ³. Chaque étape de la tumorigenèse est étroitement contrôlée par les cellules à travers divers changements génétiques et épigénétiques ⁴. Pour étudier les mécanismes de la tumorigenèse du cancer du sein, des systèmes modèles murins ont été u....

Protocole

Toutes les expériences de souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Institutional Animal Care et utilisation comités (IACUC) de LSU School of Medicine. Tous les instruments doivent être stérilisés à l'autoclave avant la dissection.

1. Préparation des cellules primaires de tumeurs mammaires de souris

1. Utiliser un modèle de souris qui a été génétiquement modifié avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (de la souris MMTV-PyMT transgénique), qui développent spontanément des tumeurs comme décrit précédemment ^6.
2. Sacrifiez souris avec l'isoflurane (99,9%) et pulvériser 75% d'....

Résultats

Le stade de progression de la tumeur à laquelle sacrifier l'animal dépend de l'étude particulière et des lignes directrices du IACUC. Dans la figure 1A, 100 aujourd'hui âgé de souris C57BL / 6 avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (MMTV-PyMT) a été sacrifié à trois mois. La peau a été ouvert à partir de la zone de l'orifice de l'urètre à la nuque avec des ciseaux et de la peau a été clouée au sol pour permettre un accès facile à des organes comme le montre

Discussion

Ce protocole est destiné à isoler des cellules primaires à partir d'une tumeur de souris frais. Les lysats préparés à partir de ce procédé sont utiles pour les protéines, l'ADN et analyse de l'ARN. Les cellules cancéreuses de la tumeur primaire du sein métastasent souvent vers le cerveau, les poumons et les os ^1. Inclus est une technique pour extraire le poumon pour la détection des métastases. La coloration du poumon avec une tache d'encre permettra la visualisation des nodules tumoraux comme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	HyClone	SH30243.01	Magasin à 4 ° ; C
0,05 % Trypsine-EDTA	Life  ; technologies	25300-062	Stocker à &ndash ; 20 ° ; C
Collagénase Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	Magasinez à &ndash ; 20 ° ; C
hyaluronidase	sigma-aldrich	H3506	Magasin à &ndash ; 20 ° ; C
Pen Strep	Life  ; technologies	15140-122	Magasin à 4 ° ; C
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	Magasin à &ndash ; 80 ° ; C
Z-fix	ANATECH#	174	Boutique chez RT
India Ink	Yasutomo		Boutique chez RT
AERRANE (Isoflurane)	Baxter	NDC 10019-773-60	Boutique chez RT
Ethanol	EMD	AX0441-3	Boutique chez RT