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Article de méthode

Sélection de la taille Gel automatisé pour améliorer la qualité des bibliothèques de séquençage de prochaine génération Préparé à partir d'échantillons d'eau de l'environnement

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DOI :

10.3791/52685

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17 avril 2015

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit une approche automatisée de sélection de la taille du gel pour purifier les fragments d’ADN pour le séquençage de nouvelle génération. La technologie Ranger permet une automatisation complète de l’ensemble du processus de chargement de gel d’agarose, d’analyse électrophorétique et de récupération de fragments d’ADN ciblés, ce qui permet d’obtenir des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération à haut débit et de haute qualité.

Résumé

Le séquençage de nouvelle génération des échantillons environnementaux peut s’avérer difficile en raison de la quantité et de la qualité variables de l’ADN dans ces échantillons. Des banques d’ADN de haute qualité sont nécessaires pour obtenir des résultats optimaux du séquençage de nouvelle génération. Les échantillons environnementaux tels que l’eau peuvent avoir une mauvaise qualité et des quantités d’ADN médiocres, ainsi que des contaminants qui coprécipitent avec l’ADN. Les processus mécaniques et enzymatiques impliqués dans l’extraction et la préparation des banques peuvent endommager davantage l’ADN. La sélection de la taille du gel permet la purification et la récupération de fragments d’ADN d’une taille définie pour les applications de séquençage. Néanmoins, cette tâche est l’une des étapes les plus chronophages du flux de travail de préparation des banques d’ADN. Le protocole décrit ici permet l’automatisation complète du chargement de gel d’agarose, de l’analyse électrophorétique et de la récupération de fragments d’ADN ciblés.

Dans cette étude, nous décrivons une approche à haut débit pour préparer des banques d’ADN de haute qualité à partir d’échantillons d’eau douce qui peuvent également être appliqués à d’autres échantillons environnementaux. Nous avons utilisé une approche indirecte pour concentrer des cellules bactériennes à partir d’échantillons environnementaux d’eau douce ; L’ADN a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce, et les banques d’ADN ont été préparées à l’aide d’un protocole commercial basé sur des transposons. Des fragments d’ADN de 500 à 800 pb ont été sélectionnés en taille de gel à l’aide de la technologie Ranger, une station de travail d’électrophorèse automatisée. Le séquençage des banques d’ADN sélectionnées en fonction de la taille a démontré des améliorations significatives de la longueur de lecture et de la qualité des lectures de séquençage.

Introduction

La métagénomique implique le séquençage de tout le matériel génétique d’un échantillon pour caractériser les communautés microbiennes présentes. Il s’agit d’un processus complexe et coûteux qui implique la conversion des acides nucléiques extraits en banques d’ADN, suivie d’un séquençage de nouvelle génération. Des bibliothèques de haute qualité sont essentielles pour une sortie de données maximale et une analyse métagénomique précise. Les échantillons environnementaux, tels que les échantillons d’eau, posent souvent des défis importants pour générer des banques de haute qualité, en raison de faibles quantités d’ADN qui peuvent également être dégradés1-3 et de la présence d’inhibiteurs de la PCR4-6.

Les banques de haute qualité sont idéalement constituées de segments d’ADN plus longs dans une gamme étroite de longueurs. Afin de maximiser la quantité de données utiles générées par séquençage, la longueur de l’ADN dans la banque doit être au moins aussi longue que la longueur maximale de lecture de la méthode de séquençage utilisée. Lors de l’utilisation d’une technologie de séquençage par synthèse telle que l’Illumina MiSeq, la taille des fragments d’ADN affecte l’efficacité avec laquelle les grappes sont générées sur la cellule d’écoulement. Par exemple, lorsqu’une banque contient à la fois des fragments d’ADN plus courts et plus longs, les plus courts seront surreprésentés dans les données de séquençage7,8. En revanche, une banque avec des fragments d’ADN de taille similaire sera représentée proportionnellement dans les données de séquençage. De nombreux kits de préparation de banques utilisent des méthodes basées sur la ligature pour ajouter des adaptateurs aux fragments d’ADN et la sélection de la taille est nécessaire pour supprimer les dimères d’adaptateur qui ne contiennent pas d’insert9,10. Il existe de nombreuses méthodes11,12 pour y parvenir, mais celle qui donne les résultats les plus cohérents est la séparation électrophorétique de l’ADN suivie de la récupération des longueurs d’ADN souhaitées13,14. Ce processus peut être effectué manuellement pour un petit nombre d’échantillons, mais lorsqu’il s’agit de traiter des centaines d’échantillons, des solutions automatisées sont nécessaires. Les plates-formes actuellement disponibles pour la sélection automatisée de la taille des gels sont à faible débit et de nouvelles plates-formes sont nécessaires pour traiter un grand nombre d’échantillons pour le séquençage. La technologie Ranger peut être intégrée aux postes de travail de manipulation de liquides existants pour permettre l’utilisation de l’électrophorèse sur gel d’agarose pour la sélection de la taille et à des fins analytiques à une échelle qui satisfait l’environnement à haut débit d’aujourd’hui.

