Article de méthode

Dispositifs à base de papier pour l'isolement et la caractérisation de vésicules extracellulaire

DOI :

10.3791/52722

⸱

3 avril 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des vésicules extracellulaires (VE), de petites particules libérées par des cellules membranaires, d'aussi peu que 10 échantillons de sérum ul. Cette approche évite la nécessité d'ultracentrifugation, ne nécessite que quelques minutes de temps de dosage, et permet l'isolement des véhicules électriques à partir d'échantillons de volumes limités.

Résumé

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Vésicules extracellulaires (VE), membraneuses particules libérées par divers types de cellules, détiennent un grand potentiel pour des applications cliniques. Ils contiennent cargaison d'acide nucléique et des protéines et sont de plus en plus reconnus comme un moyen de communication intercellulaire utilisé à la fois par eucaryote et les cellules procaryotes. Toutefois, en raison de leur petite taille, les protocoles actuels pour l'isolement des véhicules électriques sont souvent beaucoup de temps, lourde, et nécessitent de grands volumes d'échantillons et des équipements coûteux, comme une ultracentrifugation. Pour répondre à ces limitations, nous avons développé une plate-forme d'immunoaffinité à base de papier pour séparer les sous-groupes de véhicules électriques qui est facile, efficace et nécessite des volumes d'échantillon aussi faibles que 10 pi. Les échantillons biologiques peuvent être introduits à la pipette directement sur les zones de test de papier qui ont été chimiquement modifiés avec des molécules de capture ayant une affinité élevée à des marqueurs spécifiques de la surface d'exposition. Immunosorben lié à une enzyme, à base de papier Nous valider l'essai en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB)t essais (P-ELISA), et l'analyse du transcriptome. Ces dispositifs à base de papier permettront l'étude des véhicules électriques dans la clinique et le contexte de la recherche pour faire avancer notre compréhension des fonctions EV en matière de santé et de la maladie.

Introduction

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Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules membraneuses hétérogènes dont la taille varie de 40 nm à 5 000 nm et qui sont libérées activement par de nombreux types de cellules via différentes voies de biogenèse1-9. Ils contiennent des sous-ensembles uniques et sélectionnés d’ADN, d’ARN, de protéines et de marqueurs de surface provenant de cellules parentales. Leur implication dans une variété de processus cellulaires, tels que la communication intercellulaire10, la modulation de l’immunité11, l’angiogenèse12, les métastases12, la chimiorésistance13 et le développement de maladies oculaires9, est de plus en plus reconnue et a suscité un grand intérêt pour leur utilité dans les applications diagnostiques, pronostiques, thérapeutiques et de biologie fondamentale.

Les EV peuvent être classiquement classés en exosomes, microvésicules, corps apoptotiques, oncosomes, ectosomes, microparticules, téléérosomes, prostatosomes, cardiosomes et vexosomes, etc., en fonction de leur biogenèse ou de leur origine cellulaire. Par exemple, les exosomes se forment dans des corps multivésiculaires, tandis que les microvésicules sont générées par bourgeonnement directement à partir de la membrane plasmique et les vésicules apoptotiques proviennent de cellules apoptotiques ou nécrotiques. Cependant, la nomenclature n’est pas encore encore raffinée, en partie en raison d’un manque de compréhension et de caractérisation approfondies des VE. Plusieurs méthodes ont été développées pour purifier les VE, notamment l’ultracentrifugation14, l’ultrafiltration15, les billes magnétiques16, la précipitation polymère17-19 et les techniques microfluidiques20-22. La procédure la plus courante pour purifier les VE implique une série de centrifugations et/ou de filtration pour éliminer les gros débris et autres contaminants cellulaires, suivie d’une ultracentrifugation finale à grande vitesse, un processus coûteux, fastidieux et non spécifique14,23,24. Malheureusement, le besoin technologique d’isoler rapidement et de manière fiable les véhicules électriques avec une pureté et une efficacité satisfaisantes n’est pas encore satisfait.

Nous avons développé un dispositif d’immunoaffinité sur papier qui offre un moyen simple, rapide et économique, mais efficace, d’isoler et de caractériser des sous-groupes de VE22. Le papier cellulosique découpé dans une forme définie peut être disposé et laminé à l’aide de deux feuilles de plastique avec des trous traversants enregistrés. Contrairement à la stratégie générale consistant à définir la limite du fluide dans les dispositifs à base de papier en imprimant de la cire hydrophobe ou des polymères25-27, ces motifs en papier laminé résistent à de nombreux liquides organiques, y compris l’éthanol. Les zones de test en papier sont chimiquement modifiées pour fournir une couverture stable et dense de molécules de capture (par exemple, des anticorps spécifiques à la cible) qui ont une grande affinité pour des marqueurs de surface spécifiques sur des sous-groupes EV. Les échantillons biologiques peuvent être pipetés directement sur les zones de test du papier, et les VE purifiés sont conservés après les étapes de rinçage. La caractérisation des VE isolés peut être effectuée par MEB, ELISA et analyse transcriptomique.

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Protocole

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Un schéma général de la procédure d'opération est fourni à la figure 1. Utilisation de pratiques éthiques, nous avons recueilli des échantillons de sang de sujets sains, et obtenu des échantillons de l'humeur aqueuse de patients à travers le Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan sous CISR protocoles approuvé ( CISR TCVGH n ° CF11213-1).

1. fabrication de dispositifs papier

  1. Couper le papier de Chromatographie en cercles de 5 mm de diamètre pour fournir la même disposition que une plaque de microtitrage à 96 puits. Sandwich ces morceaux de papier avec deux feuilles de polystyrène ayant son siège trous traversants, et stratifié.
  2. Modifier dispositifs de papier en utilisant le procédé de conjugaison chimique décrite dans ce qui suit les étapes 28.
    1. Traiter les dispositifs de papier avec un plasma d'oxygène (100 mW, 1% d'oxygène, 30 sec) dans une chambre à plasma.
      ATTENTION: Une attention particulière doit être prise lorsque vous travaillez avec 3-mercaptopropyltriméthoxysilane et-maléimidobutyryloxy de succinimide Nester (GMBS), car ils sont à la fois sensibles à l'humidité et toxique. Porter des gants de protection et éviter l'inhalation ou contact avec la peau et les yeux. Gardez le stock flacon hermétiquement fermé et le laisser se stabiliser à la température ambiante avant d'ouvrir pour éviter la condensation de l'eau. Vous pouvez également ouvrir la bouteille de l'intérieur d'un sac ou une boîte gants remplie d'azote. Aliquote en petits flacons pour éviter l'ouverture fréquente du stock bouteille.
    2. Immédiatement incubat traitée dispositifs de papier dans une (v / v) à 4% de 3-mercaptopropyltriméthoxysilane dans de l'éthanol (200 proof) pendant 30 min.
    3. Rincer les dispositifs de papier avec de l'éthanol et de les incuber avec 0,01 umol / ml dans de l'éthanol GMBS pendant 15 min.
    4. Rincer avec de l'éthanol (200 proof) et incuber dispositifs de papier avec 10 ug / ml d'avidine en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 1 heure à 4 ° C. Conserver à 4 ° C si nécessaire, et d'utiliser dans les 4 semaines.
  3. Mouiller chacune des zones de test de papier avec 10 ul de PBS contenant 1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) Pour 3 x 10 min avant de repérer 10 ul biotinylé molécules de capture pour 3 x 10 min. Utiliser anticorps anti-CD63 (20 ug / ml dans du PBS contenant 1% (p / v) de BSA et 0,09% (p / v) d'azoture de sodium) ou l'annexine V (01:20, v / v dans du tampon de liaison d'annexine V) comme molécules de capture.
  4. Rincer molécules d'anticorps ou l'annexine V anti-CD63 non liés en utilisant 10 ul correspondant PBS contenant 1% (p / v) de BSA ou de l'annexine V solutions de tampon de liaison pour 1 × 3 min, respectivement.

2. sérum et humeur aqueuse Prélèvement et traitement

  1. Collecte le sérum.
    1. Recueillir 10 ml de sang périphérique par ponction veineuse dans des tubes de séparation du sérum et inverser doucement le tube cinq fois. Réglez le tube en position verticale et attendre 30 min.
    2. Centrifuger à 1200 xg pendant 15 min. Transférer le sérum à partir de la couche supérieure dans un tube propre, et centrifuger à nouveau à 3000 g pendant 30 min.
    3. Passez le surnageant à travers un fil de 0,8 umter. Conserver l'échantillon à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  2. La collecte de l'humeur aqueuse: recueillir des échantillons d'humeur aqueuse de patients diagnostiqués par un ophtalmologiste directement par des procédures et des échantillons de magasins invasive à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Isolement de vésicules extracellulaires

  1. Échantillons ponctuels sur chaque zone de test de papier à un taux de 5 pi / min.
  2. Rincer VE non liées avec 10 pi correspondant PBS contenant 1% (p / v) de BSA ou de l'annexine V solutions de tampon de liaison pour 1 × 3 min pour les dispositifs de papier fonctionnalisées avec des anticorps anti-CD63 ou l'annexine V molécules, respectivement. Effectuez les tests suivants en aval.

4. Essai Exemple 1 en aval: Electromicrographs d'analyse

  1. Fix VE capturées sur la zone de test de papier fonctionnalisé en utilisant 10 ul 0,5 × fixateur de Karnovsky pendant 10 min.
  2. Rincer les échantillons avec une vaste PBS pendant 2 × 5 min.
  3. Déshydrater leles échantillons à la suite de l'éthanol à 35% pendant 10 min, éthanol à 50% pendant 2 x 10 min, de l'éthanol à 70% pendant 2 x 10 min, éthanol à 95% pendant 2 x 10 min et 100% d'éthanol pendant 4 x 10 min.
  4. Critical sec et pulvérisation enrober les échantillons avec du palladium / or, et d'examiner l'aide d'un microscope électronique à balayage fonctionnant à basse tension d'accélération des électrons (~ 5 kV).

5. aval Assay Exemple 2: ELISA à la version papier

  1. Ajouter une solution à 5 pi contenant l'anticorps primaire anti-CD9 à 1: 1000 dilution dans du PBS à chaque zone de test contenant VE capturées. Attendre 1 min.
  2. Rincer les échantillons avec 30 ml de PBS agité à 100 rpm pendant 30 s.
  3. Ajouter 5 ul solution contenant la peroxydase de raifort (HRP) lié en anticorps secondaire au 1: 1000 dilution dans du PBS et attendre 1 min.
  4. Rincer les échantillons avec 30 ml de PBS agité à 100 rpm pendant 30 s.
  5. Ajouter un substrat colorimétrique 5 ul contenant 1: 1 en volume d'un peroxyde d'hydrogèned 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et numériser à l'aide d'un scanner de bureau.

Exemple 6. En aval de test 3: Isolement de l'ARN

  1. Plonger les échantillons dans 35 ul d'aide d'isolement d'ARN à base de polyvinylpyrrolidone et 265 pl de lyse / tampon de liaison pour lyser les véhicules électriques capturées. Vortex vigoureusement.
  2. Ajouter 30 ul d'homogénat fourni dans le kit d'isolation au lysat. Vortex vigoureusement et mis sur la glace pendant 10 min.
  3. Extraire l'ARN en utilisant une séparation de l'acide phénol-chloroforme décrit dans les étapes suivantes.
    1. Prendre 330 ul de phénol-chloroforme à partir de la couche inférieure de la bouteille et ajouter à l'homogénat / lysat. Vortex vigoureusement.
    2. Centrifuger à 10 000 g pendant 5 min. Transférer la phase aqueuse (supérieure) dans un tube propre et noter le volume enlevé.
  4. Précipiter l'ARN total avec 100% d'éthanol du volume qui est de 1,25 fois le volume de la phase aqueuse éliminée à l'étape précédente et collect l'ARN dans la solution d'élution préchauffé à 95 ° C.
  5. Concentrer et purifier davantage l'ARN en utilisant un kit de nettoyage de l'ARN selon le protocole du fabricant.

