Injection stéréotaxique de lentivirus exprimant les ADNc ou shRNA peuvent moduler l'expression génique dans des zones spécifiques du cerveau de souris. Ici, nous présentons un protocole de combiner injections stéréotaxiques avec des tâches comportementales, comme le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST).
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Article de méthode
Application Technique d'injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux
Dans cet article
Résumé
Résumé
Injection stéréotaxique est une technique utile pour fournir des lentivirus de titre élevé dans les zones ciblées du cerveau chez la souris. Les lentivirus peuvent soit surexpression ou l'expression des gènes knockdown dans une région relativement concentré, sans dommages importants aux tissus du cerveau. Après la récupération, la souris injectée peut être testée sur différentes tâches comportementales telles que le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST). L'OFT est conçu pour évaluer la locomotion et le phénotype anxieux chez la souris par la mesure de la quantité de temps que d'une souris passe au centre d'un roman plein champ. Une souris plus anxieux va passer beaucoup moins de temps dans le centre du champ roman par rapport aux témoins. La FST évalue le phénotype anti-dépressif en quantifiant la quantité de temps que les souris passent immobile lorsqu'il est placé dans un seau d'eau. Une souris avec un phénotype anti-dépressive va passer beaucoup moins de temps immobile par rapport aux animaux témoins. L'objectif de ce protocole est d'utiliser le stereotactic injection d'un lentivirus en conjonction avec des tests comportementaux pour évaluer comment les facteurs génétiques moduler les comportements animaux.
Introduction
La souris a été largement utilisé en neurobiologie, car il est facile à manipuler génétiquement. Techniques Gene knock-out permettent aux chercheurs d'étudier comment chaque facteur génétique façonne les comportements de souris. En outre, le système cre-loxP fournit un outil précieux pour tissulaire et la cellule type- KO de gène spécifique chez la souris, ce qui permet aux chercheurs d'étudier la fonction des gènes dans différents tissus. 1 Toutefois, dans la pratique, les profils d'expression des promoteurs de la CRE sont difficiles à contrôler , et si loin de nombreux chauffeurs de cre établies ont pas atteint l'expression spécifique à l....
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Protocole
REMARQUE: Tous les protocoles impliquant des animaux ont été respectées en accord avec les lignes directrices de soins aux animaux de la Pennsylvania State University, IACUC # 44057
1. lentivirus production
NOTE: Le jour avant la transfection, LentiX-293 devrait être à 80% de confluence.
- Rincer les cellules avec du DMEM juste avant la transfection et incuber dans 10 ml de DMEM / 10% de FBS avec de la pénicilline (100 UI / ml) et streptomycine (100 ug / ml) pendant 5 min à température ambiante.
- Diluer l'ADN et de polyéthylèneimine (PEI) (1 mg / ml) dans 1: 3 (1 ug d'ADN: 3 ul de PEI....
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Résultats
Injection stéréotaxique précise repose largement sur la définition des coordonnées correctes. La pointe de l'aiguille utilisée pour injecter le virus devrait être fixé directement sur l'intersection de bregma et la ligne interauriculaire (Figure 1). Il est utile d'utiliser une loupe binoculaire pour déterminer si oui ou non l'aiguille est correctement placé. Lorsque l'on regarde au microscope, l'aiguille doit être positionnée de sorte que si le virus a été injecté, il se .......
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Discussion
Injections stéréotaxiques succès reposent sur trois facteurs: en gardant la souris vivante, le réglage du point zéro correct pour coordonnées (pointe de l'aiguille sur l'intersection de bregma et la ligne interauriculaire), et le réglage de la bonne profondeur au point zéro (pointe de l'aiguille juste toucher l'extérieur du tissu cérébral). La viabilité des souris est important. la survie de la chirurgie peut être facilitée en faisant en sorte que la souris est correctement anesthésié et reçoit analgésiq.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est soutenu en partie par la bourse de développement scientifique de l’American Heart Association et le prix NARSAD Young Investigator Award à Yingwei Mao.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Appareil stéréotaxique article 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Pompe stéréotaxique par excellence ; | Stoelting co. | 53311 | |
| Styringue d’injection, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Î.-P.-É.-B. ; | Polysciences inc. | 23966 | |
| Ciseaux | Outils chirurgicaux fins | 14084-08 | |
| Pince à extrémité émoussée | Outils chirurgicaux fins | 11002-12 | |
| Porte-aiguilles ; | Outils chirurgicaux fins | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Boîtier de contrôle de microcouple, pièce à main Tech2000 | avec pédale |
| Stérilisateur de billes de verre | Inotech ; | IS-400 | |
| Sutures résorbables ; | Unify | M-K518r19 | Résorbable, coupe inversée |
| Cotons-tiges | VWR | 89031-270 | |
| Coussin chauffant | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Larmes artificielles | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Seringue jetable | BD Seringue 309623 | ||
| Gants en tissu | |||
| nbsp ; | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin ou autre anesthésique | voir recette citation | ||
| Kétoprofène ou autre analgésique | voir vétérinaire ; | ||
| Logiciel de suivi | Noldus | Ethovision XT | |
| Caméra de suivi | Noldus | Media Recorder |
Références
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al.
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Réimpressions et autorisations
