Tumeur primaire et MEF cellule d'isolement pour étudier métastases pulmonaires

Résumé

L’objectif de ce protocole est d’étudier la tumorigenèse mammaire. Avec cette technique, les tumeurs mammaires de souris sont retirées et des cellules primaires sont préparées à partir des tumeurs. Un protocole d’extraction pulmonaire est inclus pour l’étude des métastases pulmonaires. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris à partir de l’embryon de souris est inclus.

Résumé

Dans la tumorigenèse mammaire, le stade métastatique de la maladie constitue la plus grande menace pour l’individu atteint. Les cellules mammaires normales avec des génotypes modifiés possèdent maintenant la capacité d’envahir et de survivre dans d’autres tissus. Dans ce protocole, les tumeurs mammaires de souris sont retirées et des cellules primaires sont préparées à partir des tumeurs. Les cellules isolées de cette procédure sont ensuite disponibles pour des expériences de profilage génétique. Pour que les métastases réussissent, ces cellules doivent être capables d’intravaser, de survivre dans la circulation, d’extravaser vers des organes éloignés et de survivre dans ce nouveau système organique. Les poumons sont la cible typique des métastases du cancer du sein. Un ensemble de gènes a été découvert qui médie la sélectivité des métastases dans le poumon. Nous décrivons ici une méthode d’étude des métastases pulmonaires à partir d’un modèle de souris génétiquement modifié. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de l’embryon de souris est inclus. Les cellules MEF du même type animal fournissent un indice de l’expression des gènes cellulaires non cancéreux. Ensemble, ces techniques sont utiles pour étudier la tumorigenèse mammaire de souris, ses mécanismes de signalisation associés et les voies des anomalies chez les embryons.

Introduction

Les métastases sont la dernière étape de la progression du cancer du sein ¹. Il implique une série d’étapes au cours desquelles les cellules malignes sont libérées de la tumeur primaire et disséminées vers d’autres organes ². Les cellules doivent être capables d’intravaser, de survivre en circulation, d’extravaser vers des organes éloignés et de survivre dans ce nouveau système d’organes ³. Chaque étape de la tumorigenèse est étroitement contrôlée par les cellules à travers divers changements génétiques et épigénétiques ⁴. Pour étudier les mécanismes de la tumorigenèse du cancer du sein, des systèmes modèles murins ont été utilisés en raison de leur courte durée de vie, de leur petite taille et de leur temps de reproduction rapide. Certains des principaux avantages de l’utilisation de modèles murins dans la recherche sur le cancer sont les similitudes moléculaires et physiologiques qu’ils partagent avec les humains ⁵.

Les lignées cellulaires de souris et humaines établies ont été largement utilisées dans la recherche sur le cancer du sein. Bien que nous puissions obtenir des informations sur les étapes des métastases en utilisant ces cellules, des modèles animaux génétiquement manipulés avec des suppresseurs de tumeurs / oncogènes donneront beaucoup plus d’informations sur le développement tumoral et les métastases à partir du stade embryonnaire. Ainsi, avec ces modèles murins, nous pouvons obtenir une régulation génétique et développementale de la croissance tumorale. De plus, le microenvironnement tumoral joue également un rôle important dans l’expression des gènes des cellules tumorales et il peut être difficile d’imiter le même scénario avec des études utilisant des lignées cellulaires établies. Les tumeurs mammaires humaines primaires peuvent également être utilisées pour étudier la tumorigenèse mammaire de souris. Le principal inconvénient de l’utilisation de tumeurs mammaires isolées est que cette tumeur nouvellement implantée n’a pas le système vasculaire et le tissu lymphatique de la souris. Alors que les systèmes de modèles génétiques de souris pour l’étude de la tumorigenèse mammaire nous permettront de surveiller les étapes des métastases, d’analyser le microenvironnement tumoral et d’accéder à l’ensemble du corps ⁵.

