Développement d'un Quantitative recombinase polymérase L'amplification Assay avec un contrôle positif interne

Summary

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Abstract

Il a récemment été démontré que l’amplification par polymérase recombinase (RPA), une plate-forme d’amplification isotherme pour la détection d’agents pathogènes, peut être utilisée pour quantifier la concentration d’un échantillon d’ADN à l’aide d’une courbe standard. Dans ce manuscrit, un protocole détaillé pour le développement et la mise en œuvre d’un test d’amplification de la recombinase polymérase quantitative en temps réel (test qRPA) est fourni. En utilisant la quantification de l’ADN du VIH-1 comme exemple, l’assemblage des réactions RPA en temps réel, la conception d’une séquence de contrôle positif interne (IPC) et la co-amplification de l’IPC et de la cible d’intérêt sont tous décrits. Des instructions et des scripts de traitement de données pour la construction d’une courbe standard à l’aide de données provenant de plusieurs expériences sont fournis, qui peuvent être utilisés pour prédire la concentration d’échantillons inconnus ou évaluer la performance du test. Enfin, une autre méthode de collecte de données de fluorescence en temps réel à l’aide d’un microscope et d’un appareil de chauffage de platine en tant qu’étape vers le développement d’un test qRPA au point de service est décrite. Le protocole et les scripts fournis peuvent être utilisés pour le développement d’un test qRPA pour toute cible d’ADN d’intérêt.

Introduction

Quantitative amplification d'acide nucléique est une technique importante pour la détection de l'environnement, d'origine alimentaire, et des agents pathogènes d'origine hydrique ainsi que pour les diagnostics cliniques. PCR quantitative quantitative (qPCR) est la méthode de l'étalon-or pour une détection sensible, spécifique et quantitative d'acides nucléiques, par exemple pour le VIH-1 des tests de la charge virale, la détection des bactéries pathogènes, et le criblage pour de nombreux autres organismes ^{1 - 3.} Au cours de qPCR en temps réel, des amorces amplifient l'ADN de l'agent pathogène dans les cycles, et un ....

Protocol

1. Programmer le thermocycleur en temps réel QRPA Réactions

1. Créer un nouveau protocole dans le logiciel de cycleur thermique.
   1. Insérer une étape de pré-incubation: 39 ° C pendant 1 min.
   2. Ajouter une deuxième étape: 39 ° C pendant 20 s, suivie par une lecture de la plaque.
   3. Enfin, insérez un "aller à" qui répète la deuxième étape 59 fois plus.
   4. Enregistrer le protocole.
2. Créer une nouvelle plaque dans l'onglet "de l'éditeur de plaque" du logiciel. Sélectionnez puits de la plaque correspondant aux emplacements des réactions de l'APR (ici, l'utilisation des puits A1, A4-A8, B1 et B4-B8).

Results

Avant de sélectionner une séquence de servir de la CIB dans les expériences QRPA avec la cible (VIH-1) de l'ADN, le contrôle positif interne (IPC) candidats sont générés et criblés pour leur capacité à amplifier dans les réactions QRPA sans le VIH-1 ADN présent. IPC candidats sont plus longues que la cible (VIH-1) de l'ADN pour empêcher la formation de l'IPC hors compétition VIH-1 formation de amplicon. Comme le montre la figure 2A, la génération de deux C. candidats parvum IPC a été v.......

Discussion

Afin d'obtenir des données de quantification significatives en utilisant l'algorithme MATLAB, l'utilisateur doit sélectionner des valeurs d'entrée appropriées lorsque vous êtes invité. Après l'ouverture de chaque script dans les sections 5 et 6, toutes les variables d'entrée sont automatiquement sollicités dans la fenêtre de commande et sorties sont générés automatiquement. Dans la section 5.7 l'utilisateur est invité à sélectionner un seuil de pente. La valeur du seuil de pente affecte le ca.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA Assay
HIV-1 amorce directe	Integrated DNA Technologies	oligos d’ADN personnalisés	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'   ;
HIV-1 amorce inverse	Integrated DNA Technologies	oligos d’ADN personnalisés	5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTG TAA TTT GTT TTT G-3'   ;
Sonde VIH-1	BioSearch Technologies  ;	oligos d’ADN personnalisés	5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'   ;
Sonde IPC	BioSearch Technologies  ;	oligos d’ADN personnalisés	5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
Réactifs RPA exo (granulés, tampon de réhydratation, acétate de magnésium	TwistDx TwistAmp	exo
Bandelettes de tubes PCR	BioRad	TLS0801
bandelettes de tubes à capuchon plat	PCR BioRad	TCS0803
Adhésif micro-scellé	BioRad	558/MJ  ;
VIH-1 (pHIV-IRES-eYFP&Delta ; Env&Delta ; Vif et Delta ; Vpr)			plasmide personnalisé, voir : Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Caractérisation et détection de lentivirus compétent pour la réplication artificielle de la gamme d’hôtes altérée. Thérapie moléculaire 8, 118&ndash ; 129, doi :10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
ADN génomique humain mâle	Applied Biosystems	360486
96 puits bloc froid	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermocycleur	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tampon Tris 1,0 M, pH 8,0	EMD Millipore	648314
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Promega	V4321
Eau sans nucléase	Ambion	AM9937
Développement IPC
parvum Modèle IPC	Waterborne Inc	P102C	Il est également possible de commander une cible synthétique double brin auprès d’IDT si l’utilisateur n’est pas équipé pour travailler avec C. parvum (un agent infectieux BSL-2). Les amorces PCR et RPA pour C. parvum ont été conçues à l’aide du numéro d’accession GenBank AF115377.1
PCR amorce longue avance	Integrated DNA Technologies	oligos d’ADN personnalisés	5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'
PCR longue amorce inverse	Integrated DNA Technologies	oligos d’ADN personnalisés	5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'
Phusion High-Fidelty DNA polymérase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Kit d’extraction de gel	Qiagen	28704
TAE 10X tampon	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope
à fluorescence vertical	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Chauffage de scène	Bioscience Tools	TC-GSH
Contrôleur de température haute stabilité de précision à 1 canal	Outils Bioscience	TC-1100S
Cube de filtre FAM/GFP Jeu	de filtres Zeiss	38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, émission BP 520/50 nm
Cube de filtre HEX	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, émission BP 575/40 nm
Découpeuse laser	de graveur	VLS3.60
1/8" acrylique noir	McMaster Carr	8505K113
1,5 mm acrylique transparent	McMaster Carr	-72268940  ;
Super colle	Office Depot	Duro super glue  ;
Huile minérale de qualité PCR	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Analyse
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
Script : « JoVE_qRPA_standard_curve.m »	Inclus dans le script SI
MATLAB : « JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m »	Inclus dans le script SI
MATLAB : « JoVE_real_time_intensity_to_excel.m »	Inclus dans SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Inclus dans SI
JoVE_qRPA_base.ai	Inclus dans SI
AxioVision logiciel	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Inclus dans SI