Les cellules souches mésenchymateuses sont généralement obtenues à partir de la moelle osseuse et nécessitent une culture d’expansion. Lorsque les échantillons coagulent avant d’être traités, un protocole utilisant le médicament thrombolytique (enzymatique) urokinase peut être appliqué pour dégrader le caillot. Ainsi, les cellules sont libérées et disponibles pour la culture d’expansion. Ce protocole offre une alternative rapide et peu coûteuse au rééchantillonnage.
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Article de méthode
Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir d'échantillons coagulés moelle osseuse
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) - généralement obtenues à partir de moelle osseuse - nécessitent souvent une culture d’expansion. Notre protocole utilise l’urokinase de grade clinique pour dégrader les caillots dans la moelle osseuse et libérer les CSM pour une utilisation ultérieure. Ce protocole offre une alternative rapide et peu coûteuse au rééchantillonnage de la moelle osseuse. La moelle osseuse est une source majeure de CSM, qui sont intéressantes pour l’ingénierie tissulaire et les thérapies à base de cellules souches autologues. Lors du retrait, la moelle osseuse peut coaguler, car elle comprend tout le système hématopoïétique. Les caillots qui en résultent contiennent également des CSM qui sont perdues pour la culture d’expansion ou la thérapie directe par cellules souches. Nous avons constaté que 74 % des échantillons de moelle osseuse canine contenaient des caillots et produisaient moins de la moitié du nombre de cellules souches attendues des échantillons non coagulés. Ainsi, nous avons développé un protocole de digestion enzymatique de ces caillots afin d’éviter un rééchantillonnage de la moelle osseuse coûteux et intensif en main-d’œuvre. L’urokinase - un médicament thrombolytique cliniquement approuvé et facilement disponible - élimine presque complètement les caillots de la moelle osseuse. En conséquence, les ponctions de moelle osseuse traitées produisent un nombre similaire de CSM que d’échantillons non coagulés. De plus, après le traitement à l’urokinase, les cellules ont conservé leur activité métabolique et la capacité de se différencier en lignées chondrogéniques, ostéogéniques et adipogènes. Notre protocole récupère les échantillons de sang coagulé et de moelle osseuse sans affecter la qualité des cellules. Ce rééchantillonnage obsolète réduit considérablement les coûts d’échantillonnage et permet l’utilisation d’échantillons coagulés pour la recherche ou la thérapie.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) jouent un rôle majeur dans la médecine régénérative et de l'ingénierie tissulaire. Ils peuvent migrer, se différencier en différents types de cellules et une greffer, ce qui les rend idéales pour les candidats thérapies autologues 2,3. Dernièrement, des essais cliniques utilisant MSC pour les os et la réparation du cartilage, maladie du greffon contre l'hôte ou une maladie cardiaque ont été lancés 4. Ces cellules souches mésenchymateuses peuvent être récoltées à partir du tissu du cordon ombilical ou adipeux, mais les résultats les plus prometteurs ont été obtenus à partir de la moelle osseuse les cellules souches dérivées 5.
La crête iliaque permet de recueillir une quantité considérable de la moelle osseuse et sert donc de site principal d'aspiration 6. Cependant, la qualité de l'aspiration diminue avec l'augmentation du volume de la moelle osseuse retirée. Alors que les cinq premiers ml de ponction de la moelle osseuse contiennent MSC de haute qualité, le retrait de volumes plus importants conduit à une dilution de l'aspiration avec sang périphérique fepuis l'os très vascularisé 7. En raison de la présente des mégacaryocytes et des plaquettes, des aspirats de moelle osseuse sont sujettes à la coagulation, à moins que les anticoagulants sont utilisés. Mais même avec des anticoagulants, des caillots peuvent se produire.
Dans la moelle osseuse, cellules souches mésenchymateuses ne représentent qu'une faible proportion de la piscine total de cellules 8 et doivent être multipliées en culture pour la plupart ingénierie tissulaire ou quatre applications thérapeutiques. La qualité d'une telle culture dépend largement de la piscine de la cellule initiale, ce est à dire., La diversité et une grande départ numéro 9. De faibles effectifs d'MSC de retraits peuvent se expliquer en partie par la variabilité des bailleurs de fonds. D'autre part, les CSM à partir d'échantillons de faible qualité nécessitent plus de temps dans la culture et repiquage prolongé pour atteindre le nombre souhaité de cellules. Dans les deux cas, des passages est une source étendue de la sénescence cellulaire et peut conduire à la perte de potentiel de 10 différenciation. Par conséquent, les protocoles qui peuvent maximiser cellulaire y optimiséield et prévenir des effets néfastes doivent être développés 11,12.
