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Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

Quantitative amplification d'acide nucléique est une technique importante pour la détection de l'environnement, d'origine alimentaire, et des agents pathogènes d'origine hydrique ainsi que pour les diagnostics cliniques. PCR quantitative quantitative (qPCR) est la méthode de l'étalon-or pour une détection sensible, spécifique et quantitative d'acides nucléiques, par exemple pour le VIH-1 des tests de la charge virale, la détection des bactéries pathogènes, et le criblage pour de nombreux autres organismes ^{1 – 3.} Au cours de qPCR en temps réel, des amorces amplifient l'ADN de l'agent pathogène dans les cycles, et un signal fluorescent est généré qui est proportionnel à la quantité d'ADN amplifié dans l'échantillon à chaque cycle. Un échantillon contenant une concentration inconnue de l'ADN de l'agent pathogène peut être quantifiée en utilisant une courbe standard qui concerne la concentration de l'ADN initial des échantillons étalons et l'heure à laquelle le signal fluorescent atteint un certain seuil (par exemple, le seuil de cycle ou _CT).

<p class="Jove_content"> Parce que en temps réel qPCR nécessite un équipement de cyclage thermique coûteuse et plusieurs heures pour recevoir les résultats, les techniques d'amplification isothermes alternatives, telles que l'amplification recombinase polymérase (RPA), ont été développés ^4. Ces plates-formes fournissent généralement des résultats plus rapidement et à amplifier des acides nucléiques, une seule température inférieure, ce qui peut être accompli avec moins coûteux, plus simple équipement. RPA, ce qui est particulièrement intéressant pour les applications de point de soins, amplifie l'ADN en quelques minutes, nécessite une température amplification des basses (37 ° C), et reste actif en présence d'impuretés ^5,6. dosages de l'APR ont été développés pour une large gamme d'applications, y compris l'analyse des aliments, la détection de pathogènes, le criblage de médicaments contre le cancer, et la détection des agents de bioterrorisme ^7-12. Cependant, l'utilisation de l'APR pour la quantification d'acides nucléiques a été limitée ^13,14.

Dans des travaux antérieurs, il était shoWN que temps réel RPA quantitative (QRPA) est réalisable ^15. Ici, un protocole plus détaillé est fourni pour l'utilisation en temps réel RPA quantitative de quantifier des échantillons inconnus en utilisant une courbe standard, une méthode qui est analogue à la quantification en utilisant qPCR. Ce protocole décrit comment effectuer une réaction de RPA sur un cycleur thermique pour détecter l'ADN du VIH-1 comme une preuve de concept, ainsi que la façon de développer un contrôle positif interne (IPC) pour assurer que le système fonctionne correctement. La collecte de données en utilisant un cycleur thermique ou d'un microscope et d'analyse de données pour construire une courbe standard en utilisant des données de formation est également détaillée. Enfin, la méthode de quantification des échantillons inconnus en utilisant la courbe standard avec un script personnalisé est démontrée. Cette technique permet la quantification QRPA d'échantillons avec des concentrations inconnues et a de nombreux avantages par rapport en temps réel traditionnelle qPCR.

Protocol

1. Programmer le thermocycleur en temps réel QRPA Réactions

1. Créer un nouveau protocole dans le logiciel de cycleur thermique.
   1. Insérer une étape de pré-incubation: 39 ° C pendant 1 min.
   2. Ajouter une deuxième étape: 39 ° C pendant 20 s, suivie par une lecture de la plaque.
   3. Enfin, insérez un "aller à" qui répète la deuxième étape 59 fois plus.
   4. Enregistrer le protocole.
2. Créer une nouvelle plaque dans l'onglet "de l'éditeur de plaque" du logiciel. Sélectionnez puits de la plaque correspondant aux emplacements des réactions de l'APR (ici, l'utilisation des puits A1, A4-A8, B1 et B4-B8).
   NOTE: Il ne est pas important de savoir si le type de puits (par exemple, "Standard", "NTC") l'échantillon est précisée, l'analyse des données se fait en utilisant un script personnalisé.
   1. Pour les expériences contenant l'ADN du VIH-1 uniquement, sélectionnez l'option "HEX" fluorophore pour tous les puits. Pour les expériences contenant l'ADN du VIH-1 et un co positif internentrol, sélectionner à la fois "HEX" et "fluorophores FAM» pour tous les puits. Enregistrer la plaque.

