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Article de méthode

Un grand latéral Craniotomie Procédure pour Mesoscale grand champ d'imagerie optique de l'activité cérébrale

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DOI :

10.3791/52642

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7 mai 2017

 ,  ,  ,  , 
1Canadian Center for Behavioural Neuroscience, University of Lethbridge

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente un procédé pour créer un grand craniotomie unilatéral sur les régions temporales et pariétales du cortex cérébral de souris. Ceci est particulièrement utile pour l'imagerie en temps réel sur une vaste zone d'un hémisphère cortical.

Résumé

Le craniotomie est une procédure généralement effectuée pour exposer le cerveau pour des expériences in vivo. Dans la recherche de la souris, la plupart des laboratoires utilisent une petite craniotomie, typiquement de 3 mm x 3 mm. Ce protocole présente un procédé pour créer un 7 mm x 6 mm fenêtre crânienne exposer plus d'un hémisphère cérébral au cours des souris cortex pariétal et temporal (par exemple, bregma 2.5 à 4.5 mm, latéral à 0 - 6 mm) sensiblement plus grande. Pour effectuer cette opération, la tête doit être inclinée d'environ 30 ° et une grande partie du muscle temporal doit être rétracté. En raison de la grande quantité d'élimination des os, cette procédure est destinée uniquement aux expériences aiguës avec l'animal anesthésié tout au long de la chirurgie et l'expérience.

Le principal avantage de cette innovante grande fenêtre crânienne latérale est de fournir un accès simultané aux deux zones médiale et latérale du cortex. Cette grande fenêtre crânienne unilatérale peut être utilisée pour étudier la dynamique entre les cellules nerveuses,ainsi qu'entre les différentes zones corticales par la combinaison des enregistrements électrophysiologiques multi-électrodes, l' imagerie de l' activité neuronale (par exemple, l' imagerie intrinsèque ou extrinsèque), et la stimulation optogenetic. De plus, ce grand craniotomie expose également une grande surface des vaisseaux sanguins corticales, ce qui permet une manipulation directe de la vasculature corticale latérale.

Introduction

Le craniotomie est une procédure standard utilisée par les neuroscientifiques pour révéler une partie du cerveau. Depuis l'aube de l'électrophysiologie, la craniotomie a permis des avancées sans précédent dans le domaine des neurosciences. cartographie Dense du cortex cérébral avec des électrodes a conduit à des expériences de tester des hypothèses et des théories basées sur ces cartes. Nous avons récemment entré dans une nouvelle ère où la craniotomie est utilisée pour l'imagerie in vivo de débit sanguin cortical 1, 2, 3 et de l' architecture neurovasculaire 4, ce qui permet la visualisation en temps réel de l' activité corticale dans les zones exposées 5, 6, 7. Bien que de nombreuses études utilisent des craniotomies combinées avec des techniques in vivo d'imagerie optique pour étudier la structure et la fonction des neurones corticaux, des cellules gliales, et corvasculature tical 8, 9, d' autres enquêtes sont limitées par de petites zones du cortex exposé (mais voir 10).

Le but de ce protocole est de fournir un procédé pour créer un grand craniotomie latéral, ce qui expose le cortex cérébral de la ligne médiane de la Squamosal, et allant au-delà bregma et lambda. Cette grande craniotomie permet la visualisation simultanée des cortex associatifs (rétrosplénial, cingulaire et pariétal), le moteur primaire et secondaire, somatosensoriel, visuel et le cortex auditif. Cette méthode a été précédemment couplé avec l' imagerie tension de colorant sensible (VSDI) pour étudier comment de multiples aires corticales interagissent entre eux au cours de l' activité corticale spontanée et induite par stimulus-5, 11, 12. Les aspects les plus difficiles de cette procédure comprennent le positionnement de la têtede l'animal, la fixation de la plaque de tête, et d'éviter une hémorragie tout en séparant le muscle temporal de l'os pariétal. Il faut aussi prendre au cours des processus de forage et d'enlèvement du crâne comme les courbes de crâne sous un angle oblique.

