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Article de méthode

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

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DOI :

10.3791/52724

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27 septembre 2015

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1Team "Early Stages of Parkinson's Disease" of the Jean-Pierre Aubert Research Center, INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2, 2Team "Signal Division Regulation", CNRS UMR 8576, University of Lille 1

Dans cet article

Résumé

Le contrôle de la synthèse des protéines se produit principalement à l’étape d’initiation de la traduction, dont les déficiences sont liées à divers troubles. Pour mieux comprendre leur étiologie, nous avons décrit ici un protocole utilisant des ovocytes de Xenopus laevis évaluant la traduction du transcrit mos en présence d’un mutant du facteur d’initiation de traduction eIF4G1.

Résumé

La synthèse des protéines est un processus fondamental de l'expression du gène impact divers processus biologiques, notamment d'adaptation à des conditions environnementales. L'étape d'initiation, qui implique l'ensemble des sous-unités ribosomiques à l'ARNm codon d'initiation, facteur d'initiation impliqués y compris eIF4G1. Les défauts de ce taux étape limitante de la traduction sont liées à divers troubles. Pour étudier les conséquences potentielles de ces dérégulations, Xenopus laevis ovocytes constituent un modèle attractif avec des degrés élevés de conservation des mécanismes cellulaires et moléculaires essentiels avec l'homme. En outre, au cours de la maturation de la méiose, les ovocytes sont transcriptionnellement réprimés et toutes les protéines nécessaires sont traduits à partir préexistantes, ARNm maternels. Ce modèle peu coûteux permet ARNm exogène pour devenir parfaitement intégrés avec une traduction efficace. Ici, on décrit un protocole pour l'évaluation de la traduction avec un facteur d'intérêt (ici eIF4G1) en utilisant stored ARNm maternel qui sont les premiers à être polyadénylé et traduits au cours de la maturation ovocytaire comme une lecture physiologique. Dans un premier temps, l'ARNm synthétisé par transcription in vitro de plasmides d'intérêt (ici eIF4G1) sont injectés dans des ovocytes et la cinétique de maturation de l'ovocyte par la détection de panne Germinal vésicule est déterminé. La cible de l'ARNm maternelle étudié est la sérine / thréonine mos-protéine-kinase. Son polyadénylation et sa traduction subséquente sont étudiées conjointement avec l'expression et la phosphorylation de protéines des mos cascade impliqué dans la maturation des ovocytes de signalisation. Variations de l'actuel protocole à mettre en avant les défauts de traduction sont également proposées pour souligner son applicabilité générale. À la lumière de la preuve que la synthèse protéique aberrante peut être impliquée dans la pathogenèse de troubles neurologiques émergents, un tel modèle offre la possibilité d'évaluer facilement l'dépréciation et d'identifier de nouvelles cibles.

Introduction

Les protéines sont des éléments essentiels de la vie cellulaire et donc à plus grande échelle de l'organisme. Ils assurent la majorité des fonctions cellulaires, y compris la structure, le transport, la réaction de catalyse, la réglementation, l'expression des gènes, etc. Leur expression est le résultat d'un mécanisme complexe de traduction permettant la conversion d'un ARNm en protéine. La traduction est soumise à divers contrôles d'adapter et de réguler l'expression des gènes en fonction des besoins de la cellule, au cours de la différenciation et le développement, le vieillissement, les stress physiologiques ou manifestations pathologiques.

La traduction est divisé en 3 phases (initiation, l'élongation et la terminaison) et présente 3 systèmes de traduction d'initiation afin de répondre à ces besoins: cap-dépendante, coiffe-indépendante par l'intermédiaire interne des ribosomes Entrée Segment (IRES) structures et les exhausteurs de traduction cap-indépendante ( CITE).

La plupart des ARNm eucaryotes sont convertis dans un bouchon-dependent manière par la 7-méthylguanosine capuchon 5'-triphosphate qui sert de caractéristique de reconnaissance pendant la synthèse de la protéine. Ce bouchon se lie à eIF4E, un composant du complexe eIF4F avec eIF4G1 et eIF4A. Associé à d'autres partenaires tels que le poly (A) Binding Protein (PABP), eIF2-GTP-Met-ARNt Met, ces facteurs d'initiation de traduction permettent de circulariser l'ARNm et améliorer son accessibilité à des formes complexes 43S jusqu'à ce que le codon d'initiation AUG reconnaissance 1. Cet événement correspond à la fin de l'à-dire d'initiation de traduction, la première étape de la traduction.

Traduction cap-indépendante est utilisée par les ARNm codant pour les protéines essentielles de conditions de stress qui provoquent la prolifération cellulaire et de l'apoptose de l'instance. Ce mécanisme comporte des structures secondaires dans l'ARNm 5 'non traduite (UTR) appelé IRES, l'extrémité carboxy-terminale de eIF4G1 associé à eIF4A et le complexe 43S. La liaison de ce 43S pré-initiation complex à IRES initie la traduction indépendante de cap sans la nécessité pour le facteur eIF4E 2,3.

Enfin, un autre mécanisme de translation pas encore bien compris soutient cette activité de traduction coiffe-indépendante dans des conditions stressées, par la CITE structures situées dans l'ARNm UTR 4.