2. Préparer pour les expériences du VIH-1 QRPA

1. Assemblez réactions de l'APR dans un espace de travail de pré-amplification désigné contenant pipettes désignés, embouts de pipette, vortex, et mini-centrifugeuse, comme par qPCR. Comme RPA peut amplifier une seule copie de l'ADN par autant que dix ordres de grandeur (données non présentées), manipuler et éliminer les tubes contenant des produits de post-amplifié ADN dans une zone post-amplification désigné.
   1. Empêcher le contact entre tous les réactifs pré-amplification et produits post-amplification. Vaporiser espaces de travail et l'équipement avec 50% de javel pré-amplification avant et après toutes les expériences. Utilisez une serviette en papier pour essuyer l'excès de l'eau de Javel.
2. Achat séquence amorce sens 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'et inverser séquence d'amorce 5'-CCC GAA AAT GAA TTT TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'à partir de synthétiseurs d'ADN commerciales. Achetez la séquence de sonde 5 'TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' de sources commerciales. Stocker les amorces et les sondes à 4 ° C dans des aliquotes à une concentration de 10 uM avant utilisation.
   NOTE: Le test QRPA amplifie une séquence unique VIH-1. Pour cet essai de preuve de concept, utiliser le plasmide pHIV-IRES eYFPΔEnvΔVifΔVpr décrit par Sutton et al., Qui contient la séquence cible ^16. Pour les expériences QRPA, le plasmide a été stocké à 4 ° C dans des aliquotes contenant 1, 10, 10 ^2, 10 ^{3, 4} et 10 copies par ml dans un tampon contenant Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM à pH 8,0, et 1 ng / ul d'ADN génomique humain porteur (360 486). Cette concentration de l'ADN vecteur est équivalente à la concentration de l'ADN obtenu à partir de kits d'extraction d'ADN dans le sérum du commerce utilisés pour le diagnostic de VIH-1 ^17. Celles-ci du VIH-1Des dilutions ont été utilisés comme matrices dans les réactions QRPA pour construire une courbe standard.