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Protocole

Le protocole suivant suit les directives Université de Lethbridge Comité de protection des animaux (ACC) et est conduite conformément aux normes du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA).

1. Préparation

  1. Pour les périodes d'études prolongées, autoclave toutes les fournitures chirurgicales ouvertes et veiller à ce que la stérilité est maintenue tout au long de la chirurgie. Si plusieurs interventions chirurgicales sont nécessaires, autoclave entre les chirurgies.
  2. Assurez-vous qu'il ya beaucoup de tampon du cerveau à portée de main (au moins 50 ml). La solution est composée de 134 mM de chlorure de sodium, de potassium 5,4 mM, 1 mM d'hexahydrate de chlorure de magnésium, 1,8 mM de dihydrate de chlorure de calcium, le sodium et 5 mM de HEPES, pH équilibré à 7,4 avec 5 M de chlorure d'hydrogène.
  3. Placer la souris dans une chambre d'induction et anesthésier avec 3-4% d'isoflurane. Suivez avec 1,0 à 2,0% isoflurane pour l'entretien pendant la chirurgie. Réduire encore aussi bas que de 0,4 à 0,8% au cours de l'imageries = "xref"> 5, 13, 14, 15, à condition que l' anesthésie appropriée est maintenue. Ces faibles niveaux d'anesthésie nécessitent une surveillance vigilante et fréquente de la souris (environ toutes les 5 minutes) pour qu'il reste aréflexique aux stimuli douloureux.
    REMARQUE: Déshydratation peut devenir problématique en raison de la surface élevée au rapport de volume de la souris et exacerbée par une utilisation prolongée de l'isoflurane.
    1. Utiliser des injections sous-cutanées de sérum physiologique, 0,1 ml par 10 g de poids corporel, toutes les 1 - 2 h. Lorsque suffisamment hydratée, la souris urinera une fois tous les 1 - 2 h.
  4. surveiller de près la souris pour assurer une anesthésie tout au long de la chirurgie et cohérente imagerie. Ne laissez pas sans surveillance souris et prendre soin qu'il regagne jamais conscience.
  5. Transférer la souris anesthésiée à la mise en place tête porte et le placer sur un coussin chauffant thermo-régulation réglé à 37 ° C. Fixer les teet supérieursH dans un porte-dents.
  6. Tournez la tête de la souris vers la gauche à environ 30 ° pour exposer le côté latéral droit de la tête et fixez la tête de la souris avec l'extrémité émoussée des barres de l'oreille ( Figure 1A ).
  7. Appliquer une pommade ophtalmique pour éviter le séchage de la cornée.
  8. Pour réduire l'œdème cérébral, injecter dexaméthasone (4 mg / kg) par voie intramusculaire.
  9. Essuyez la peau sur la zone chirurgicale avec des écouvillons de coton trempés dans 4% de chlorhexidine (3 fois) et 70% d'éthanol (3 fois). N'utilisez chaque coton-tige qu'une seule fois.
  10. Don gants chirurgicaux et recouvrir l'animal avec une pellicule plastique adhésive. Fournir de l'anesthésie local en injectant de la lidocaïne (8 à 10 mg / kg, 2% d'épinéphrine) par voie sous-cutanée sur le site de la craniotomie. Attendez 3 à 5 minutes pour que le médicament soit absorbé dans le tissu.