L’objectif global de ce protocole est d’étudier la tumorigenèse mammaire chez la souris. On sait que les cancers du sein métastasent généralement au cerveau, aux poumons et aux os. Ce protocole permet d’isoler les cellules tumorales mammaires primaires, ainsi que d’étudier les métastases du cancer du sein au poumon. De plus, un autre protocole d’analyse des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de l’embryon de souris est inclus. Ensemble, ces techniques sont utiles pour étudier la tumorigenèse mammaire de souris.

Protocole

Toutes les expériences de souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Institutional Animal Care et utilisation comités (IACUC) de LSU School of Medicine. Tous les instruments doivent être stérilisés à l'autoclave avant la dissection.

1. Préparation des cellules primaires de tumeurs mammaires de souris

1. Utiliser un modèle de souris qui a été génétiquement modifié avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (de la souris MMTV-PyMT transgénique), qui développent spontanément des tumeurs comme décrit précédemment ^6.
2. Sacrifiez souris avec l'isoflurane (99,9%) et pulvériser 75% d'éthanol pour assurer un environnement stérile (figure 1A).
3. Ouvrir la peau à partir de la zone de l'orifice urétral pour le cou avec des ciseaux. Epingler la peau vers le bas pour permettre un accès facile pour les organes (Figure 1B).
4. Isoler la tumeur mammaire du sein et laver avec de froid phosphate stérile saline tamponnée (PBS) (pH 7,4) (figure 1C).
5. Transférer la tumeurune plaque de culture tissulaire de 10 cm stérile et couper avec des ciseaux et une lame de rasoir stérile à 1 mm environ ^trois morceaux. Les étapes suivantes devraient être effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile.
6. Incuber le tissu tumoral hachée avec de la collagénase dissous dans un milieu de DMEM exempt de sérum à une concentration finale de 1 mg / ml sur une bascule pendant 2 heures à 37 ° C. Centrifuger la suspension de tissu de la tumeur pendant 3 min à 200 x g.
   NOTE: L'incubation de la collagénase est essentiel pour la dissociation enzymatique du tissu.
7. Jeter le surnageant et laver le précipité trois fois avec du PBS (pH 7,4) par centrifugation pendant 3 minutes à 200 x g. Après le lavage final, décanter le surnageant.
8. Remettre en suspension le tissu avec 2 ml de trypsine EDTA pendant 5 min à 37 ° C tout en déplaçant en nutation. Centrifuger la suspension pendant 3 min à 200 xg et répéter les lavages.
9. Remettre en suspension le culot de tissus dans un milieu de croissance normal (DMEM, 10% de FBS, 2 x pen / strep) sur une plaque de 10 cm. Changementles médias tous les jours pour les 3 prochains jours. des cellules de culture jusqu'à ce que le nombre de cellules désiré soit obtenu.
   REMARQUE: Environ 1x10 ⁷ cellules sera isolé de cette procédure. D'autres modèles de tumorigenèse mammaire de la souris, telles que MMTV-Neu, donnent un rendement plus faible de cellules par rapport à MMTV-PyMT. Lors de l'utilisation des modèles qui produisent un rendement plus faible, il est avantageux de commencer avec un plus grand cellules tumorales et de culture plus longues.

2. Souris Lung Extraction de visualiser métastases pulmonaires

1. Avant l'extraction du poumon, le foie et supprimer le diaphragme. Déloger les côtes sans déranger les poumons.
2. Avec une belle paire de ciseaux, ouvrez la partie supérieure de la trachée, qui est plus proche de la veine jugulaire.
3. L'utilisation d'un cathéter, injecter un agent tel que 1 ml de Z-fixage ou l'encre de Chine à travers la trachée pour remplir les poumons (Figure 2A). Incluez le Z-fix Poumons dans de la paraffine.
4. De-tache les poumons injectés avec l'encre de Chine dans la solution de Fekete(100 ml 70% d'alcool, 10 ml de formaline à 10% tamponnée et 5 ml d'acide acétique glacial) pendant 5 min. Définir les nodules tumoraux dans des sites secondaires avec a ≥ 0,5 mm de diamètre, déterminer que les nodules métastases.
   NOTE: En raison de l'obstruction des bronches et des bronchioles par la tumeur, nodules tumoraux ne peuvent pas absorber 15% d'encre de Chine, et donc le tissu pulmonaire normale seront en noir et nodules tumoraux seront de couleur blanche ^7. Cela permettra la visualisation des nodules tumoraux individuels (Figure 2B).

