Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Résumé

L’analyse des propriétés physiologiques des neurones sensoriels olfactifs se heurte encore à des limites techniques. Ici, nous les enregistrons à l’aide d’un patch-clamp perforé dans une préparation intacte de l’épithélium olfactif chez des souris ciblées par des gènes. Cette technique permet de caractériser les propriétés membranaires et les réponses à des ligands spécifiques de neurones exprimant des récepteurs olfactifs définis.

Résumé

Analysant les réactions physiologiques des neurones sensoriels olfactifs (OSN) lorsqu'elles sont stimulées par des ligands spécifiques est essentiel de comprendre la base de comportements olfactifs moteur et leur modulation. Ces propriétés de codage dépendent fortement de l'interaction initiale entre les molécules d'odeur et le récepteur olfactif (OU) exprimées dans les ARS. L'identité, la spécificité et le ligand spectre du exprimés ou sont critiques. La probabilité de trouver le ligand de l'OU exprimé dans un OSN choisi au hasard dans l'épithélium est très faible. Pour relever ce défi, ce protocole utilise des souris génétiquement marquées exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur des RUP définies. ARS sont situés dans un épithélium serré et organisé garniture de la cavité nasale, avec les cellules voisines influencer leur maturation et la fonction. Nous décrivons ici une méthode pour isoler un épithélium olfactif intact et enregistrer par patch-clamp enregistrements les propriétés des ARS expressing récepteurs olfactifs définies. Le protocole permet de caractériser les propriétés de la membrane OSN tout en maintenant l'influence du tissu voisin. Analyse des résultats de patch-clamp donne une quantification précise de ligand / ou des interactions, des voies de transduction et de la pharmacologie, les propriétés de codage de ARS et leur modulation au niveau de la membrane.

Introduction

Les neurones sensoriels olfactifs (OSN) représentent la première étape de la perception olfactive. Situé dans l'épithélium olfactif tapissant la cavité nasale chez les rongeurs, ils transforment les informations chimique de substances odorantes dans des potentiels d'action envoyés par leurs axones dans le cerveau. Pour mieux comprendre les mécanismes de codage olfactif, il est nécessaire de caractériser les propriétés de transduction et membranaires de ARS. Jusqu'à récemment, la plupart des techniques utilisées pour caractériser les propriétés des ARS de mammifères ont été effectuées sur dissocié ARS ^4.1. Le processus de dissociation utilise di....

Protocole

Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université de Bourgogne et a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université de Bourgogne.

1. Les animaux

1. Utilisez la souris OU-IRES-tauGFP génétiquement disponibles au Laboratoire Jackson. Ces souris ont été développés dans le laboratoire du Dr Peter Mombaerts afin d'analyser le ciblage et le développement des axones du système olfactif ^19. Par exemple, la ligne MOR23-IRES-tauGFP, numéro de stock 006643, porte le nom officiel de la souche B6; 129P2- Olfr16 ^tm2Mom / MomJ; de même, la ligne SR1-IRES-tauGFP, stock n....

Résultats

Le résultat de ce protocole dépend de la qualité de la dissection. Cette dissection étapes doivent être courts (moins de 10 à 15 min) et précis (par exemple, pour éviter les dommages de l'épithélium). La figure 1 illustre comment une préparation idéale ressemble à différents niveaux de grossissement. A un faible grossissement sous champ lumineux les différents types de cellules (comme les poignées de ARS, des cellules de soutien) se distinguent (figure 1A). Au niveau de gro.......