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Protocole

1. Collecte de l'eau et de filtration

  1. Prélever des échantillons d'eau douce provenant de divers sites (figure 1). Faire passer les échantillons à travers une série de filtres: 1 um filtre, filtre de 0,2 um, et le filtre à écoulement tangentiel 30 kDa de coupure systématiquement eucaryote séparé, des particules virales et bactériennes de taille, respectivement.
    Note: Seule la purification et l'analyse des matériaux récupérés sur les 0,2 um filtres (bactéries vivant en liberté) est décrite dans le présent rapport, mais des approches similaires peut être utilisé pour les autres particules récupérées sur les filtres.

2. Concentration bactérienne, extraction et purification de l'ADN

  1. Retirer le filtre de 0,2 um à membrane (s) à partir du système de filtration de l'eau (schéma, figure 2). Pliez le filtre de 0,2 um de disque en deux et placez-le dans un tube de 50 ml avec le côté ouvert vers le haut. Ajouter 5 ml de solution tamponnée au phosphate (PBS 1x) et 0,01% de Tween, pH 7,4 dansle tube. Si plus d'un filtre est utilisé pendant le processus employer un autre tube par filtre. tube (s) de magasin avec filtre à 4 ° C jusqu'à leur transformation. Sinon, passez à l'étape 2.2.
  2. Retirer le filtre à membrane de 0,2 um à partir du tube de 50 ml avec des pinces stériles. Placer le filtre (s) sur une boîte de Pétri (quitter le tampon PBS dans le tube).
    1. Avec des pinces stériles et ciseaux stériles, couper le filtre en petites lanières (1 cm x 1 cm). Désinfecter pinces et ciseaux par trempage dans 70% d'isopropanol, essuyant avec une surface décontaminant d'ADN et de rinçage avec de l'eau ultra-pure de type 1 entre les différents échantillons.
  3. Placez le filtre coupé en lanières de nouveau dans le même tube de 50 ml. Ajouter 10 ml de 1 x PBS et 0,01% de Tween, pH 7,4 pour le filtre de sorte qu'il ya un total de 15 ml de tampon dans le tube de 50 ml.
  4. Ajouter six perles de tungstène propres (de 3 mm de diamètre) à chaque tube de 50 ml, couvrir le tube avec du Parafilm, et le vortex vigoureusement pendant 20 min (50 ml utiliser tubes vortex adaptateur). Si multIPLE filtres sont traitées d'un échantillon, le transfert et piscine toute l'homogénat dans un tube de 50 ml propre. Centrifuger les tubes à 3300 g pendant 15 min à 4 ° C.
  5. Reprendre le culot et aliquotes cellules bactériennes (~ 1 ml de Aliquots) dans 1,7 ml microtubes. Notez qu'il y aura cinq microtubes par échantillon.
  6. Isoler les microtubes à 10 000 g pendant 10 min, et éliminer la plupart du surnageant jusqu'à ~ 200 pi marque.
  7. Conserver les échantillons à -80 ° C, ou de procéder à l'extraction d'ADN bactérien en utilisant un kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant. Au cours de l'utilisation de bactéries d'extraction d'ADN, soit du PBS ou de l'eau en tant que témoin négatif de l'extraction, et E. coli comme contrôle positif d'extraction.
  8. Parce que l'ADN de plusieurs tubes de l'extraction, en commun sous-parallèles aliquotes du même échantillon dans un tube de 2 ml. Ensuite procéder à une O / N précipitation en utilisant une solution constituée de 0,1volumes d'acétate de sodium 3 M, 2 volumes d'éthanol à 100%, et 5 pl de 5 pg / pl acrylamide linéaire. Bien mélanger et conserver les échantillons à -80 ° C.
  9. Centrifuger à vitesse maximale (17 000 xg) pendant 30 min à 4 ° C. Laver culot avec 1 ml d'éthanol à 70% de glace-froid, l'air sec dans une enceinte de biosécurité pour pas plus de 5 min et remettre en suspension culot d'ADN dans 34 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
    Remarque: acrylamide linéaire permettra de visualiser l'ADN culot après l'O / N précipitations.
  10. Déterminer la quantité et la qualité de l'ADN en utilisant une haute sensibilité de l'essai de quantification de l'acide nucléique fluorescent et un spectrophotomètre microvolume, respectivement, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    Remarque: Si plusieurs échantillons sont préparés à l'époque, un dosage de l'acide nucléique fluorescente ultrasensible pour quantifier l'ADN double brin et fluoromètre / spectrophotomètre à base de plaque peut être utilisé à la place.