3. Assembler un VIH-1 QRPA courbe standard

1. Avant d'assembler les réactions QRPA, préparer l'espace de travail de pré-amplification comme décrit à l'étape 2.1.1. Placez un bloc de 96 puits froid dans le stockage à 4 ° C.
2. Préparer les réactifs pour 12 réactions:
   1. Déplacement de l'acétate de magnésium, le tampon de réhydratation, et la réaction de l'APR 12 pastilles à l'espace de travail pré-amplification.
   2. Décongeler l'acétate de magnésium et le tampon de réhydratation à la température ambiante.
   3. Aliquote 32,5 ul d'acétate de magnésium (2,5 pi par réaction) à un tube de microcentrifugeuse.
   4. Préparer un mélange 13x maître. Ajouter 383,5 pi du tampon de réhydratation (29,5 pi par réaction) à un microtube distinct pour le master mix. Ajouter 41,6 pi d'eau sans nucléase (3,2 pi) par réaction au mélange maître. Vortex mélange maître.
   5. Retour du aceta de magnésiumun tampon TE et la réhydratation de stockage à -20 ° C.
   6. Déplacez les amorces et sonde aliquotes du réfrigérateur à la zone de pré-amplification, éviter l'exposition de la lumière excessive pour minimiser photoblanchiment.
   7. Ajouter 27,3 ul chacun des 10 uM amorces sens et antisens (2,1 pi par amorce par réaction) au mélange maître.
   8. Ajouter 7,8 ul du VIH-1 sonde d'ADN de HEX marqué 10 uM (0,6 pi) par réaction au mélange maître.
   9. Retour amorces et la sonde au stockage.
3. Correspondant à la disposition de la plaque décrite à la section 1.2, placez une enzyme culot dans chacun des tubes d'extrême gauche et une enzyme culot dans chacun des cinq tubes d'extrême droite de deux de faible hauteur de 8 puits PCR barrettes de tubes.
4. Ajouter délicatement 37,5 pi de mélange maître à chaque tube contenant une pastille de l'enzyme, en utilisant un nouvel embout de pipette pour chaque tube et en remuant doucement le mélange maître et culot avec la pointe jusqu'à ce que la pastille est complètement dissous. Remuer délicatement pour éviter de formati bullessur, et retirer délicatement la pointe pour éviter toute perte du volume de réaction.
5. Après tous les granulés d'enzymes ont été réhydratés avec le Master Mix, récupérer le bloc 96 puits froid de 4 ° C stockage. Placez les barrettes de tubes PCR dans le bloc froid pour refroidir le mélange maître.
6. Alors que le mélange maître se refroidit, charger le logiciel cycleur thermique avec le protocole et la plaque décrit dans la section 1.
7. Couper deux bandes de micro-joint adhésif en plastique transparent à être légèrement plus large que les tubes PCR, et de récupérer deux plates PCR couvercles bande de tube.
8. Récupérer modèle 6 aliquotes de stockage (contenant 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^{3, 4} ou 10 copies du plasmide HIV-1 par microlitre).
9. Ajouter 10 ul de chaque modèle de tubes prévus à cet concentration de modèle. Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque tube, en remuant doucement la solution avec la pointe de mélanger le mélange maître et le modèle. Soyez sûr d'ajouter le modèle à l'emplacement exact de mATCH le plan de plaque décrit à la section 1.2.
10. Assurez-vous qu'un adaptateur de bande de tube PCR pour la microcentrifugeuse est en place.
11. Distribuer 2,5 ul d'acétate de magnésium dans chaque couvercle de tube qui sera placée sur un tube contenant un QRPA réaction.
12. Placez délicatement les couvercles sur le dessus des tubes PCR de sorte qu'ils ne sont pas complètement étanches et peuvent être enlevés. L'acétate de magnésium respectera les couvercles et être clairement visible d'en haut.
13. Insérer chaque bande de tube de PCR avec des couvercles de chaque côté du support de tube PCR. Fermez le couvercle de la Minifuge pour faire tourner le acétate de magnésium sur les couvercles et dans la réaction de RPA, déclenchant la réaction RPA. Centrifuger jusqu'à ce que toutes les bulles sont éliminées et tout le liquide est recueilli dans le fond de chaque tube (environ 10 secondes).
14. Supprimer rapidement les barrettes de tubes PCR et les retourner au bloc froid pour stopper les réactions QRPA.
15. Retirez délicatement les couvercles pour empêcher la formation d'aérosols et sceller chaque bande de tube PCR avec la coupemorceaux de film à micro-joint clair.
16. Marcher vite au cycleur thermique et charger les deux barrettes de tubes PCR dans le cycleur thermique dans les emplacements correspondant à la disposition de la plaque (puits A1-B8). Fermez le couvercle du thermocycleur, cliquez sur "Démarrer, Exécuter," et désigner un nom de fichier pour l'expérience.
    NOTE: Bien que le fabricant recommande agitation l'échantillon après 5 min d'incubation, cette étape ne est pas nécessaire pour cette analyse particulière et peut être omis.
17. Après la course est terminée, sélectionnez "Paramètres", "Cadre de référence», «Non Baseline soustraction" pour afficher les données de fluorescence premières. Exporter les données vers un tableur en sélectionnant "Exporter", "Exporter Toutes les fiches données vers Excel." Un fichier avec l'addendum "Résultats Quantification amplification" sera créée, contenant les données brutes de fluorescence en temps réel.