Lorsque nous avons commencé à travailler avec MSC canines, nous avons été étonnés de voir que les échantillons de moelle osseuse canines environ trois sur quatre contenaient des caillots, tandis que les échantillons humains heureusement coagulé (un sur dix) ont été moins fréquentes. D'autre part, il ne est pas surprenant, que nous avons observé des rendements beaucoup plus faibles de MSC à partir d'échantillons coagulés. Pour résoudre le problème récurrent des échantillons coagulés, nous avons développé le protocole utilisant l'urokinase de drogue thrombolytique lieu de rééchantillonnage.
Thérapies thrombolytiques peuvent contrecarrer les situations de la vie en danger, comme l'occlusion des vaisseaux sanguins provoquant une crise cardiaque, accident vasculaire cérébral ou embolie raison de coagulation non désirée. Ils fonctionnent par la dégradation des caillots par clivage enzymatique par la plasmine de la fibrine et du plasminogène activateurs enzymatiques. Malgré la large utilisation pour le traitement des patients, que très peu de publications existent que les activités thrombolytiques utiliséspour les applications de laboratoire pour sauver échantillons coagulés, en se concentrant principalement sur les lymphocytes. En 1987, Niku et al. décrit l'utilisation de streptokinase pour dissoudre les caillots sanguins dans les lymphocytes fonctionnels résultant 13 et quatre ans plus tard, De Vis et al. étendu l'utilisation de la streptokinase pour isoler les cellules leucémiques dans le sang et la moelle osseuse pour des applications de cytométrie en flux 14. Une publication plus récente suggère l'utilisation de Alteplase pour le diagnostic de cancer 15. Tout en utilisant la même approche enzymatique, notre protocole met l'accent sur l'isolement des cellules souches mésenchymateuses multipotentes forme la moelle osseuse de fournir un outil pour les chercheurs dans le domaine des cellules souches.
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Protocole
REMARQUE: ponctions de moelle osseuse humaines de la crête iliaque ont été recueillies de consentir donateurs avec l'approbation du comité d'éthique du canton de Lucerne. Aspirats de moelle osseuse Canine de la crête iliaque ont été recueillies avec consent.Human de propriétaire de chien (env. 20 ml) et canin (env. 10 ml) aspirats de moelle osseuse étaient anti-coagulé par addition de 15 ml de citrate de sodium à 3,8% immédiatement après le retrait dans la salle d'opération. Les échantillons ont été transférés à l'environnement du laboratoire de traitement du même jour comme retirée.
1. Préparation de Urokinase (Avant le 1 er Utilisations)
- Reconstituer l'urokinase en utilisant une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) selon les instructions du fabricant: Ajouter 10 ml de PBS dans le ballon de septum d'entrée en utilisant une seringue de 10 ml. Dissoudre la substance sèche en agitant pour obtenir 50 000 unités d'injection (U) par ml.
- Préparer des aliquots de 500 ul (25,000) dans chaque U sterile tubes. aliquotes de magasins -20 ° C et l'utiliser en cas de besoin pendant au moins six mois.
2. préparatives étapes (Avant chaque os traitement moelle)
- Décongeler une aliquote de l'urokinase (25.000 U) coagulé par aspiration de moelle osseuse (volumes aspirés jusqu'à 25 ml ont été traités avec succès en utilisant une seule portion aliquote de 25 000 U).
- Préchauffer un bain d'eau ou incubateur agitateur à 37 ° C.
3. digestion enzymatique du Clot
- Effectuer tous les travaux dans un biosécurité de flux laminaire armoire pour éviter la contamination microbienne des échantillons de moelle osseuse au cours du traitement. Lorsque vous travaillez avec des matières potentiellement infectieuses humaine, l'utilisation de gants de protection ainsi que manipulation prudente est conseillée.
- Placer un tamis de 100 um de la cellule au-dessus d'un tube de 50 ml stérile. Versez délicatement la ponction de moelle osseuse à travers le tamis de la cellule, en inclinant la crépine ou déplacer le matériel d'un caillot. Utiliser un embout de pipette stérile pourune meilleure circulation à travers les mailles du filtre.
REMARQUE: éviter toute dilution du caillot, par exemple, en lavant le caillot avec du PBS. Urokinase agit indirectement et nécessite des composants du sérum (ie., Plasminogène) de la biopsie pour condensé efficace. Tout en continuant l'opération avec le matériau de caillot, le filtrat peut être conservé à température ambiante jusqu'à utilisation ultérieure dans l'étape 3.6. - Transférer le matériel de caillots de moelle osseuse dans une boîte de culture de cellule vide aide de pinces stériles. Couper les débris en petits morceaux d'environ 2 mm 3 à l'aide d'un scalpel stérile.