2. Suppression de la peau et retrait du muscle du crâne

  1. Effectuez presque toutes ces procédures tout en regardant le crâne sous unmicroscope disséquant (par exemple, 0,7 - puissance 4.5X, en fonction de la situation).
  2. Soulevez la peau 1 mm à gauche de la ligne médiane (juste derrière l'oreille) avec une pince et faire une petite incision horizontale avec des ciseaux chirurgicaux.
  3. Ajouter un 5 - 6 mm découpe latérale vers l'oreille droite, puis coupé vers l'extrémité rostrale de la tête.
  4. Au point d'incision initial, insérer les ciseaux et couper 10 mm rostral.
  5. Couper la peau autour de l'oreille droite et près de l'œil droit d'exposer le côté droit du crâne et du muscle temporal. Assurez-vous que la partie la plus large de la zone exposée est d'au moins 7 mm. Coupez la peau plus si la zone chirurgicale doit être étendue.
  6. Fixer la peau autour de l'incision en mettant quelques gouttes de colle cyanoacrylate butyle entre le crâne et la peau. Assurez-vous que le tissu a été préalablement séché avec des applicateurs à bout de coton ou des tissus laminés pour augmenter l'efficacité de l'adhésif.
  7. L'utilisation d'un coton-tige, frotter la surfacedu crâne dans un mouvement circulaire pour enlever le périoste du crâne. Veiller à ce que personne ne reste en séchant complètement le crâne.
  8. En utilisant des ciseaux et des pinces à ressort, séparer le muscle temporal du crâne; couper et retirer le muscle latéralement jusqu'à la Squamosal (Figure 1C). Prenez soin de ne pas endommager la veine temporale superficielle qui longe le niveau de l'os squamosal près de l'œil, sinon une hémorragie pourrait se produire.
  9. saignement de contrôle de mousse de gel pré-imprégné dans le tampon de cerveau. Pour utiliser une grave hémorragie cauterizer de chaleur. Déposer la colle cyanoacrylate de butyle sur les sites de saignement après traitement avec le cauterizer de chaleur. Vérifiez que la zone est préalablement séché à l'aide d'applicateurs à bout de coton ou des tissus laminés pour augmenter l'efficacité de l'adhésif.

3. Craniotomie

NOTE: Le chirurgien doit faire preuve de diligence lors de l'enlèvement du crâne etDure pour éviter des complications inutiles. Les étapes de dépannage sont incluses si des complications surviennent.