4. Développer un contrôle positif interne

1. Sélectionner une séquence d'ADN à partir d'une espèce qui est peu susceptible d'être trouvé dans l'échantillon cible. La séquence doit être plus long que l'amplicon cible de sorte que la génération de la séquence cible est favorisée.
   NOTE: Pour cet essai, Cryptosporidium parvum, un parasite intestinal, a été choisi pour servir de modèle pour la génération de la séquence IPC parce que ce est peu probable organisme se trouve dans le sang et était disponible dans le laboratoire d'un autre projet. Pour générer la séquence IPC, extraire et purifier l'ADN de C. oocystes parvum comme décrit par ailleurs ^18.
2. Achetez l'avant (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') et arrière (5' CCC GAA AAT GAA TTT TTT TTG TAA TTT TTT GTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') amorces provenant de sources commerciales. Les amorces de PCR utilisées CIB dans cet essai sont représentés sur la figure 1 et comprennent une région qui est complémentaire à la matrice D IPCNA (par exemple, C. parvum, pourpre sur la figure 1) et une région qui est complémentaire de l'organisme cible (par exemple, le VIH-1, le bleu sur la figure 1).
3. Faire la PCR en utilisant les amorces et l'ADN matrice CIB.
   1. Assembler 50 réactions ul PCR en utilisant le kit de réactifs Phusion haute fidélité de l'ADN polymérase selon les instructions du fabricant, à l'exclusion de la polymérase. Utiliser 2 ul de matrice d'ADN et Phusion Buffer HF.
   2. Ajouter la polymérase Phusion à chaque réaction après un démarrage à chaud à 98 ° C, suivie de 60 sec à 98 ° C, suivie de 40 cycles de 15 sec à 98 ° C, 30 secondes à 62 ° C, et de 30 sec à 72 ° C avec une extension finale à 72 ° C pendant 5 min. Après le cyclage thermique, maintenez échantillons à 4 ° C.
   3. Analyser les échantillons par électrophorèse sur gel sur un gel d'agarose TAE à 2%, puis extraire et purifier l'ADN en utilisant le kit d'extraction de gel QIAquick selon le protocole fourni avec de microcentrifugationle kit.
4. Tamiser les candidats IPC pour leur capacité à amplifier l'aide QRPA.
   1. Préparer réactions QRPA comme décrit dans la section 3, en utilisant du VIH-1 amorces, une sonde FAM marqué spécifiques à l'IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A -3 '), et un total de 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^{4, 5} ou 10 exemplaires de chaque candidat IPC par réaction, tester toutes les concentrations en double exemplaire.
   2. Choisissez le candidat IPC qui amplifie la plus constante et a la limite de détection-bas.
5. Co-amplifier le VIH-1 et l'IPC pour déterminer la concentration optimale de l'ADN CIB.
   1. Semblable à l'article 3, mélanger dans chaque réaction de 50 ul qui suit: 29,5 pi de tampon de réhydratation, 2,1 pi de RPA des amorce sens [10 uM], 2,1 pi de RPA amorce [10 uM] inverser, 0,6 pi de VIH-1 HEX sonde marqué au [10 uM], 10 pide l'ADN du VIH-1 à des concentrations variables, 2,5 ul d'acétate de magnésium, et une enzyme pastille. Au lieu d'ajouter 3,2 ld'eau exempte de nucléase comme l'a fait à l'étape 3.2.4, ajouter 0,6 pi de sonde IPC FAM marqué [10 uM], et 2,6 ul d'ADN CIB. Utiliser la concentration IPC qui est la limite de détection, de (LD) lorsque QRPA est effectuée avec de l'ADN IPC seul (LOD définie comme la plus faible concentration à laquelle la quantité de génération de signal de fluorescence est supérieur à celui généré par la fluorescence générée par les échantillons avec pas d'ADN cible).
   2. Incuber les échantillons en utilisant le protocole décrit dans la section 1.1.
   3. Si l'IPC ne amplifie pas dans tous les échantillons, envisager de renouveler l'expérience avec un IPC concentration un ordre de grandeur supérieur. La concentration optimale d'ADN CIB pour le dosage du VIH-1 est 10 000 copies / pl. Alors que les échantillons sont considérés comme valides se il est soit IPC ou le VIH-1 amplification de l'ADN, idéalement l'IPC présente amplification détectable pourchaque réaction.

5. Construire une courbe standard d'expériences multiples

1. Assurer que les données pour chaque expérience a été exporté vers un tableur comme décrit à la section 3.13.
2. Ouvrez et exécutez le script "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Toutes les entrées sont automatiquement invité dans la fenêtre de commande. Une fois le script est lancé, l'utilisateur est automatiquement invité à désigner le "Nombre de fichiers de données" utilisé pour construire la courbe standard.
3. Dans la fenêtre de commande, tapez le nombre de fichiers à être utilisé pour construire la courbe standard et appuyez sur Entrée.
4. Tapez dans la fenêtre de commande le nombre d'échantillons et le nombre de répétitions dans chaque fichier de formation (appuyez sur ENTRÉE après chaque entrée).
   NOTE: Dans le plan de plaque décrit à la section 1.2, il y avait 6 échantillons avec différentes concentrations et deux répliques de chaque échantillon).
5. Tapez dans la fenêtre de commande le plus bas DNUne concentration utilisée pour construire la courbe standard (en log10 copies) et appuyez sur Entrée (pour le plan de plaque décrit à la section 1.2, la concentration de modèle bas est 'une' log10 copies).
6. Type dans la fenêtre de commande la différence de concentration entre chaque norme (en log10 copies) puis appuyez sur Entrée (pour le plan de plaque décrit à la section 1.2, l'intervalle de concentration est 'une' log10 copies).
7. Après avoir été invité, tapez le "seuil de pente" dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée.
8. Dans la fenêtre de commande, tapez le "Nombre (z) des écarts-types au-dessus du fond pour le seuil positif", puis appuyez sur entrée. Les valeurs typiques pour z gamme 1-5.
9. Indiquez si les données ont été recueillies à l'aide du cycleur thermique ('1'), * .tiff images de microscope ('2'), ou * .jpg images de microscope ('3') en tapant le numéro «1», «2», ou '3,' et pRessing entrer.
10. Choisissez de fixer un nouveau seuil IPC ou d'utiliser une valeur par défaut pour le seuil en tapant 'y' ou 'n,' respectivement, lorsque vous êtes invité.
11. Ensuite, sélectionnez chacun des fichiers de tableur utilisés pour construire la courbe standard.
    NOTE: Le script va ensuite importer automatiquement les données HEX et de fluorescence FAM; déterminer si chaque réaction était valide (à savoir si les signaux de fluorescence ont dépassé les seuils pour le HEX ou canaux FAM); déterminer le coefficient r ² pour une exponentielle, linéaire et de second ordre ajustement polynomial; complot "log10 copies par rapport au seuil de cycle" pour chaque échantillon utilisé pour construire la courbe standard; et créer un fichier de tableur contenant des variables essentielles pour reconstruire la courbe standard pour des expériences de validation sans que l'utilisateur à entrer de nouveau tous les paramètres d'entrée à nouveau.