3. Préparation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) à partir embryons de souris

1. Sacrifiez souris enceintes avec l'isoflurane (99,9%) et pulvériser 75% d'éthanol pour assurer un environnement stérile.
2. Ouvrir la peau à partir de la zone de l'orifice urétral pour le cou avec des ciseaux et isoler les embryons de l'utérus.
3. Veillez à ne pas déranger les embryons lors de l'ouverture de la peau.
4. Retirez les cornes utérines et les rincer à ste froidrile PBS (pH 7,4).
5. Séparer l'embryon de son placenta très soigneusement et placer des embryons dans une plaque de 10 cm contenant PBS glacé (pH 7,4).
6. Retirer la tête, le foie et l'intestin de l'embryon et placer la partie restante dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits contenant du PBS (pH 7,4).
7. Transférer le corps de l'embryon à un autre 12 plaque puits contenant la trypsine EDTA et les couper en petits morceaux (~ 1 mm ³⁾ à l'aide d'une lame de rasoir et les ciseaux stérile. Incuber le matériau haché avec 5 ml de trypsine EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
8. Inactiver la trypsine par addition de 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS) pour les embryons hachées. Centrifugeuse la suspension à 200 vitesse de g pendant 10 min, retirez avec précaution le surnageant, remettre en suspension le culot avec 1 ml de milieu de DMEM chaud et transférer tout le contenu dans un plat de 10 cm contenant 10 ml de DMEM (avec 20% de FBS et 2X pénicilline / streptomycine ).
9. Changer le support chaque jour pendant deux jours. Culture des cellules jusqu'à ce que la cellule souhaitéenombre est atteint.

Résultats

Le stade de progression de la tumeur à laquelle sacrifier l'animal dépend de l'étude particulière et des lignes directrices du IACUC. Dans la figure 1A, 100 aujourd'hui âgé de souris C57BL / 6 avec la souris tumeur mammaire Virus Polyome Moyen T-Antigen (MMTV-PyMT) a été sacrifié à trois mois. La peau a été ouvert à partir de la zone de l'orifice de l'urètre à la nuque avec des ciseaux et de la peau a été clouée au sol pour permettre un accès facile à des organes comme le montre

Discussion

Ce protocole est destiné à isoler des cellules primaires à partir d'une tumeur de souris frais. Les lysats préparés à partir de ce procédé sont utiles pour les protéines, l'ADN et analyse de l'ARN. Les cellules cancéreuses de la tumeur primaire du sein métastasent souvent vers le cerveau, les poumons et les os ^1. Inclus est une technique pour extraire le poumon pour la détection des métastases. La coloration du poumon avec une tache d'encre permettra la visualisation des nodules tumoraux comme...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	HyClone	SH30243.01	Magasin à 4 ° ; C
0,05 % Trypsine-EDTA	Life  ; technologies	25300-062	Stocker à &ndash ; 20 ° ; C
Collagénase Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	Magasinez à &ndash ; 20 ° ; C
hyaluronidase	sigma-aldrich	H3506	Magasin à &ndash ; 20 ° ; C
Pen Strep	Life  ; technologies	15140-122	Magasin à 4 ° ; C
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	Magasin à &ndash ; 80 ° ; C
Z-fix	ANATECH#	174	Boutique chez RT
India Ink	Yasutomo		Boutique chez RT
AERRANE (Isoflurane)	Baxter	NDC 10019-773-60	Boutique chez RT
Ethanol	EMD	AX0441-3	Boutique chez RT