  1. Marquez l'emplacement de bregma soit avec un marqueur à pointe fine, soit coupez un petit morceau de morceau triangulaire et pointez un coin à bregma ( Figure 2A ) pour orienter les régions cérébrales sous-jacentes.
  2. Avant d'apposer la plaque de tête, assurez-vous que le crâne est complètement sec. Le crâne séchera rapidement à l'air après l'application de la mousse de gel trempée dans un tampon de cerveau, si un plus grand séchage est nécessaire, utilisez des écouvillons de coton. Cette étape est cruciale pour la fixation de la plaque de tête ( figure 1B ).
    REMARQUE: S'il y a du périoste laissé sur le crâne, ou si le crâne n'est pas sec avant de coller sur la plaque de tête, il se détachera probablement. Si cela se produit, retirez doucement la plaque avant et recommencez. Des saignements peuvent survenir au cours de ce processus; Laisser quelques minutes pour le coaguler, puis retirer doucement. Ce processus n'est pas recommandé de répéter plus de deux fois.
  3. Appliquer une colle cyanoacrylate d'éthyle autour du bord inférieur de la plaque de tête 16 et coller la plaque de tête sur la zone de craniotomie ( Figure 1D et Figure 2A ).
  4. Remplissez l'espace d'ouverture entre le crâne et la plaque de tête avec du ciment dentaire en laissant seulement la zone de craniotomie exposée. Attendez que le ciment dentaire séche et durcisse, typiquement de 5 à 10 min ( figure 2B ).
    1. Une fois le ciment réglé, remplir brièvement le puits avec un tampon de cerveau et laisser tremper pendant 3 à 5 minutes. Utilisez un tissu enroulé pour éliminer le tampon du cerveau avant le forage ( Figure 2C ).
  5. Décrivez la zone chirurgicale en marquant légèrement la surface du crâne avec une perceuse dentaire. Utilisez une perceuse pneumatique (réglée à maximum 20 PSI), avec une bague FG ¼ et commandée avec une pédale à pédale variable.
  6. Tracez délicatement le foret le long de la marque originale pour l'approfondir, essurer le forage ne pénètre pas à travers le crâne dans le cerveau (figure 2D). Se relaient toutes les quelques minutes entre le forage et tamponner la surface du crâne avec des tissus laminés humidifiés. Cela permettra de réduire le chauffage et le séchage du crâne de friction mécanique et une exposition prolongée.
    NOTE: Le crâne sera diffusé rapidement sec après application de la mousse de gel humide. Si le séchage plus est nécessaire, utiliser des tampons de pointe de coton.
    Attention: Le crâne est inégale d'épaisseur. Par exemple, la crête pariétale-temporelle est la plus épaisse, tandis que les régions du crâne près de la ligne médiane et les repères squamosal sont relativement minces.
  7. Au cours du forage, de vérifier périodiquement pour le flambement du crâne en appuyant doucement sur elle avec une pince ou l'outil de forage non-mobile. Lorsque l'os commence à boucle, arrêter le forage et plonger toute la fenêtre dans le tampon du cerveau.
    NOTE: Si le sang se précipite hors d'une zone, il peut suggérer que la dure-mère a été endommagé. Si tel est le cas, placez un ETMi-humide mousse de gel sur la zone et essayer pour absorber le sang tout en appliquant une légère pression à la mousse de gel avec un tampon de coton-tige.
  8. Attendre au moins 5 minutes avant l'enlèvement du crâne pour adoucir l'os et à réduire le risque de la dure-mère coller à l'os, ce qui rend le procédé d'élimination du crâne plus facile.
  9. Effectuer le processus de suppression du crâne tandis que le crâne est immergé dans un tampon du cerveau.
    NOTE: Si une partie du crâne reste obstinément attaché, une lame de scalpel # 11 peut être utilisé pour marquer doucement le crâne. Prenez soin de ne pas percer la lame à travers le crâne et dans le cerveau.
  10. A partir du bord antérieur, soulever doucement le crâne en vrac à partir de la dure-mère à l'aide de pinces.
    NOTE: Si une petite quantité de saignement se produit au cours du processus de retrait du crâne, retirez le tampon avec une pipette de transfert ou d'une seringue, puis remplacer par un nouveau tampon.
  11. Une fois que l'os est lâche et « flottant » sur la dure-mère, saisir fermement l'os avec une pince et soulever l'os dela dure-mère. Assurez-vous de l'os ne pénètre jamais dans le cerveau.
  12. Pour contrôler le saignement, rouler le coin d'un tissu en un point et éliminer la majeure partie de la mémoire tampon à partir du puits crânienne. appliquer rapidement une mousse de gel, pré-imprégné dans le tampon, dans la zone de saignement tout en ajoutant une très légère pression avec un tampon de coton-tige.
    NOTE: Le saignement provient généralement du bord de l'os ou la surface de la dure-mère; les deux cas sont normaux et des saignements cesseront rapidement si aucun des principaux vaisseaux sanguins sont endommagés. Si le saignement continue, le sang peut remplir la totalité de la fenêtre, la formation d'une feuille de caillot sur la zone de formation d'image.
    1. Pour retirer la feuille de caillot, soigneusement ramasser des morceaux de sang coagulé de la zone d'imagerie tout en laissant le caillot sanguin intact autour de la source du vaisseau sanguin rompu. Prenez soin de ne pas enlever le caillot de sang de la source de saignement car cela pourrait causer encore plus la perte de sang. Irriguer la surface du cerveau avec un tampon de cerveau pour laver du sang.
    2. Faites attention à ne pas toucher latissu délicat du cerveau ou en ajoutant des corps étrangers au cerveau; répéter jusqu'à ce que le saignement a cessé, pendant environ 2-5 min (Figure 2E).
      NOTE: A ce stade, le craniotomie est prêt pour la préparation de la fenêtre crânienne (voir étape 5). Si nécessaire, retirez la dure-mère avant l'implantation de la fenêtre crânienne (voir étape 4).