6. Test de validation et la quantification des échantillons en utilisantLa courbe standard

1. Utilisez le script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" pour estimer la précision et l'exactitude de l'essai en utilisant des échantillons avec des concentrations connues ou l'utiliser pour quantifier les échantillons avec des concentrations inconnues.
   NOTE: Parce que la recherche publiée précédemment montré qu'un ajustement exponentiel a donné le meilleur coefficient de r-squared ^18, ce script utilise un ajustement exponentiel pour la courbe standard. Si un type d'ajustement différente est souhaitée, le script peut être modifié en conséquence.
   1. Ouvrez et exécutez le script "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Une fois le script est lancé, l'utilisateur est automatiquement invité à saisir toutes les entrées dans la fenêtre de commande.
   2. Entrez «1» pour valider un essai utilisant une courbe standard avec des concentrations d'échantillons connus ou entrer «2» pour quantifier des échantillons inconnus.
   3. Lorsque vous êtes invité, soit sélectionner une courbe standard enregistré ou en construire un nouveau en entrant einformations de e qui est automatiquement sollicité dans la fenêtre de commande (même de l'information qui est nécessaire pour le script "JoVE_qRPA_standard_curve.m" de la section 5).
   4. Tapez le nombre d'expériences (ce est à dire, fichiers de tableur) pour analyser pour la validation / quantification.

7. Préparation de la collecte des données en utilisant un microscope à fluorescence et une puce chauffée

1. Assurer le microscope de fluorescence a un chauffe-scène et régulateur de température 1-Channel High Precision stabilité en place.
2. Se assurer que le microscope à fluorescence possède un cube de filtre pour collecter et exciter la fluorescence de chaque fluorophore. Exciter et de collecter la fluorescence FAM générée pendant l'amplification de l'ADN CIB à travers un filtre de la GFP (excitation BP 470/40 nm, émission 520/50 nm BP). Exciter et de collecter la fluorescence générée lors de HEX HIV-1 DNA amplification à travers un filtre de HEX (BP excitation 530/30 nm, émission 575/40 nm BP).
3. Utilisez le logiciel d'édition de script de microscope pour créer un algorithme automatisé pour répliquer les données de collecte sur le cycleur thermique.
   1. Insérez d'abord une étape "Paramètres" pour fermer l'obturateur. Ensuite, ajoutez une "exposition" étape pour régler l'exposition à 60 sec. Insérez un "Snap" pour exécuter le retard de 60 sec, qui met en œuvre la période de pré-incubation de 1 min. Ajouter un "réglage" étape pour changer le groupe de travail sur le filtre de la GFP. Insérez un autre "Exposition" étape pour régler l'exposition à 200 ms. Toutes les expositions à l'aide du GFP ou les filtres HEX cubes seront mis à 200 ms.
   2. Après l'étape "d'exposition", ajouter un "Snap" et spécifier la caméra avec laquelle l'image sera prise. Utilisez une autre étape "Configuration" pour fermer l'obturateur et un "Enregistrer l'image" étape pour enregistrer l'image dans un dossier temporaire défini par l'utilisateur.
   3. Interrupteur à côté du cube de filtre HEX utilisant une autre étape et e "Réglage"en ajouter une «exposition» à 200 ms, un «Snap," et un "Enregistrer l'image" étape.
   4. Répétez ce processus 59 fois avec un retard initial de 20 secondes au lieu de 60 (près déclencheur, attendez 20 secondes, passez à filtre GFP cube, régler l'exposition à 200 msec, snap, près obturation, enregistrer, commutateur filtre HEX cube, exposition définie à 200 msec, snap).
4. Créer une puce qui contiendra réactions QRPA.
   1. Pour les expériences utilisant le microscope, utilisez le fichier JoVE_qRPA_base.ai pour couper une base rectangulaire de 40 x 15 mm à partir d'une feuille de 1/8 "d'épaisseur acrylique noir avec un cutter laser sur la puissance de 100%, la vitesse de 10%.
   2. Utilisez le fichier JoVE_qRPA_well.ai couper réaction bien formé d'un carré de 10 x 10 mm avec un diamètre trou circulaire réduction de 5 mm à partir d'une feuille de 1,5 mm d'épaisseur en acrylique clair.
   3. Fixez jusqu'à trois puits à une base unique à l'aide de gel superglue.
   4. Sécher pendant la nuit.