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Résultats

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La capacité du dispositif de papier pour isoler les sous-groupes de VE se appuie de manière efficace sur la reconnaissance sensible et spécifique de marqueurs de surface EV. La modification stable de fibres de papier avec des molécules de capture est obtenue en utilisant la chimie de l'avidine-biotine tel que décrit ailleurs 28-30. L'efficacité de la conjugaison chimique et celle de la méthode de physisorption est évalué en utilisant les lectures basées sur la fluorescence. Les zones de test de papier sont pr...

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Discussion

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Les étapes les plus critiques pour l'isolement réussi de sous-groupes de vésicules extracellulaires sont: 1) un bon choix de papier; 2) une couverture stable et élevé de molécules de capture sur la surface des fibres de papier; 3) la manipulation correcte des échantillons; et 4) la pratique de l'hygiène générale de laboratoire.

Les matériaux poreux ont été utilisés dans de nombreux tests peu coûteux et sans équipement. Ils peuvent avoir une taille de pores accordable, la fonctionnali...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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Ce travail a été financé en partie par NSC 99-2320-B-007-005-MY2 du Conseil national des sciences de Taiwan (CC) et NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) et le Veterans General Hôpitaux et University System of Programme conjoint de recherche de Taiwan (CC).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Papier de chromatographieGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® ; Papier cellulosique de grade 1
(3-Mercaptopropyl) triméthoxysilaneSigma Aldrich175617Ce produit chimique réagit avec l’eau et l’humidité et doit être appliqué à l’intérieur d’un sac à gants rempli d’azote. Évitez tout contact avec les yeux et la peau. Ne respirez pas de fumées et n’inhalez pas de vapeurs.
ÉthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, grade biologie moléculaire
Albumine sérique bovine (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Souvent appelé fraction de Cohn V.
N-γ ;-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS est un agent de réticulation amine-sulfhydryle. GMBS est sensible à l’humidité.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin a 4 sites de liaison pour la biotine et sa valeur pI est de 6,3, ce qui est plus neutre que l’avidine native
Souris biotinylée anti-humaine anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
annexine biotinylée VBD Biosciences556418Annxin V a une forte affinité pour la phosphatidylsérine (PS)
Anti-CD9 primaire et secondaire anticorpsSystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1L’anticorps secondaire est conjugué au peroxydis de raifort
Tubes de séparation sériqueBD Biosciences367991Activateur de caillot et gel pour la séparation sérique
Tampon de liaison à l’annexine VBD Biosciences 55645410x ; diluer à 1x avant utilisation.
Ensemble de réactifs de substrat TMBBD Biosciences555214L’ensemble contient du peroxyde d’hydrogène et de la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB)
[en-tête]
Kit d’isolement d’ARNLife TechnologiesAM1560Kit d’isolement d’ARN MirVana
Aide à l’isolement d’ARN à base de polyvinylpyrrolidoneLife TechnologiesAM9690L’aide à l’isolation de l’ARN végétal contient de la polyvinylpyrrolidone (PVP) qui se lie aux polysaccharides.
Kit de nettoyage de l’ARNQiagen Inc.74004Le kit de nettoyage de l’ARN MinElute est conçu pour la purification d’un maximum de 45 &mu ; g ARN.
Chambre à plasmaMarch InstrumentsPX-250
Microscope électronique à balayageHitachi Ltd.S-4300
Hewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108 bits des images couleur ont été capturées. Des appareils photo et des téléphones intelligents peuvent également être utilisés.
Système d’enregistrement d’imagesJ& DesGeneSys G :BOX ontété capturées. Des microscopes à fluroscence peuvent également être utilisés.
Scanner de bureau images de fluroscence 16 bits de H Technology Co

Références

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