- Transférer les petits morceaux de caillot dans un tube à réaction de 50 ml à l'aide des pinces stériles. Veiller à ce que le caillot hachée a un aspect mouillé. Se il semble être sec, utiliser une partie du filtrat de l'étape 3.1 pour humidifier.
- Triturer le caillot par aspiration et pendant 5 fois en utilisant 5 ml microtitrage pipette. Ajouter une fraction aliquote de l'échantillon d'urokinase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C soit dans un bain d'eau ou dansune agitation (doucement) incubateur.
- Triturer par pipetage de haut en bas pour les cinq fois à l'aide d'une pipette 5 ml. Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique. Incuber pendant 30 minutes à 37 ° C. Après l'incubation, triturer encore 5 fois à l'aide d'une pipette de 5 ml. Passez votre souris sur un nouveau 100 um tamis cellulaire de mettre en commun avec le filtrat de l'étape 3.2.
- Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante pendant 10 min à 500 x g. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu tel que décrit ci-dessous ou selon le mode opératoire standard de votre laboratoire pour la culture d'extension MSC.
4. Le classement pour Expansion Culture cellulaire et UFC Plaques
- Remettre en suspension les cellules (comprenant des érythrocytes et des cellules mononucléées) dans 50 ml de milieu de base: Alpha-MEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 2,5 mg / ml d'amphotéricine B . Compter les cellules 01h10 dilué dans une solution bleu Trypan utilisant une chambe Neubauerr.
- Plaque les cellules dans des flacons de culture de cellules à une densité de 5 x 10 7 cellules / cm 2 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° C. Si possible, utilisez hypoxiques (5% d'oxygène). Pour le contrôle de dosage CFU, plaque 10 9 cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm de diamètre.
- Après 3 jours de culture, les cellules souches mésenchymateuses sont attachés à la boîte de culture de cellules alors que les autres cellules restent en suspension. Changer les médias avec le milieu de base supplémenté avec 5 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF). Pour le contrôle de dosage CFU, traiter la boîte de culture cellulaire de même.
- Continuer culture cellulaire pour un total de deux semaines, l'échange de médias trois fois par semaine. Si les cellules dépassent 80% de confluence, diviser par trypsinisation. Pour le contrôle de dosage CFU, échanger les médias de même, mais ne pas diviser les cellules pour le cours des deux semaines.
5. Giemsa pour le dosage CFU
- Préparer 10 ml de solution par Giemsa-plat: dilute la solution mère (7,6 g / l dans le glycérol Giemsa: méthanol) 1h10 dans l'eau stérile (toujours préparer une dilution de travail frais).
- Retirez le support de la boîte de culture cellulaire et laver les cellules avec du PBS. Soyez très précautionneux lors de l'application liquide à la boîte de Pétri et éviter de laver hors des cellules.
- Fixer les cellules dans du méthanol pur pendant 5 min à température ambiante. Jeter le méthanol. Ajouter la solution Giemsa et incuber pendant 60 min dans un incubateur humidifié à 37 ° C.
- Laver deux fois avec du PBS. Air sécher la tête de la première plaque sur une serviette en papier. Compter les colonies manuellement. Ceci se fait à l'aide d'un marqueur sur le dos de la plaque.
6. MSC Différenciation
- La différenciation des cellules souches mésenchymateuses Canine
REMARQUE: MSC Canine ont été différenciées en chondrogène, ostéogénique et lignées adipogéniques par stimulation avec le support approprié pour quatre semaines. - Pour La différenciation adipocytaire, MSC de culture en monocouche à 4 x 10 5 CELLS / cm 2 en alternance deux conditions de culture différentes de la manière suivante;
- Culture dans un milieu d'entretien contenant de l'adipogenèse DMEM + GlutaMAX, 3% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B et 170 mM d'insuline.
- Culture dans l'adipogenèse médias induire avec du milieu de maintenance additionné de 3% de FBS, sérum de lapin à 5%, 1 uM de dexaméthasone, 500 uM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine, 33 uM de biotine, 5 uM et 17 uM de rosiglitazone 16 pantothenate.
- Revel les gouttelettes lipidiques par coloration avec Oil Red-O. En bref, fixer les cellules avec 10% de formaldéhyde, laver avec du PBS et tacher avec O rouge 0,35% d'huile dans de l'isopropanol.
- Pour la culture de la différenciation ostéogénique MSC en monocouche à 7 x 10 3 cellules / cm 2 et de stimuler dans ce qui suit:
- Avancée DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B, 501; M d'acide L-ascorbique-2-phosphate, 10 mM de ß-glycerophosphate et 100 nM de dexaméthasone.