8. Collecte de données et Analysis l'aide d'un microscope à fluorescence

1. Préparer le microscope pour la collecte des données en chargeant le script automatique de collecte de données JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. Réglez le chauffe-étape à 48 ° C et préchauffer la puce de réaction sur le chauffe-scène pour environ 20 min. Un réglage de température de 48 ° C maintient une température de 39 ° C dans le puits de réaction (données non présentées).
   2. En utilisant un objectif 10X, 0,45 NA, se concentrer sur la partie supérieure du bord intérieur de la cuvette de réaction avec le filtre de la GFP à la place. Les bords de l'acide acrylique sont autofluorescentes après découpe au laser et peuvent être facilement visualisés. Après mise au point, ne pas ajuster la hauteur de la platine du microscope jusqu'à ce que toutes les données sont collectées.
2. Monter le mélange maître QRPA dans un espace de travail de pré-amplification désigné comme décrit à l'étape 4.5.1. Pour chaque échantillon, mélanger un culot enzyme, mélange maître, et le VIH-1 matrice d'ADN dans un tube à centrifuger. Ajouter 2,5 pi d'acétate de magnésium à la première reaction et vortex brièvement.
3. Transporter rapidement le tube de microcentrifugation contenant l'échantillon QRPA au microscope à fluorescence.
   1. Pipetter prudemment 30 pi de la réaction de RPA dans le puits de réaction sans créer de bulles. Placez une goutte de PCR-huile minérale de qualité au cours de la réaction de RPA pour éviter l'évaporation.
   2. Placez le bien directement sous l'objectif du microscope, en prenant soin de l'image seulement le centre du puits, aucun des bords acryliques auto-fluorescent. Après le puits est positionné, exécutez le script automatisé 7. Le script génère une image JPEG en utilisant le filtre FAM cube et une image JPEG en utilisant le cube de filtre HEX toutes les 20 secondes.
4. Une fois le script terminé, transférer ces images sur le dossier de stockage temporaire avant d'exécuter des échantillons supplémentaires.
   1. Créez deux dossiers: une pour chaque fluorophore (c.-à «HEX» et «FAM»). Conservez les dossiers dans le même dossier parent. Dans chaque fluorophorele filtre, créer un dossier marqué avec le nombre de copies d'ADN présentes dans l'échantillon (par exemple, 0, 10, etc.).
   2. Transférer tous les fichiers avec le préfixe «HEX» dans le sous-dossier correspondant dans le dossier «HEX». Transférer tous les fichiers avec le préfixe «GFP» dans le sous-dossier correspondant dans le dossier «FAM».
5. Répétez les sections 8.2 à 8.4 pour les réactions QRPA avec 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ⁴ et 10 ⁵ VIH-1 copies d'ADN.
6. Après la collecte des données pour tous les échantillons QRPA dans une expérience, charger le script "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Lorsque vous êtes invité par le script, sélectionnez le dossier parent contenant les deux dossiers de fluorophores, qui à leur tour contiennent les images pour chaque concentration dans les sous-dossiers.
   NOTE: Le script va générer automatiquement un fichier de tableur dans le répertoire parent dans lequel les données de fluorescence HEX seront enregistrées dans un nam feuilleed 'HEX ", et les données de fluorescence FAM seront enregistrés dans une feuille nommée« FAM ». Dans chaque feuille, le nombre de cycle est listé dans la colonne B, et les données de fluorescence en temps réel pour des concentrations de plus en plus gabarit sont données dans les colonnes C, D, etc. Chaque donnée de fluorescence en temps réel est l'intensité de fluorescence moyenne de l'image capturée à ce point de temps.
7. Utilisez la fonction de nuage de points par défaut dans le tableur pour tracer les cellules B2: H61 de la «HEX» et feuilles »FAM» pour visualiser la fluorescence en temps réel et générer des tracés similaires à celles sur les figures 2A, 2B, 3A et 3B.
   REMARQUE: La feuille de calcul générée à l'étape 8.6 peut aussi être utilisé dans les scripts "JoVE_qRPA_standard_curve.m" et "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Representative Results

