Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Résumé

Dans le protocole suivant, nous décrivons une façon très simple d'isoler les pièges neutrophiles extracellulaires (EVF) de sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. Nous montrons ensuite comment les EVF isolées peuvent être utilisées dans un essai in vitro de l'adhésion avec les cellules cancéreuses.

Résumé

Neutrophiles extracellulaires Pièges (EVF) ont été récemment identifiés comme faisant partie de l'arsenal antimicrobienne de neutrophiles. Outre leur rôle dans la lutte contre les infections, des recherches récentes ont démontré qu'ils peuvent être impliqués dans de nombreux autres processus de la maladie, y compris la progression du cancer. Isoler NET purifiés est un élément crucial pour permettre l'étude de ces fonctions.

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode simplifiée de l'isolement de NET exempt de cellules du sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. NET isolés peuvent ensuite être utilisés pour immunofluorescence, buvard ou de divers tests fonctionnels. Cela permet une évaluation de leurs propriétés biologiques, en l'absence des effets de confusion potentiels de neutrophiles eux-mêmes.

Une technique de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler des neutrophiles à partir de sang entier de donneurs en bonne santé. Les neutrophiles isolés sont ensuite stimulées par du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour induire NETosis. Les neutrophiles activés sont ensuite rejetées, et un stock net sans cellules sont obtenues.

Nous montrons ensuite comment TNE isolé peut être utilisé dans un essai d'adhérence avec des cellules de cancer du poumon humain A549. Le stock net est utilisé pour recouvrir les puits d'une 96 puits culture cellulaire plaque O N, et après s'être assuré une formation de monocouche NET adéquate sur le fond des puits, CFSE étiquetés cellules / A549 sont ajoutés. Les cellules adhérentes sont quantifiés à l'aide d'un microscope à fluorescence Nikon TE300. Dans certains puits, 1000U DNAse1 est ajouté 10 min avant de compter à dégrader NET

Introduction

Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont nouvellement découvert des éléments de neutrophiles dérivés composées de brins d'ADN extracellulaire décorées par des centaines de protéines et les histones. Elles sont sécrétées par les neutrophiles dans le contexte de l'infection et l'inflammation suivants stimuli spécifiques et ils ont été comptabilisés initialement faire partie des mécanismes de défense de l'neutrophiles contre les infections. Ils ont d'abord été présentés à promouvoir le piégeage de divers envahisseurs microbiens tels que les bactéries, virus et champignons ^1-3. Le piégeage du microbe serait alors conduire à sa destru....

Protocole

NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices éthiques institutionnels locaux.

1. Dessin de sang

1. Grâce venipucture coude, de recueillir 14 tubes de sang à partir d'un volontaire sain en Top Green tubes (héparine) et inverser chaque tube avant de se installer sur la glace. Prélever le sang dans les 10 à 15 min de l'expérience pour assurer un rendement optimal des neutrophiles.

2. Isolement des neutrophiles du sang total

1. Laver chaque tube vert en haut de sang avec 5 ml de PBS sans Ca et Mg à diluer le sang. Dans chacun des 4 x 50 ml tubes c....

Résultats

La réalisation d'un test d'adhésion statique avec des filets nécessite revêtement adéquat des puits avec une monocouche de NET avant l'addition des cellules cancéreuses (Figure 1). Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées avec soin de ne pas perturber cette couche. Lorsque une couche suffisante de NET est formé, on se attend à voir significative cellules cancéreuses adhérence aux filets comme on le voit dans la figure 2A et 2C. Cet effet est suppr.......

Discussion

Le protocole d'isolement de neutrophiles Piège extracellulaire démontré dans cette vidéo combine différentes techniques utilisées dans la littérature pour l'isolement des neutrophiles et formation NET. Il simplifie un processus assez complexe et variable et offre un moyen très fiable et reproductible pour isoler NET sans cellules purifiées avec moins d'étapes que les autres protocoles. En outre, des réactifs facilement disponibles sont employés ajoutent à la simplicité des protocoles et de réduire considérab.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (PBS), modifiée, sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium	Wisent	311-425-CL
Milieu de séparation des lymphocytes (LSM)	Wisent	305-010-CL
Chlorhydrate de dextran (poudre)	Spectre	DE130	La solution de dextran à 6 % est obtenue en complétant le PBS avec du Ca et le Mg avec de la poudre de Dextran à 6 %
RPMI-1640 Milieu avec de la L-glutamine	Wisent	La solution de 350-000-CL	3 % de RPMI est obtenue en complétant le RPMI avec 3 % de sérum de veau fœtal
BD Pharm Lyse Buffer BD	Biosciences	555899
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)	Sigma-Alrdrich	P8139
DNAse1	Roche	11284932001
F12 DMEM	Wisent	319-075-CL
Sérum de veau fœtal (FBS)	Wisent	080-150
Pénicilline/Streptomycine	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco	25200-056
Boîte de culture tissulaire Integrid avec grille de 20 mm (150 x 25 mm)	Falcon	353025

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