3. Préparation de l'ADN Bibliothèque

  1. Normaliser l'ADN bactérien génomique extrait à partir d'échantillons d'eau à une concentration de ~ 0,2 ng / ul.
  2. Fragment enzymatiquement une nanogramme d'ADN bactérien en utilisant un procédé à base de transposons (tagmentation). Ajouter adaptateur et d'index des séquences sur l'ADN fragmenté en suivant les instructions du fabricant. Sous réserve tagmented échantillons à 12 cycles de PCR comme indiqué dans les instructions du fabricant, à quel point les indices de séquençage sont incorporés.

Sélection de la taille 4. Gel automatisé

  1. Sautez l'étape de nettoyage post-PCR standard décrit dans les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Échantillons post-PCR Sélectionnez la taille directement en utilisant une plate-forme de sélection du format à base de gel-automatisé.
    1. Ajouter 3,5 pi de tampon de chargement à chaque échantillon.
    2. En suivant le protocole du fabricant, charger les échantillons sur le poste de travail d'électrophorèse, en spécifiant une cible de 500 à 800 pb taille-sélection, dans un extrait de 300 ulle volume d'ions, en utilisant une cassette agarose préfabriqué 1,5%.
    3. Concentrer le matériau de sortie brute (300 pi) jusqu'à 25 pi par précipitation à l'éthanol.
      Remarque: Vous pouvez également utiliser le poste de travail d'électrophorèse pour automatiser la concentration pour un plus grand nombre d'échantillons par plaque de filtre et le collecteur à vide.
      1. Précipiter le volume d'élution brut en utilisant 0,1 volumes de 3 M d'acétate de sodium, 2 volumes d'éthanol à 100% et 5 pl de 5 pg / pl acrylamide linéaire. Mélangez bien, placer les échantillons à -80 ° CO / N. Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 30 min.
      2. Jeter surnageants et passez à laver culot d'ADN avec 1 ml de glace-froid à 70% d'éthanol.
      3. Centrifuger les échantillons à nouveau à 17 000 xg pendant 30 minutes, éliminer les surnageants, l'air sec, et finalement remises en suspension le culot dans l'ADN 25 ul de 10 mM de Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Facultatif) Utilisez 1 pl de banques d'ADN taille sélectionnée avec la plate-forme de sélection de la taille de gel automatisé pour faire un cinq-fois la dilution avec une solution de tampon Tris-EDTA, pH 8,0. Analyser les bibliothèques aide d'un instrument d'électrophorèse capillaire sur puce pour analyser la qualité ADNdb selon les instructions du fabricant.