4. Dura Retrait

REMARQUE: Dura suppression nécessite beaucoup de soins et peut prendre plus de 15 minutes.

  1. Éloigner le tampon en excès de la craniotomie. Tout en maintenant une surface humide, prendre un petit morceau de la dure-mère avec une pince et doucement déchirer la dure-mère.
  2. Utiliser des pinces et des ciseaux à ressort à déchirer doucement et couper la dure-mère.
  3. Laissez tomber le tampon plus de cerveau sur la surface du cerveau pour faire flotter la dure-mère et l'aider à séparer du cerveau. Continuer jusqu'à ce que tous Doura est retiré du site de fenêtre crânienne. Quand elle est réalisée correctement le cerveau semble être très propre avec bl distinctevaisseaux ood et sans défauts (comparer avec la figure 2E 2F).
    Attention: Certaines zones de la dure - mère sont attachés à petites artérioles sur la surface du cerveau (par exemple, près de l' extrémité proximale de la ligne médiane de la zone d'association pariétale), et le retrait d' une telle rupture peut l'artériole. Dans de tels cas, il peut être préférable de laisser un petit morceau de Doura intact au-dessus de l'artériole. Le VSD ne peut pas pénétrer dans cette petite zone, mais cela est préférable d'avoir des saignements majeurs.
  4. Fixer la surface du cerveau dans de l'agarose, dès que possible pour minimiser les mouvements de pulsation et d'empêcher en outre le gonflement (voir l'étape 5).

5. Préparer la fenêtre crânienne

  1. Vaporiser le couvercle en verre avec 70% d'éthanol et en utilisant une cartouche d'air à sécher délicatement. Assurez-vous que le verre est complètement propre, sans taches ou de la poussière présente.
  2. Préparer 1,3% d'agarose par chauffage de 200 mg de poudre d'agarose dissous dans 15 ml de tampon de cerveau. Réglez le microWAvancer à haute et chauffer pendant 10 à 15 s à la fois, remuer doucement, jusqu'à ce que toute gélose soit dissoute.
    Remarque: Assurez-vous qu'aucune bulle ou particule n'est présente, car cela interférera avec l'imagerie.
  3. Placez un thermomètre dans l'agarose chaud et refroidissez l'agarose jusqu'à une température de solidification (~ 40 ° C).
    REMARQUE: L'utilisation d'eau froide sur l'extérieur du récipient d'agarose peut accélérer le processus de refroidissement. Mélanger légèrement en continu afin de s'assurer qu'aucune bulle ou particule ne soit présente.
  4. Immédiatement avant d'appliquer la gélose, retirer le tampon du cerveau du puits cranial. Dessinez l'agarose avec une pipette de transfert et déposez l'agarose directement sur le cerveau. Placez rapidement le couvercle sur la surface et fixez le capot avec des gouttes d'agarose sur les coins.

6. Euthanasie

REMARQUE: Dans notre expérience, cette procédure nécessite des chirurgiens expérimentés d'au moins 3 à 4 cabinets d'entraide pour atteindre plus de 90%taux de réussite. Les chirurgiens moins expérimentés peuvent exiger encore plus pratique. Au cours de la craniotomie ou durotomie, le cerveau peut subir des dommages, comme si les coups de poing de forage à travers l'os dans le cerveau. Certains dégâts mineurs au bord de craniotomie peut être admissible. Cependant, si le cerveau ne semble pas « propre » avec les vaisseaux sanguins en bon état rouge vif et blanc cortex, l'expérience peut être résiliées. Des exemples de préparations pauvres comprennent ceux qui ont des vaisseaux sanguins morts, ou lorsque le cortex est marqué par les vaisseaux sanguins déchirés ou endommagés. Si l'un de ces signes sont présents, l'expérience sera donné peu probable des données de qualité. Que ce soit la chirurgie / expérience a réussi ou non, sans cruauté euthanasier la souris à la fin de l'expérience.

