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REMARQUE: Homme souris C57BL / 6 (ancienne 5-7 semaines) sont de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Québec, Canada.) Et manipulés selon des protocoles approuvés par la Sainte-Justine Comité de protection des animaux CHU. Souris explants de tissus bronchiques constituent une bonne source de cellules épithéliales bronchiques primaires pour étudier les effets pro-apoptotiques de PMT sur les cellules épithéliales. Ce protocole décrit la génération in vitro de PMT, ainsi qu'un procédé de détection de l'apoptose des cellules épithéliales sur des explants de tissus bronchiques PMT-traités. Ce protocole se compose de trois sections.
1. PMT production et la caractérisation
NOTE: Pour éviter la contamination, veiller à ce que tous les matériaux utilisés dans cette expérience sont stériles ou autoclavés. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante dans une enceinte de sécurité biologique dans des conditions stériles, sauf indication contraire.
1.1) Stimulation et Collection des députés9
- Décongeler une aliquote de 10 millions de cellules T CEM C dans un bain d'eau à 37 °. Diluer à 10 ml préchauffé milieu hématopoïétique tels que X-VIVO, dans un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 200 gx 5 min sans sérum. Aspirer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu préchauffé.
- des cellules de transfert dans un ballon de culture de tissu T75 (pour les cellules en suspension) à 15 ml de milieu hématopoïétique préchauffé tel que X-VIVO et incuber pendant 4 jours dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Après 4 jours, transférer la totalité du milieu de culture et les cellules dans un flacon de culture de tissu T175 contenant 100 ml de milieu frais. Continuer l'incubation des cellules pendant environ 72 heures dans les mêmes conditions jusqu'à ce qu'ils aient atteint une densité de 2 millions de cellules / ml.
- Cellules également réparti entre quatre flacons T175 contenant chacune 150 ml de milieu frais et continuer la culture de cellule jusqu'à ce que les cellules se sont développées (environ 48 heures d'incubation) à une densité de 2 millions / ml.
- 6 cellules dans un nouveau flacon T175 contenant 150 ml de milieu frais pour maintenir la densité de cellules de 2 millions / ml.
- Ajouter actinomycine D (dissous dans du DMSO à 2 mg / ml) dans le milieu à une concentration finale de 0,5 ug / ml et incuber pendant 24 heures.
- Transférer tout le milieu de culture dans 50 ml tubes coniques et centrifuger les cellules à 750 g pendant 5 min. Transférer le surnageant dans des tubes de 50 ml et centrifuger coniques à 1500 xg pendant 15 min pour éliminer les gros fragments de cellules.
- Transférer le surnageant dans un flacon de 250 ml et par ultracentrifugation à 12 000 xg pendant 50 min. Jeter le surnageant et recueillir des pellets.
- Pastilles de lavage PMT-PBS enrichi avec 40 ml stérile dans un tube de 50 ml par centrifugation à 12 000 xg pendant 50 min. Répéter deux fois cette étape.
- Recueillir le dernier lavage surnageant; il sera utilisé en tant que contrôle du véhicule. Suspendre les pastilles dans une PMTml de PBS et de les transférer dans un microtube de 1,5 ml stérile. Aliquotes et stocker PMT isolés à -80 ° C (pour éviter de multiples cycles de libre-dégel).
1.2) Caractérisation des députés via Analyse FACS 4
- Préparer deux échantillons de tampon annexine, une avec et l'autre sans CaCl2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus ou moins 5 mM de CaCl2.
- Filtrer tampon de FACS et l'annexine fluide de gaine d'écoulement en utilisant un filtre de 0,22 um pour éliminer les particules.
- Diluer 1 ul de LMP dans 44 ul de tampon d'annexine avec 5 mM de CaCl2 dans un tube FACS. Préparer un autre tube avec 1 pl de PMT dans 44 pi de tampon annexine sans CaCl 2 (contrôle négatif).
- Ajouter 5 ul de AnnexinV-Cy5 dans chaque tube et bien mélanger. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Arrêter la réaction en diluant le mélange avec 400 ul de liquide de gainage FACS d'écoulement dans chaque tube.
- Ajouter 10 pi (200 000 perles) de 7 um comptage beasuspension ds comme étalon interne dans chaque tube pour obtenir une numération absolue.
- Établir portes de taille relative (FSC-H, PMT E00, échelle logarithmique) et la granularité relative (SSC-H, PMT 325, échelle logarithmique) intrigue point sur le cytomètre en flux en utilisant des billes fluorescentes taille calibrée de 1 pm (porte 1) et compter perles porte à 7 pm (porte 2).