5. Bibliothèque Normalisation et séquençage

  1. Passez à normaliser les échantillons en utilisant des billes de normalisation bibliothèque (inclus dans le kit de préparation de la bibliothèque à base de transposons) comme décrit dans le guide de préparation du fabricant.
    1. Sinon, mesurez bibliothèques ADNdb utilisant une lampe fluorescente de sensibilité du dosage de l'acide nucléique de la sensibilité élevée, suivie par la mise en commun à des rapports équimolaires pour atteindre une concentration finale de 2 nM ADN double brin. Passez à dénaturer les bibliothèques utilisant 10 pi de bibliothèques en gestion commune et 10 pi de NaOH 0,2 N, incuber pendant 5 min à température ambiante. Diluer bibliothèques dénaturés en utilisant un tampon d'hybridation (fourni avec le kit de préparation à base de transposons) jusqu'à un volume final de 1 ml et la concentration de 23:05.
  2. échantillon de charges dans une plate-forme de séquençage de nouvelle génération en suivant des protocoles classiques de séquençage du fabricant.

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Résultats

Concentration d'ADN, et de l'évaluation de la qualité

Les concentrations d'ADN bactériens ont varié de 0,01 à 0,11 ng ​​/ ml pour l'échantillon d'eau des différents sites de partage des eaux (tableau 1). ADN isolé de la fraction bactérienne avait un 260/280 et 260/230 A ratios de 01.04 à 01.08 et de 0,3 à 1,6, respectivement. Bien que certains des rapports A 260/230 ont été relativement faible, aucune inhi...

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Discussion

La présence de dimères de l'adaptateur et le regroupement des petites tailles d'insert étant préférentiellement séquencés dans les plateformes actuelles représentent une diminution des rendements et utilisables sous-utilisation de la capacité de l'équipement 15. L'utilisation de méthodes de battage de perles combinées avec une approche à base de transposons pour préparer bibliothèques peut entraîner plus d'ADN cisaillement par rapport à d'autres méthodes d'extraction 4,5.

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Déclarations de divulgation

Jared R. Slobodan et Matthew J. Nesbitt deux détiennent des actions de Coastal Genomics, une société privée Colombie-Britannique offrant la technologie Ranger.

Remerciements

Ce travail a été financé par Genome BC, Genome Canada et Coastal Genomics. Les auteurs remercient Kirby Cronin et Michael Chan pour leur aide dans la collecte et le traitement des échantillons. Nous tenons également à remercier Thea Van Rossum et la Dre Fiona Brinkman pour leur aide en bioinformatique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pompe péristaltique Masterflex P/S 1400 SeriesThermo Scientific  ;1400-1620
0,2 et micro ; m Supor MembraneVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Billes de carbure de tungstène 3 mm (200)Qiagen69997
Alcool isopropylique 70 %Jedmon Products825751Healthcare Plus
DNA awayVWR7010Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
Système de purification d’eau Milli-QFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Ce système a été abandonné.
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher chemicals
Adaptateur Vortex pour 2 (50  ; ml) tubesVWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  ; V (Modèle G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Beckman CentrifugeRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModèle J-6B
PowerLyzer Powersoil Kit d’isolement d’ADNVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
Adaptateur Vortex pour 24 tubes (1,5-2 ml)VWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Centrifugeuse Microfuge 18Beckman Coulter367160
Nimbus Select workstation avec Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Comprend le poste de travail de manipulation des liquides et le Ranger Tech intégré (matériel d’électrophorèse)
Kit de réactifsRanger Coastal GenomicsCG-10600-150-12-21Comprend un tampon de chargement et des cassettes
Alcool éthylique (anhydre)Alcools commerciauxP016EAANÉthanol Greenfield
Acétate de sodiumSigma-AldrichS2889-250G
Acrylamide linéaire (5  ; mg/ml)Life TechnologiesAM9520Ambion
Eppendorf centrifugeuse réfrigéréeRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Tampon EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 SpectrophotomètreThermo ScientificND-1000
Qubit FluorimètreLife TechnologiesQ32857Invitrogen. Ce produit n’est plus fabriqué.
Kit de dosage Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32854Invitrogen
Réactif d’ADN haute sensibilitéAgilent Technologies5067-4626
Puces d’ADN haute sensibilitéAgilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BioanalyseurAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT Kit de préparation d’échantillons d’ADNIlluminaFC-131-1024
Nextera XT kit d’indexIlluminaFC-131-1001
Kit de réactifs MiSeq v2 (500 cycles)IlluminaMS-102-2003
Système MiseqIlluminaSY-410-1003

Références

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