  1. Profondément anesthésier avec au moins 3,5% d'isoflurane. Ensuite, faire une injection intraperitoneale de pentobarbital de sodium à 300 mg / kg. Idéalement, si l'aiguille est insérée dans le foie, la mort sera très rapide (<1 min).
  2. Si la perfusion est nécessaire, vérifiez que l'animal est profondément anesthésié avant de poursuivre (voir étape 1.3).
  3. Par ailleurs, si la perfusion n'est pas nécessaire, attendre un minimum de 5 min, puis vérifiez que la souris est morte. Confirmer l'absence de respiration, rythme cardiaque, ainsi qu'un manque de retrait de la douleur et des réflexes de la cornée. En outre, d'observer pour la coloration bleu / blanc pâle des extrémités et assombrissement des vaisseaux sanguins sur le cortex.

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Résultats

Pour étudier les interactions entre les zones corticales dans un seul hémisphère, nous avons utilisé un grand craniotomie étendant à travers le sinus sagittal et 5 - 6 mm latéral. Cette fenêtre crânienne inclus primaire (moteur, somatosensoriel, visuel, auditif), secondaire (moteur, visuel), et d' association (rétrosplénial, cingulaire, association pariétal) de cortex hémisphère droit du cerveau (Figure 3A). Pour ce travail , nous avons utilisé l&#...

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Discussion

Ce protocole innovant pour une grande fenêtre crânienne permet une imagerie simultanée sur les zones temporelles et pariétales du cortex cérébral. Combiné avec l'imagerie optique, il peut aider à révéler la dynamique neuronale dans les zones corticales au cours de l'activité spontanée et induite par stimulus. Cette craniotomie expansive expose également une grande extension du réseau vasculaire cortical, dont l'extrémité proximale de l'artère cérébrale moyenne (MCA), ce qui permet l'imagerie in v...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par un Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) subvention à la découverte # 40352, Campus Alberta président du Programme d'innovation, Alberta Alzheimer Programme de recherche à MHM et FONCER en bourse de doctorat BIF et bourses d'études supérieures AIHS à MK. Nous remercions Pu Min Wang pour le développement de ce protocole et pour la formation chirurgicale et Behroo Mirza Agha et Di Shao pour l'élevage.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Coussin chauffantFHC40-90-2
Ciseaux finsOutils scientifiques fins14058-09
Pinces  ;Outils de science fine11251-352 paires ou plus sont recommandées
Ciseaux à ressortde science fine15000-00, 15000-101 paire doit être désignée pour l’élimination de la dure.
Poudre de teinte de dents de jetLANG DentalJet Tooth Shade Poudre àmélanger avec le Jet Liquid
Teinte de dents de jet liquideLANG DentalJet Tooth Shade Liquidà mélanger avec la poudre de jet  ;
Têtes de forage - Fraises en carbure FG 1/4 389Midwest Dental385201
Poudre d’agaroseSigma-AldrichA9793
GelfoamSinclair Dental CanadaPfizer Gelfoam
IsofluraneWestern Drug Distribution Centre Ltd124125
Lidocaïne 2 % ÉpinéphrineWestern Drug Distribution Centre Ltd125299
Dexaméthazone 5 mg/mLWestern Drug Distribution Centre Ltd125231
Colle cyanoacrylate de butyle (VetBond)Western Drug Distribution Centre Ltd12612
Outils

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Imagerie de l h misph re corticalchirurgie du cerveau de sourisanalyse de la dynamique neuralecombinaison de stimulation optog n tiqueint gration d enregistrements lectrophysiologiquesexposition de la vasculature corticaletechnique de retrait de la dure m remontage de lamelles couvre objet l agarose
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