- Analyser l'échantillon PMT sur FSC-H / SSC-H parcelle en utilisant les portes établies et FL-4 canaux pour annexine (PMT 765, échelle logarithmique) en points, en acquérant un signal jusqu'à 20 000 billes de comptage sont atteints dans la porte 2.
- Déterminer les événements AnnexinV positifs de PMT dans un tampon annexine contenant CaCl2, puis soustraire les événements de PMT dans un tampon de annexine sans CaCl 2 (contrôle négatif).
- Calculer le nombre absolu de députés sur la base de l'équation suivante:
1.3) Détermination de MP Protein Concentration (Bradford Assay)
- 5 Préparer des dilutions en série d'un niveau de 1,25 à 20 ug / ml de protéine. Introduire à la pipette 800 ul de chaque solution étalon et de l'échantillon dans un tube à essai propre en double. Ajouter 200 ul de réactif de colorant de Bradford à chaque tube. Mélangez bien, puis incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Mesurer l'absorbance à 595 nm. Déterminer la concentration en protéine en utilisant le PMT de régression linéaire de la courbe standard.
2. explants de tissus bronchiques et traitement PMT
REMARQUE: Portez une attention particulière à l'environnement de travail stérile et aseptique préparer les solutions et moyen utilisés dans les expériences suivantes. Pour préparer la complète guérison moyen, ajouter 1 ml de guérison des tissus moyennes suppléments avec du sérum (décongelés sur de la glace) à 100 ml Tissue de guérison moyen et bien mélanger.
2.1) Préparation des explants de tissus bronchiques
- Avant culture, rayer six zones de 1 cm 2chacune sur le bord de la surface de chaque boîte de culture tissulaire de 100 mm avec une lame de scalpel. Enrober chaque rayé 100 tissu mm boîte de culture avec 2 ml de la solution de revêtement de boîte de culture, et incuber le plat dans un incubateur à CO2 humidifié O / N à 37 ° C. Vide aspirer la solution excédentaire et remplir la cuve avec 15 ml de laver des tissus moyen.
- Euthanasier souris C57BL / 6 (5 à 7 semaines) par inhalation de CO 2 selon des protocoles approuvés par le comité d'éthique de soins aux animaux.
- Aseptique disséquer le tissu pulmonaire avec scalpel, Dumont super fine pince à épiler et des ciseaux chirurgicaux. Retirez délicatement parenchyme et les vaisseaux sanguins. Placez le tissu pulmonaire dans glacée tissus laver moyen pour le transport au laboratoire, le cas échéant.
- Disséquer outre bronche immergé dans le lavage des tissus à moyen et séparer les bronches d'un diamètre de 1 à 2,5 mm à partir de tissus pulmonaires périphériques. Trancher les tissus bronchiques dans ~ 5 mm d'épaisseur anneaux bronchiques avec un scalpel.
Utilisez un mouvement d'écopage avec la pince de microdissecting courbes stériles pour ramasser les fragments bronchiques et placez-les sur les zones rayées de la vaisselle. - Retirez le laver de tissus moyen, et incuber les fragments à température ambiante pendant ~ 5 min pour leur permettre de respecter les plats.
- Ajouter 10 ml de complète guérison moyenne à chaque plat et les placer dans une chambre de l'incubateur modulaire atmosphère contrôlée. Rincer la chambre de mélange de gaz O 2 élevé (70% de O 2, 25% de N 2 et 5% CO 2). Placez la chambre dans un incubateur orbital de paillasse et le secouer à 37 ° C. Secouez la chambre pendant 24 heures à 10 cycles par minute pour permettre le support de circuler de façon intermittente au cours des fragments.
- Après 24 heures d'incubation, observer les explants de tissus sous un microscope optique à contraste de phase inversée. Sélectionnez explants bronchiques avec complète, le mouvement de poils fins et de l'épithélium bronchique animée pour le traitement PMT ultérieure.
2.2) Traitement PMT
- Préparer un milieu de croissance complet comme suit: moyennes suppléments de croissance de dégel avec un inhibiteur de sérum de fibroblastes et sur la glace. Ajouter 1 ml de milieu de culture avec des suppléments de sérum et 200 ul d'inhibiteur de fibroblastes à 100 ml de milieu de croissance; bien mélanger. Chauffer le milieu de croissance complet à 37 ° C pendant 10 min avant utilisation.
- Diluer PMT isolés dans un nouveau tube Eppendorf stérile avec PBS pour préparer un stock PMT à une concentration de 800 pg / ml.
- Ajouter 0,5 ml de la croissance complète moyenne à chaque puits d'une plaque de culture de tissu à 12 puits.
- Transférez les explants bronchiques sélectionnés avec la pince de microdissecting courbes du protocole précédent (section 2.1) à chaque puits de la plaque de culture de tissu.