- Identifier les dépôts de minéralisation de Von Kossa tache (5% AgNO 3). En bref, fixer les cellules avec 10% de formaldéhyde, laver avec du PBS et tache avec 5% AgNO 3 dans l'eau distillée.
- Différenciation chondrogénique
- cubes coupées (3 mm de chaque côté) à partir d'un dispositif médical en forme d'éponge, constituées à partir lyophilisée de collagène de type I, et utilisés comme matériau d'échafaudage pour soutenir 17 cellules.
- MSC de semences sur le dessus des cubes à la concentration de 4 x 10 6 cellules / ml (~ 70 000 cellules / cube).
- Avant l'addition de médias, permettent aux cellules d'adhérer aux cubes pendant 30 min.
- Maintenir constructions MSC-collagène dans des milieux chondrogénique constitué de DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B, 40 ng / dexaméthasone ml, 50 pg / ascorbique ml acide 2-phosphate,50 ug / ml de L-proline, 1x insuline-transferrine-sélénium X, et 10 ng / ml de facteur de croissance transformant-β1.
- Utilisez coloration au bleu alcian pour visualiser l'accumulation des protéoglycanes dans les sections de constructions. Brièvement, tacher les sections O / N avec 0,4% de bleu alcian dissous dans 0,01% de H 2 SO 4 et 0,5 M de chlorhydrate de guanidine. Ensuite, laver les coupes ont été lavées pendant 30 min dans 40% de DMSO et 0,05 M MgCl 2. Les cellules ont été contre-rouge nucléaire rapide.
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Résultats
Les faits que 74% des échantillons de moelle osseuse canins (n = 54) contenait des caillots quand ils sont arrivés dans notre laboratoire (figure 1A) ainsi diminué les rendements de MSC partir de ces échantillons, nous a fait croire qu'un nombre considérable de MSC a été piégé dans les caillots . En effet, une simple DAPI-taches de matériau de caillot coupe confirme la présence de cellules nucléées à haute densité (figure 1B). Cela conduit finalement à un faible nombre de cellules s...
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Discussion
Régulièrement on échantillonne moelle osseuse tandis que le patient subit une intervention chirurgicale (dans notre cas de chirurgie principalement la colonne vertébrale), avec l'avantage que seul le travail peu supplémentaire doit être effectué par le personnel de la salle d'opération. Même si les échantillons sont mélangés avec du citrate de sodium immédiatement après le retrait, de nombreux échantillons ont été partiellement coagulé quand ils sont arrivés dans le laboratoire pour le traitement. A ce stade, le...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse Grant CR3I3_140717/1 et la Fondation suisse pour paraplégiques.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| moyens de base | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha avec nucléoside, avec glutamine stable | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Inactivé par la chaleur | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotéricine B | Applichem | A1907 | |
| Milieu adipogène Composants | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insuline ; | Sigma | I5500 | |
| Sérum de lapin | Gibco | 16120099 | |
| Dexaméthasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-méthylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotine ; | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone ; | Sigma | R2408 | |
| Pantothénate ; | Sigma | P5155 | |
| Huile Rouge-O ; | Sigma | O0625 | |
| Composants du milieu ostéogène Acide | |||
| L-ascorbique 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| ß ;-glycérophosphate | Sigma | G9422 | |
| Nitrate d’argent (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| milieu chondrogène | |||
| Biopad - dispositif médical en forme d’éponge | Euroresearch | ||
| L-proline ; | Sigma | P5607 | |
| Insuline-Transferrine-Sélénium X | Gibco | 51500056 | |
| Facteur de croissance transformant humain-&beta ; 1 ; | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nucléaire rapide rouge | Sigma | N8002 | |
| Générique | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0,5 % Trypsine-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| coloration Giemsa | Applichem | A0885 | |
| Formaldéhyde | Applichem | A0877 | |
| Acide sulfurique (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Chlorure de magnésium (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Chlorhydrate de guanidine | Applichem | A1499 | |
| Consommables | |||
| 50 ml tube de réaction | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| seringue de 10 ml | Braun | 4606108V | |
| Aiguille stérilisante (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1,7 ml Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 &mu ; Filtre à cellules m | Falcon | 6.05935 | |
| pince stérile | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| scalpel stérile | Braun | 5518059 | |
| Primaria boîte à cuture cellulaire | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| culture cellulaire - Flacon T300 | TPP | 90301 | |
| Equipement | |||
| Armoire de biosécurité microbiologique classe II | Skan | 82011500 | |
| bain-marie | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Pipette sérologique 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscope | Olympus | CKX41 | |
| incubateur humidifié Heracells 240 | Thermo 51026331 | ||
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Références
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Réimpressions et autorisations