Discussion

Afin d'obtenir des données de quantification significatives en utilisant l'algorithme MATLAB, l'utilisateur doit sélectionner des valeurs d'entrée appropriées lorsque vous êtes invité. Après l'ouverture de chaque script dans les sections 5 et 6, toutes les variables d'entrée sont automatiquement sollicités dans la fenêtre de commande et sorties sont générés automatiquement. Dans la section 5.7 l'utilisateur est invité à sélectionner un seuil de pente. La valeur du seuil de pente affecte le carré du coefficient de corrélation (r ²⁾ de la forme. Lors de l'utilisation des données de fluorescence premières exportées d'un cycleur thermique, des valeurs comprises entre 2,0 et 5,0 ont tendance à donner un r ² haut coefficient. Dans la section 5.8, l'utilisateur doit indiquer le nombre d'écarts-types au-dessus du fond de fixer le seuil positif. Pour marquer un échantillon comme positif ou négatif, le script détermine automatiquement _{l'échantillon} différence de Δ entre le maximum et la fluorescence minimum pour chaque échantillon en utilisant les données de fluorescence premières exportées de la Thermal cycleur. Il calcule la différence moyenne Δ _{de fond} et l'écart type σ _{arrière-plan} pour tous les échantillons de contrôle non-cibles. Un échantillon est considéré comme positif si _{l'échantillon} est supérieure à Δ z × Δ σ _fond au-dessus de _fond. Dans la section 5.10 l'utilisateur décide d'utiliser ou non le seuil de défaut ou définir un nouveau seuil. Si l'utilisateur souhaite établir un nouveau seuil, déterminer le nouveau seuil expérimentalement en effectuant trois expériences contenant chacun 12 réactions de l'APR sans VIH-1 ADN présent. Réglez le seuil à la hausse moyenne de l'intensité de fluorescence de ces expériences plus 3 écarts-types. Après avoir terminé la section 6, le script JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m retourne automatiquement la concentration d'ADN estimée pour chaque réaction QRPA (en log10 copies). Si le script ne détermine que l'ADN du VIH-1 était présente dans l'échantillon, la concentration estimée est listé comme étant «Negatif pour le VIH »ou« non valide », selon que le signal fluorescent pour le contrôle positif interne a dépassé le seuil (z × σ _fond + Δ _{arrière-plan).} Si l'utilisateur de valider la courbe standard avec des concentrations connues de l'échantillon, le script retourne également une table additionnelle semblable à celui du tableau 1.

Afin de développer un test de l'APR en temps réel qui fournit une quantification précise, la cohérence expérimentale est crucial. Par exemple, utiliser les mêmes amorce et de sonde aliquotes à la fois pour la courbe standard et expériences de validation. Evitez également les cycles de gel-dégel en stockant les amorces et sonde aliquotes à 4 ° C entre les expériences plutôt que -20 ° C. Les aliquotes de modèle utilisées pour les expériences de courbes standards et de validation sont stockés de la même manière. APR granulés d'enzymes et de réactifs provenant du même lot sont utilisés selon les recommandations du fabricant. Enfin, becautiliser RPA manque de véritables «cycles» de contrôler précisément le taux d'amplification, normalisation des étapes utilisateur est absolument impératif. Lors de l'assemblage des réactions, l'utilisateur doit toujours suivre les mêmes étapes dans le même ordre, les dépenses à peu près la même quantité de temps sur chaque étape. Réactions doivent toujours être mélangés délicatement avec un nouvel embout de pipette et bulles doivent toujours être éliminés. Avant l'amplification, les réactions doivent être maintenus à une température constante, et le cycleur thermique ou logiciel de microscope doivent toujours être préparés avant de charger réactions pour éviter toute amplification à des températures sous-optimales qui pourraient influer sur la quantification. Toute variation dans les conditions initiales de réaction peut entraîner des incohérences dans les résultats expérimentaux.