Discussion

La capacité de ce protocole pour surveiller correctement les propriétés des ARS en bonne santé dépend fortement de la qualité de la préparation. Par conséquent, les étapes de dissection sont critiques. D'abord, il est essentiel de prêter attention à la qualité (pH, osmolarité), l'oxygénation et la température (glace-froid mais non congelé) du milieu de dissection. Deuxièmement, la manipulation de l'épithélium avec des outils de dissection doit être aussi limité que possible pour éviter des dommages. Enfin, i.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
table vibrante avec cage de Faraday	TMC	63-500 SÉRIE	REQUISE : isole le système d’enregistrement des vibrations induites par l’environnement (mouvements de l’expérimentateur, vibrations des équipements tels que les ventilateurs pour refroidir les ordinateurs, etc.) ; peut également être achetée avec une cage de Faraday, ou équipée d’une cage de Faraday sur mesure ; cette cage est recommandée pour éviter le bruit électrique de l’optique de
l’environnementmicroscope	Olympus	BX51WI	microcope verticale équipée d’une épifluorescence ; platine fixe ou mobile selon les objectifs préférés de l’utilisateur
	Olympus	LUMPLFL40XW	au moins 2 objectifs requis : un 4X ou 10X pour une approche grossière de la cellule ; et un 40X immersion longue distance exemple Olympus LUMPLFL40XW / IR / 0,8 / WD : Loupe 3,3 MM
	Olympus	U-TVCAC	ABSOLUMENT NÉCESSAIRE : placé dans le trajet lumineux entre l’objectif et la caméra ; permet d’agrandir l’image à l’écran afin d’atteindre précisément le bouton avec la caméra à électrodes d’enregistrement
	Olympus	DP72	une bonne caméra est nécessaire pour voir les neurones en fluorescence ainsi qu’en fond clair ; le logiciel de contrôle est simple et permet de prendre des photos et de faire des images en direct de la caméra pour surveiller l’approche de l’électrode vers la cellule. Une caméra ultrasensible n’est pas nécessaire
filtre	Olympus/Chroma		en fonction de la protéine fluorescente utilisée chez les souris ; exemple pour GFP : excitation : BP460-490 : émission : HQ530/50m
amplificateur	HEKA	EPC10 USB	surveille les courants circulant dans l’électrode d’enregistrement et contrôle également le soufflage en envoyant un signal TTL au spritzer ; la configuration EPC10 est contrôlée par un
logiciel	informatiqueHEKA	Patchmaster	contrôle l’amplificateur pendant l’expérience
micromanipulateur	Sutter	MP225	micromanipulateur de précision, permet des mouvements précis jusqu’au 1/10ème de micromètre ; ce modèle est très stable ; évitez les manipulateurs hydrauliques qui peuvent faire dériver l’extracteur
d’électrode	Sutter	P97	avec un filament d’auge FT345-B large ;   ; pour préparer l’enregistrement des pipettes d’environ 2µ ; m de diamètre avec une longue pointe pour atteindre les cellules ; la résistance doit être de 15 à 20Mohm avec un patch clamp perforé
en verre	de solution Sutter	BF120-69-10	dans nos conditions d’enregistrement, ce verre est idéal pour l’enregistrement des pipettes
chambre d’enregistrement	Warner	Instruments RC-26G	une chambre est nécessaire pour régler la préparation au microscope. Pour maintenir la préparation au centre de la chambre, un filet/ancre doit être utilisé.
verre de stimulation
	WPI	TW100F-4	attachés par groupes de 7, ces pipettes sont utilisées pour préparer des pipettes de stimulation pré-tirées
extracteur multi-barils	MDI	PMP-107-Z	par association de traction et de torsion, cet extracteur nous permet de préparer des électrodes de soufflage avec un
;	Toohey Company	Réf. T25-1-900 Monocanal  ;   ;   ;	cet injecteur de pression de précision contrôle la pression éjectée dans l’extracteur multi-barils ; il est contrôlé manuellement ou par l’amplificateur par un 5V  ;
Micromanipulateur	Narishige	YOU-1	un manipulateur grossier suffit pour rapprocher l’électrode de soufflage des tubes du site d’enregistrement
N	/A		tube tygon pour amener la pression de l’inhalateur à la pipette de soufflage
solutions/perfusion/produits chimiques
pompe à vide	gardner denver	300 series	une pompe à membrane vibrante est plus silencieuse et efficace que les autres types de pompes système de
perfusion	N/A	N/A Système	perfusion par gravité avec tube en polyéthylène pour faire entrer et sortir la solution externe de la chambre d’enregistrement
nystatine	Sigma-Aldrich	N3503	obligatoire pour perpare solution interne pour patch clamp perforé
DIMETHYL SULFOXIDE	Sigma-Aldrich	D5879	Utilisé pour dissoudre la nystatine pour la solution interne pour le patch perforé  ;
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich	S9625	solution extracellulaire
Chlorure	de potassium Sigma-Aldrich	P4504	solution intracellulaire/extracellulaire
Chlorure de calcium dihydraté Sigma-Aldrich		C7902	solution extracellulaire
Phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	solution extracellulaire
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4 7H2O)	Sigma-Aldrich	63140	solution extracellulaire
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	solution extracellulaire
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S6297	solution
extracellulaireEGTA (Ethylène glycol-bis(2-aminoéthylether)-N,N,N&prime ;,N&prime ;,-acide tétraacétique)	Sigma-Aldrich	E3889	solution interne
Hydroxyde de potassium	Sigma-Aldrich	P1767	solution interne
Méthyl Sulfoxyde	Sigma-Aldrich	W387509	solution intracellulaire
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	solution intracellulaire
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389	solution intracellulaire

injecteur de pression de précision à 7 barils TTLs de