- Étiqueter la plaque de culture appropriée pour identifier PMT puits de traitement et des puits de contrôle. Ajouter 25 ul PMT bouillon dans chaque traitement PMT bien (pour une concentration finale de 40 pg / ml) et 25 véhicules de contrôle de pi (voir LMP s production) dans les puits de contrôle.
- Poursuivre l'incubation dans une chambre de l'incubateur modulaire à atmosphère contrôlée à 37 ° C sous agitation douce.
- Après 24 h, laver explants 3 fois avec du PBS et procéder à la (fixation du paraformaldéhyde 4% [PFA]) prochaine étape.
3. examen histopathologique
3.1) Préparer les solutions suivantes avant de procéder aux prochaines étapes
- Préparer du tampon PBS 1x en mélangeant 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,76 mM de KH 2 PO 4 à pH 7,4.
- Pour préparer PFA 4%, dissoudre 20 g de PFA dans 400 ml d'eau, chauffé à 60 ° C sous agitation; ajouter quelques gouttes de NaOH 10 M pour effacer la solution. Ensuite, ajoutez tampon PBS 1x et ajuster le volume à 500 ml et le pH à 7,4. Filtre et aliquote; stocker à -20 ° C.
- Préparer les réactifs de déshydratation ou après réhydratation; 100%, 90%, 70%, 50% d'éthanol et le xylene.
e_step "> 3.2) explantation fixation et de tissus Section Déparaffinage
- Placer chaque explant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml étiqueté avec 4% de PFA et incuber O / N à 4 ° C. Rincer les explants deux fois avec PBS 1x.
- Déshydrater explants à travers une série d'alcool (70% d'éthanol: 3 fois 30 minutes chacun; 90% d'éthanol: 2 fois 30 minutes chacun; 100% d'éthanol: 3 fois 30 minutes chacun, puis xylène: 3 fois 20 min chacun). Effectuez toutes les étapes à la température ambiante dans une hotte.
- Incruster des explants de tissu dans de la paraffine à 58 ° C dans un four. Préparer 5 um coupes de tissus épais en utilisant un microtome rotatif.
- Flotter les sections C dans un bain d'eau de 56 °, puis monter les sections sur des lames histologiques marqués. Placer les lames dans le manuel racks de coloration et sèche à 65 ° C pendant 1 heure. Laisser les lames refroidir à température ambiante.
- Tremper les racks à quatre plats de taches consécutifs contenant xylène pendant 10 min chacun pour enlever la paraffine. Tremper les racks d'une série de l'éthanol pour éliminer le xylène: 100%, puis 95%, efr 80%, puis 70%, puis 50% d'éthanol (5 min à chaque étape). Rincer les supports avec de l'eau du robinet pendant 5 min pour éliminer l'éthanol.
3.3) hématoxyline et de l'éosine (H & E) Coloration
- Continuer à travailler avec les sections de tissus fixés; placez la grille dans un plat à coloration à l'hématoxyline de Mayer pendant 15 min. Rincez la grille avec de l'eau du robinet pour enlever hématoxyline pendant 20 min.
- Placez-les dans de l'eau distillée pendant 30 sec.Place éthanol à 95% pendant 30 sec. Placer dans éosine Y plat solution de coloration pendant 1 min. Déshydrater par deux changements de 95% d'éthanol, éthanol à 100%, et le xylène pendant 2 minutes chacun.
- Effectuez une vérification rapide sous un microscope pour se assurer que l'excès de l'éosine est retiré. Placez 2 à 3 gouttes de milieu de montage (Fisher SP15-100) sur chaque diapositive, puis couvrir avec un couvercle en verre.
3.4) In Situ mort cellulaire détection: TUNEL Assay
- Avant de commencer, préparer une solution de travail de la proteinase K: 20 pg / ml dans10 mM de Tris / HCl, pH 7,4.
- Répétez les étapes 1 à 5 de l'article 3.2 (fixation explantation et de tissus section déparaffinisation). Rincer les lames avec déminéralisée H 2 O.
- Plonger les lames avec 1x PBS pendant 10 min. Égoutter l'excès de PBS. Incuber les coupes de tissus pendant 30 minutes à température ambiante avec une solution de proteinase K de travail. Rincer les lames deux fois avec PBS 1x.
- Effectuer l'essai TUNEL comme décrit dans le manuel d'utilisation du kit de détection de la mort cellulaire. Monter en utilisant un milieu de montage, et lamelle manuellement avec des lamelles de verre.
- Analyser les échantillons sous un microscope optique. Utilisez Image Pro 4.5 pour analyser les cellules apoptotiques en couleur brune.