Lors de l'utilisation d'un microscope pour recueillir des données, des variables supplémentaires doivent être contrôlées pour minimiser la variation d'intensité de fluorescence. Toutes les réactions doivent être placés dans la même région le plus chaud de l'étape, et l'microscope doit être axée sur la même région du puits pour chaque échantillon. Même si ces méthodes sont suivies, les données de fluorescence sur un microscope recueillies peuvent présenter une variabilité due à des taches lumineuses locales qui forment naturellement au cours des réactions de l'APR, la formation de bulles à l'intérieur des chambres de réaction, ou photoblanchiment résultant d'une exposition répétée à la lumière d'excitation. L'influence de ces variables est évident dans les données de fluorescence collectées sur le microscope (figures 4A et 4B), qui démontrent la variabilité de base, des pics et des creux. Ces caractéristiques sont absentes des données de fluorescence sont collectées sur le thermocycleur (figures 3A et 3B). En fin de compte, la collecte de données sur le microscope est à des fins de preuve de principe seulement et le test final sera mis en œuvre sur un lecteur de fluorescence champ utilisable avec une géométrie plus précise et le contrôle du logiciel qui minimise ces variables.

Une autre importanteaspect du processus de développement d'essai QRPA est la cohérence dans le traitement des données. Le protocole décrit dans la section des méthodes utilise des scripts pour traiter les données de fluorescence premières (stockées dans un fichier tableur) recueillies auprès d'un cycleur thermique ou d'un microscope. Toutes les expériences utilisées pour construire la courbe d'étalonnage doivent être formatées à l'identique. Lors de l'utilisation d'un cycleur thermique pour recueillir des données, le même plan de plaque doit être utilisé, et de données provenant des puits qui ne contiennent pas de réactions APR ne doit pas être exportée. Lors de l'utilisation d'un microscope à recueillir des données, le format des données doit correspondre au format des données automatiquement exportées du cycleur thermique. Par exemple, les données ne cible-contrôle doivent être dans les cellules C2: C61, et des données pour l'augmentation des concentrations de modèle doit être dans les cellules D2: D61, E2: E61, etc. Se il ya plusieurs répétitions de chaque concentration dans une expérience, la série 2 ^e répliquer dilution doit être ordonné gauche à droite de l'absence de contrôle de la cible (CNT) à la plus haute concentration etenregistrée dans les colonnes immédiatement à la droite ^de la 1 ^ère série de dilutions répliquée. Par exemple, dans le plan de plaque utilisée dans la section 1.2 avec deux répétitions pour chaque échantillon, les données de fluorescence pour le premier double de chaque échantillon dans la série de dilution doivent être enregistrés dans les cellules C2: les données de H61 et de fluorescence pour la deuxième double de chaque échantillon dans la série de dilution doit être enregistré dans les cellules I2: N61. Pour le plan de plaque utilisé dans la section 1.2, ce est la mise en forme lors de l'exportation de données à partir du logiciel cycleur thermique d'une feuille de calcul par défaut.

Les données représentatives prévues à partir d'expériences VIH-1 QRPA démontrent le soutien proof-of-concept qui RPA peut être utilisé pour la quantification de la concentration de l'acide nucléique dans les échantillons inconnus. VIH-1 tests de charge virale cliniquement utiles ont une portée clinique d'au moins quatre ordres de grandeur, une précision de 0,5 log10 copies, et un seuil de détection-des-d'au moins 200 exemplaires ^19,20. Le VIH-1 test d'ADN décrite répond à ces crIteria et est plus précise à de faibles concentrations, comme indiqué dans le tableau 1. Par conséquent, avec l'inclusion d'une étape de transcriptase inverse, ces résultats suggèrent que un dosage du VIH-1 par RT-RPA peut avoir le potentiel pour mesurer le VIH-1 de la charge virale dans des échantillons cliniques. Lors du développement d'un dosage QRPA, en ajustant les paramètres de l'algorithme peut régler la plage dynamique de sensibilité et linéaire en fonction des besoins cliniques. La figure 6 montre que l'ajustement z (un paramètre qui détermine le seuil pour les échantillons positifs) peut influencer la sensibilité et la précision à basse et haute Les concentrations cibles. En outre, il peut être possible d'augmenter la résolution et la précision de quantification des réactions par incubation à une température inférieure ou moins en utilisant de l'acétate de magnésium, ce qui diminue le taux d'amplification.

Cette preuve de concept QRPA dosage peut être utilisé pour quantifier la concentration des échantillons contenant de l'ADN du VIH-1. Le dosage QRPA décrit dans ce manuscript comprend des instructions détaillées sur la façon d'assembler des réactions de l'APR en temps réel, de développer et cribler une IPC, et de traiter les données de fluorescence premières pour construire une courbe standard qui peut être utilisé pour quantifier des échantillons inconnus. Avec les instructions détaillées incluses, ce protocole peut être adapté pour quantifier la concentration d'ADN dans une grande variété d'échantillons.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI