Paw-glisser: un roman, une analyse sensible du cylindre Souris Test

Résumé

L'analyse classique des membres antérieurs de l'asymétrie de l'épreuve de la bouteille est couramment utilisée pour évaluer les déficits comportementaux chez les rats après une lésion cérébrale ou accident vasculaire cérébral; toutefois, il ne parvient pas à détecter les déficits cohérentes chez la souris. Cette étude démontre que la quantification comportement traîner la patte est une analyse plus sensible des lésions cérébrales chez les souris.

Résumé

Le test de cylindre est couramment utilisé pour prédire une lésion ischémique focal au cortex moteur des membres antérieurs chez les rongeurs. Lorsqu'il est placé dans le cylindre, rongeurs explorer par l'élevage et de toucher les parois du cylindre avec leurs pattes des membres antérieurs pour un soutien postural. Après une lésion ischémique du cortex sensori-moteur du membre antérieur, les rats se fient davantage sur leur patte avant patte affectée pour le soutien postural entraîne moins de touches avec leur patte affectée qui est appelé forelimb asymétrie. En revanche, une lésion ischémique focal dans le cerveau de la souris ne parvient pas à entraîner des déficits cohérentes comparables dans asymétrie des membres antérieurs. Si les déficits des membres antérieurs d'asymétrie sont rarement observés, les souris ne démontrent un roman comportement post-AVC appelé "patte traîner". Paw traîner est la tendance pour une souris pour faire glisser sa patte affectée le long de la paroi du cylindre plutôt que de pousser directement sur de la paroi lors du démontage d'un arrière à une position à quatre pattes. Nous avons précédemment démontré quecomportement traînant la patte est très sensible aux petites blessures ischémiques corticales au cortex moteur des membres antérieurs. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'analyse de la patte-glisser. Nous définissons ce qu'est une patte-traînée est et démontrons comment quantifier le comportement de la patte-glisser. Le test du cylindre est un test simple et peu coûteux à administrer et ne nécessite pas de pré-formation ou les stratégies de la privation de nourriture. En utilisant l'analyse de la patte-glisser avec le test du cylindre, il remplit un créneau pour prédire les blessures ischémiques corticales tels que photothrombosis et l'endothéline-1 (ET-1) l'ischémie induite - deux modèles qui sont de plus en plus en popularité et produisent blessures focaux petits que l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne. Enfin, la mesure du comportement de la patte-glisser dans le test du cylindre permettra des études de récupération fonctionnelle après une lésion corticale en utilisant une large cohorte de souches de souris transgéniques où l'analyse précédente des membres antérieurs d'asymétrie a échoué à détecter des déficits constants.

Introduction

L'objectif des stratégies de régénération de neurones est de démontrer à la fois la réparation des tissus et la récupération fonctionnelle. La récupération fonctionnelle est généralement évaluée par des tests comportementaux qui mesurent les déficits fonctionnels, dans ce cas impliquant des habiletés motrices qui sont associés à des lésions des régions spécifiques du cerveau. Lésion traumatique du cerveau ou une lésion ischémique à la zone de la patte avant sensorimotrice du cortex peuvent être démontrées par un certain nombre de tests comportementaux. Un tel test, le test de la bouteille est largement utilisé chez les rats pour évaluer les déficits fonctionnels de l'activité des membres antérieurs ^1. Le test a un faible coût de mise en place ne nécessitant qu'un cylindre, un appareil photo et une table avec un top transparent. Il est facile à administrer car il est basé sur le comportement exploratoire naturelle des rongeurs, afin de pré-formation et la privation de nourriture ou récompenses ne sont pas nécessaires. Malgré ces nombreux avantages, le test du cylindre est sous-utilisé pour évaluer les déficits des membres antérieurs chez des souris après blessures focaux à la patte antérieure sensorimotor cortex, que nous attribuons à l'analyse du comportement de la souris dans le test du cylindre. Asymétrie des membres antérieurs est la mesure classique de l'analyse pour le test du cylindre. Lorsqu'il est placé dans le cylindre, rongeurs explorent naturellement les parois du cylindre par l'élevage sur leurs membres postérieurs et de toucher les parois des cylindres avec leurs pattes des membres antérieurs pour l'équilibre postural. Le nombre de touches de patte avec le mur à chaque membre antérieur est facilement quantifiable en filmant les rongeurs au cours de cette exploration du cylindre. Asymétrie des membres antérieurs se produit lorsque la patte de la patte avant affectés rend moins touches avec la paroi de la patte antérieure patte affectée et est un signe de dommages au cortex sensori-moteur controlatéral. Chez le rat, les injections intra-corticale de l'agent vasoconstricteur, l'endothéline (ET-1), dans le cortex sensori-moteur membre antérieur provoque une lésion ischémique focal qui se traduit par des déficits comportementaux dans le membre antérieur contralatéral. Les déficits dans l'utilisation des membres antérieurs controlatéral sont facilement détectés que les changements dans forelimb asymétrie dans le test de la bouteille chez les rats ^3.1. Contrairement aux rats Cependant, les changements dans les membres antérieurs asymétrie sont variables et moins cohérente chez des souris après comparables ET-1 injections ^4-6. Ici, nous démontrons une nouvelle analyse du comportement des membres antérieurs dans le test du cylindre - analyse du comportement de la patte-glisser. Nous avons précédemment montré que l'analyse de la patte-glisser est une mesure plus sensible de dommages à la patte antérieure du cortex sensori-motrice chez la souris que l'analyse classique des membres antérieurs d'asymétrie et est applicable à une grande variété de modèles de lésion corticales focales donc.

Examen de la façon dont les contacts des pattes avant la paroi du cylindre suivant la lésion ischémique dans le cortex sensori-motrice des membres antérieurs a révélé un nouveau comportement chez la souris - patte-glisser ^4. A la patte-drag intervient lorsque la souris dresse sur ses pattes arrière pour explorer la paroi du cylindre puis fait glisser sa patte affectée (contre-lésionnelle) le long de la paroi du cylindre vers sa ligne médiane ou vers le bas tout en le mursa patte affectée fournit un soutien postural contre le mur. Paw-traîne se produisent rarement chez les souris indemnes donc l'apparition d'une patte-traînée est un indicateur positif de blessure à la patte antérieure du cortex ^sensori-4. Nous avons déjà quantifié le comportement de la patte-glisser à la souris après l'ET-1 dommage ischémique à la patte antérieure cortex sensorimoteur et avons montré un comportement de la patte-glisser soutenue chez les souris jusqu'à deux semaines post-AVC ^4. Ici, nous montrons que le comportement de la patte-glisser est maintenue jusqu'à quatre semaines post-AVC. Analyse du comportement de la patte-glisser fournit un outil de nouvelle et sensible pour l'évaluation des dommages ischémique focal au cortex sensori-moteur du membre antérieur chez la souris. Sa mise en place peu coûteux, la facilité d'administration et la notation en font un outil simple, mais utile pour évaluer rapidement les déficits comportementaux membres antérieurs chez la souris.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes les expériences ont été approuvés par l'Université Memorial de comité d'éthique le soin des animaux de Terre-Neuve, selon les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux.

1. Souris

1. Utilisez la souris adulte. Dans cette étude, des souris mâles adultes FVBN (n = 10), entre 4.2 mois ont été utilisés. Souris maison sur un h 12:12 inverse cycle lumière-obscurité et fournissent nourriture standard pour rongeurs et de l'eau ad libitum.

2. Matériel requis pour le cylindre d'essai

1. Obtenir une table avec un dessus transparent pour filmer le test du cylindre. Les dimensions de la table ne sont pas pertinentes, le sommet doit être en plexiglas ou en verre, et il doit y avoir suffisamment d'espace pour placer un miroir en dessous de la table. Cela permet à la souris filmé par le bas. Utilisez un miroir sous le tableau pour refléter l'image à travers le cylindre. A titre de variante, utiliser une caméra à l'envers, si disponible. Les dimensions de la table utilisés dans ce protocole sont 54 x 56 x 66.5cm (lx L xh) avec un 51 x 51cm haut (lx L).
2. Obtenir un miroir. Les dimensions du miroir utilisés dans ce protocole sont de 34 x 58cm (lx L).
3. Obtenir un cylindre transparent / plexiglas pour la souris pour effectuer. Les dimensions du cylindre utilisés dans ce protocole sont 17.5cm de haut, 8,8 cm ID, 9.5cm OD avec une épaisseur de paroi de 0.35cm. Un grand cylindre peut être nécessaire pour les souches de souris plus actifs.
4. Placer la bouteille sur la table et de filmer le reflet dans le miroir ci-dessous.
5. Une caméra vidéo et un trépied sont nécessaires. Enregistrer des vidéos à environ 650kb / s, ce qui est d'environ 190 Mo par 5 min de cylindre vidéo. Assurez-vous que l'appareil dispose d'une fonctionnalité de zoom pour veiller à ce que le cylindre englobe l'ensemble du champ de vision.
   NOTE: La caméra vidéo utilisée dans ce protocole est un Sony DCR-SR42, zoom optique 40x, zoom numérique 2,000x, 680kpix qui utilise la définition standard, NTSC vidéo entrelacée).
6. Obtenir un logiciel pour l'analyse - un pl de médiasayer avec support vidéo et la modulation de la vitesse de lecture. Le lecteur multimédia utilisé dans ce protocole est la v2.1.2 VLC Media Player.
7. Obtenir un ordinateur avec un système d'exploitation capable d'exécuter le lecteur multimédia et un moniteur.
8. Stockage électronique pour les vidéos est nécessaire. Télécharger des vidéos sur un disque dur externe ou le copier sur DVD pour le stockage à long terme.
   NOTE: À 190MB par vidéo, 84 sessions tiendront sur un Go de carte SD 16 et 168 séances tenir sur une carte SD de 32 Go. En raison de la inexpensiveness relative des médias SD, et de l'incertitude dans combien de temps certaines souris ont besoin pour compléter 20 arrières, une carte de 32 Go est recommandée. Dans l'étude actuelle, les vidéos ont été copiés à partir de l'appareil photo à un disque dur externe de 2 To, puis recopiés sur des DVD que la sauvegarde.

3. installation expérimentale du cylindre d'essai

1. Fixer miroir en dessous de la table à un angle de 45 degrés par rapport à la table. Faire en utilisant deux supports attachés aux pieds de la table à SOUTIENt le haut et le bas du miroir, respectivement. emplacement des supports sont notés dans une vue latérale de la table (figure 1A) et une vue de face de la table (figure 1B).
2. Placer le cylindre sur l'axe de la table. Dessinez quatre lignes équidistantes où le cylindre est assis sur la table avec un marqueur noir (Sharpie) de sorte que le cylindre peut être levé et est retourné à la même position (Figure 2). Les appuyant sur la face inférieure du plateau de table transparent permet à la table à nettoyer entre les expérimentations animales sans dissoudre l'encre de marquage.
3. Fixez l'appareil photo et trépied. Dirigez l'appareil vers le miroir pour que l'image est à la recherche directement dans le corps du cylindre. Assurez-vous que la paroi intérieure du cylindre plein est visible et non obstruée par la base (Figure 3). Voir une vue de côté sur de l'installation, y compris l'angle relatif de la configuration de la caméra et d'un miroir, d'en haut (figure 4A) et de laniveau de la table, y compris un élevage de souris (figure 4B).
4. Préparer les cartes de repère pour identifier chaque souris avant le tournage. Veiller à ce que les cartes comprennent généralement un numéro d'identification pour chaque souris, le temps-point de l'essai (par exemple., 3 jours après le traitement) et la date de la session de tournage. Ne pas inclure le groupe de traitement sur la carte de repère pour assurer l'expérimentateur est aveuglé.
5. Film dans des conditions d'éclairage intérieur standards que ce niveau de lumière est nécessaire pour voir clairement les mouvements de la souris autour du cylindre.
   NOTE: Si disponible filmer dans le noir avec une caméra de lumière rouge peut suffire, mais il faudrait d'abord besoin de tester si des touches de patte et dragues sont clairement visibles pour la quantification.

4. Exécution

1. Commencer à filmer. Afficher la carte de repère approprié de la souris en face de la lentille de la caméra.
2. Abaissez la souris dans le cylindre du haut ouverte immédiatement après le tournage de la carte de repère.
3. Commencer le tournage de la souris. Minimiser le bruit pendant ce temps, les souris peuvent perdre tout intérêt à explorer si surpris.
4. Observer la partie arrière de la souris pour explorer le cylindre. Capturez la vidéo jusqu'à ce que la souris effectue un minimum de vingt arrières.
   NOTE: A l'arrière se produit lorsque les deux pattes de devant perdent le contact avec le sol et la souris se dresse sur ses pattes de derrière.
5. Essuyez table et le cylindre avec une solution de nettoyage appropriée entre chaque souris pour assainir et retirer senteurs de souris.
6. La congélation est lorsque les souris arrêtent explorer et restent tranquillement assis à quatre pattes pendant environ 5 min. Si souris gèlent avant vingt arrières se produisent, il peut être nécessaire de les retirer de la bouteille pendant 10-20 min avant de reprendre le test. Si les souris ne fonctionnent pas vingt arrières, ils sont retirés de l'étude.
   NOTE: Dans notre expérience, les souris ont jamais eu besoin d'être exclues en raison de l'échec d'explorer le cylindre.

5. Évaluation du cylindre d'essai en utilisant Paw-GlisserAnalyse

1. Lire la vidéo à une vitesse comprise entre 0,25x et 0,67x vitesse régulière en fonction de la rapidité avec laquelle la souris explore le cylindre. Utilisez un lecteur multimédia qui offre des vitesses de lecture plus lente.
2. Quantifier le nombre total de touches de patte. Touches Paw se produisent lorsque les arrières de souris (figure 5A), touche le côté du cylindre (figure 5B), démonte ensuite avec les deux pattes simultanément (Figure 5C) et les terres (Figure 5D). La patte peuvent ou non communiquer avec la paroi du cylindre avec une palme complet, mais un certain contact avec la paroi du cylindre doit se produire. Évaluer touches de pattes en comptant le nombre de fois que la souris est en contact (peu importe comment brève) avec la paroi du cylindre avec une ou les deux pattes de devant, debout sur ses pattes arrière au cours d'un arrière.
   Notez que le contact avec la paroi du cylindre est comptée comme une «patte contact» ou «patte-glisser" si la souris est dans une position arrière - deboutsur ses pattes arrière avec les deux pattes de devant hors de la table. Si la souris reste dans une position à 3 points - deux membres postérieurs et une patte sur la table et commence à toucher le mur avec la patte libre - cela ne compte pas comme une touche de patte. Souris peut arrière et toucher la paroi du cylindre avec une seule patte et cela est compté comme une touche de patte. Remarque: une souris peut également déplacer son corps autour du cylindre lors d'une arrière, faisant plus de deux contacts. Ces contacts sont comptés - un pour chaque patte touche gauche et un pour chaque patte touche droite.
3. Quantifier le nombre de patte-dragues. Comportement glisser Paw est distincte de touches de patte normales.
   1. Si les contacts de patte de la paroi du cylindre avec une paume ouverte complète (figure 6B), il va lentement se détacher de la paroi, souvent avec un léger tremblement. Le mouvement commence par les chiffres traînant contre la paroi du cylindre soit dans une direction médiale ou vers le bas, (Figure 6C) avant de retomber completEly (Figure 6D). La souris sera alors démonter avec sa patte affectée (Figure 6E) avant d'atterrir sur quatre pattes (figure 6F). Ceci est considéré comme une patte-glisser et devrait être pris en compte dans le décompte.
   2. Si la patte ne pas en contact avec la paroi du cylindre avec une palme totalement ouvert, il se brouter la paroi du cylindre avec ses chiffres avant de tomber loin de la paroi du cylindre. De même, une souris peut glisser sa patte contre la paroi du cylindre, mais pas libérer entièrement avant de descendre. Ceux-ci sont tous deux considérés comme patte-traîne ainsi que des touches et doit être compté à la fois dans un décompte.
   3. La patte peut également faire glisser le long de la paroi du cylindre alors qu'une souris explore le cylindre. Dans ce cas, la patte suivra la torsion du torse de la souris comme il explore gauche ou à droite de sa position initiale (Figure 7A-D) avant le démontage (Figure 7E). Ceci ne constitue pas une patte-glisser, car elle dépend de la souris en choisissant au hasardune direction à explorer et ne dépend pas de l'hémisphère dans lequel corticale a été endommagé.
4. Paw-dragues sont exprimés en pourcentage de la patte-traîne par rapport au nombre total de touches de patte au cours d'une session. Exprimez le nombre de patte-traîne comme un pourcentage de contacts de patte totales pour chaque membre antérieur séparément.
5. Touches résultant en une patte glisser comptent comme une patte-glisser une touche simultanément. Ainsi, si une souris traîne sa patte à chaque fois ses contacts de patte la paroi du cylindre, le pourcentage de la patte-glisser est exprimée comme 100%.

6. conception expérimentale supplémentaires Suggestions

1. Pour minimiser les variables parasites:
   1. Test de la souris en même temps sur chaque jour de test. Testez les souris au cours de leur cycle de sillage. Garder la souris sur un cycle de lumière de 12 h inverse facilite l'exécution.
   2. Les souris peuvent être réticents à explorer le cylindre si souligné soit par le bruit ou un nouvel environnement. Test de la souris dans leur salle de détention des animaux ou une chambre qu'ils ont been familiarisé avec réduit le stress. Cela peut se produire si la salle est bruyante, si la souris a été bousculé avant d'entrer dans le cylindre ou à cause de l'accoutumance.
      NOTE: test doit être effectué une fois avant la manipulation expérimentale pour servir comme une lecture de référence. Après la manipulation, jours d'essais sont à la discrétion de l'expérimentateur, mais il est conseillé d'éviter un trop grand nombre d'expositions au cylindre sur une courte période de temps.
   3. Souris peut devenir réticents à l'arrière 6-7 après exposition à la bouteille. Pour la présente étude, les souris ont été testées dans le cylindre pour un total de sept fois, avant l'ischémie et aux jours 1, 3, 7, 14, 21 et 28 post-chirurgicale.
      NOTE: Dans cette étude, nous avons utilisé la souche FVBN souris. Nous avons déjà testé souris C57Bl / 6 dans le cylindre et le comportement de la patte-traînant observée suite à une lésion ischémique ET-1 (données non présentées). C57BL / 6 étaient plus actifs que les souris FVBN lorsque l'élevage et souvent sauté sur le bord du cylindreavant de grimper sur. Taller cylindres doivent être utilisés si les souris tentent d'échapper en sautant.

7. L'endothéline-1 Chirurgie et d'infarctus mesures de volume

1. Effectuer l'endothéline-1 chirurgie et les mesures de volume de l'infarctus selon des protocoles précédemment publiés ^4. Pour cibler la partie antérieure du cortex moteur des membres antérieurs, chaque souris devrait recevoir trois injections ET-1 aux coordonnées suivantes: (i) 0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 médio-latérale (ml) / - 1.2 dorso-ventral (DV), ( ii) 0,4 AP / 1,25 ml / - 1.2 DV et (iii) 0,1 AP / 1,75 ml / -1,2 DV ^4.

8. Analyse statistique

1. A deux sens mesures répétées analyse de variance (Anova) est recommandé d'analyser le pour cent de la patte-glisser pour les pattes affectées et non affectées à travers différents points de temps.

Résultats

Nous avons déjà démontré que le comportement de la patte-glisser apparaît suite à une blessure ischémique focal à la patte antérieure sensori cortex et est un indicateur positif de dommages ^4. Les injections intra-corticale de l'ET-1 dans le cortex sensori-motrice des membres antérieurs ont été utilisés pour induire une lésion ischémique (figure 8A, B). Cette étude a examiné si le comportement de la patte-glisser prolongé pour plus de 14 jours après la blessure pour son utilisation potent...

Discussion

Les points clés pour établir le comportement lors de la quantification de la patte-glisser dans le test du cylindre sont les suivants: i) de quantifier le nombre de patte-traîne par rapport au total des touches de patte pour chaque patte avant une lésion cérébrale d'établir une base de référence; ii) de quantifier le nombre de patte-traîne par rapport aux touches totales de patte pour chaque patte suite à la lésion ischémique; et iii) la distinction entre une patte-glisser et le mouvement latéral de la patte le long...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
		en plexiglas	de 17,5 cm de haut, 9,5 cm de diamètre extérieur, 8,8 cm de diamètre intérieur, épaisseur de paroi 0,35 cm (ou 3,5 mm)
table			d’observation 54x56x66,5 cm (largeur x longueur x hauteur), le dessus de la table est une feuille de plexiglas de 51x51 cm.
Caméra vidéo miroir			34x58 cm
	Sony	DCR-SR42	Caméra vidéo avec stockage intégré, fonctionnalité SD, zoom optique 40x
Processeur	Dell	Optiplex 760	: Intel, 3,0 GHz, mémoire 4,00 Go (RAM)  ;
moniteur d’ordinateur	Samsung	S22C350H
Excel (Microsoft Office Professional Plus)	Microsoft	v14.0.7106.5003
VLC Media Player	Video LAN	v2.1.2	Lecteur multimédia avec modulation de vitesse de lecture et prise en charge vidéo
Disque dur externe	Western Digital	WDBAAU0020HBK-01	2 To

Cylindre