Grâce à ces différents modes de traduction différant par leurs étapes d'initiation, la traduction joue un rôle essentiel dans l'homéostasie cellulaire et tout changement dans l'un de ces processus serait donc un impact sur l'organisme auprès des petites et grandes effets d'échelle. En effet, l'initiation est une étape limitante taux régissant les processus de traduction correcte de l'ARNm en protéines et est donc la cible de nombreux contrôles et des points 5 de régulation. Que ce soit pour ce dernier ou des composants de ces processus, si l'on se révèle être défectueux, il sera perturber l'équilibre établi dans la cellule et donc pourrait conduire à Condi pathologiquetions. Dans ce contexte, les mutations dans les facteurs de conversion ont été impliqués dans plusieurs maladies dont les maladies neurodégénératives telles que `leucoencéphalopathie avec fuite matter' blanc (eIF2B1-5 de sous-unité) 6, dans le syndrome de Walcott-Rallison (EIF2AK3 gène codant pour PERK) 7, éventuellement en maladie (eIF4G1 la p.R1205H) de Parkinson 8. Il est donc important de mener des études cellulaires et moléculaires de ces protéines mutantes d'accroître nos connaissances sur le développement de la maladie et sur le processus général d'initiation de la traduction.

Pour mener à bien ces études, il est essentiel de choisir les modèles les plus adéquats pour observer les conséquences de ces mutations ovocytes de Xenopus laevis sont particulièrement bien adaptés en raison de leurs propriétés physiologiques et biochimiques:. Synchronicité physiologique (bloqué en phase G2 du cycle cellulaire) , grande capacité de synthèse des protéines (200-400 ng / jour / ovocyte), nombre élevé de ooc extraitytes à partir d'un même animal (800-1000 ovocytes / femme) et la taille des cellules (1,2-1,4 mm de diamètre), qui facilite leur manipulation. Microinjection d'ovocytes de Xenopus avec synthétisé ARNm peut facilement être effectuée à disséquer étapes de traduction. Dans cette vue, il présente d'autres avantages. Compte tenu de la vitesse de progression de la méiose et de la traduction de l'ARNm après la micro-injection (~ 24 h), des ovocytes de Xenopus représente un système rapide par rapport aux systèmes reconstitués cellulaires de E. coli (extrait de germes de blé, ou de reticulocytes de lapin ...) dans laquelle est un ARNm traduit par un taux de conversion réduit et à une vitesse inférieure. Ainsi, les effets d'une mutation introduite dans un ARNm seront rapidement et facilement observable étudié dans plusieurs ovocytes. Un autre avantage d'ovocytes de Xenopus est que les ARNm maternels sont latente et la traduction des protéines est bloqué avant la stimulation de la progestérone. L'addition de la progestérone est donc un bon moyen de commande de l'induction de la traduction. P cytoplasmiqueolyadenylation ne se produit pas lors de l'ovogenèse. Il commence au cours de la maturation ovocytaire dans des ovocytes de progestérone stimulée dans un ordre temporel et se poursuit durant le développement précoce et pourrait être utilisé pour étudier les différentes étapes de la traduction.

La polyadénylation du mos ARNm est parmi les premiers à se produire et il appartient à Aurora A / Eg2, Histone-Like B4 ARNm à la classe des gènes «maturation précoce» au sens de Charlesworth et al. (2004) 9. L'induction de la traduction de l'ARNm "tardives" tels que la cycline A1 et B1 cycline se produit autour du moment de la rupture de la vésicule germinale (GVBD). Mos ARNm code pour une sérine / thréonine protéine-kinase. Sa traduction est cruciale car elle induit la cascade de kinase MAP qui active indirectement la maturation de l'ovocyte. En effet, en réponse à la progestérone, la polyadénylation de l'ARNm mos est renforcée par un processus impliquant Aurora A / Eg2 protéines régulatrices et d'autres protéines de liaison d'ARN avec ee 3'UTR de l'ARNm mos. Cette augmentation de polyadénylation de l'ARNm mos conduit à une augmentation du niveau de protéine de mos, qui à son tour active MEK1. Ce processus médie l'activation de la kinase extracellulaire régulée de signalisation 2 (ERK2) (Figure 1). Cette cascade de signalisation peut alors déclencher la maturation phase M facteurs favorisant, un complexe formé par la cycline B kinase Cdc2 et, et, éventuellement, conduit à la reprise de la méiose.

Par conséquent, dans ovocytes de Xenopus laevis, l'étude de l'ARNm maternels tels que mos pourrait facilement être utilisé pour tester leur traductibilité avec plusieurs paramètres de leur polyadénylation efficace à la traduction de plusieurs composants MOS de signalisation, y compris également la détermination du taux GVBD. Ce système est donc intéressant d'évaluer les premières conséquences de mutations dans les facteurs d'initiation de traduction, sans ingérence de nouveaux ARNm transcrit ou de l'efficacité de transfection, les problèmes surviennent souvent avec eukaryétudes sur les cellules auriculaires.

Ici, un protocole est établi lorsque ARNm eIF4G1 mutantes sont micro-injectés dans des ovocytes de Xenopus laevis et la traduction de l'ARNm maternelle est testé. En présence d'un défaut de progression GVBD, mos ARNm polyadénylation qui est essentiel pour la progression à travers le cycle cellulaire méiotique des ovocytes et pour la traduction ultérieure des ARNm de classe précoces et tardifs est constatée. La phosphorylation Aurora A / Eg2 et ERK est également étudié pour confirmer la conséquence de mos deregulation.Thus, des ovocytes de Xenopus représentent un moyen simple d'analyser les différentes étapes de traduction de l'ARNm.

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Protocole

Toutes les expériences de Xenopus ont été effectuées à l'animalerie de l'Université Lille 1 selon les règles des directives du Conseil de la Communauté européenne (86/609 / CEE) pour l'expérimentation des animaux de laboratoire. Le protocole de l'animal a été approuvé par la commission d'examen institutionnel local (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale Nord-Pas-De-Calais, CEEA 07/2010).

1. Manipulation d'ovocytes

  1. Préparer la solution anesthésique: dissoudre 1 g de méthane sulfonate de tricaïne poudre dans un 1 L d'eau stérile.
  2. Plunge femme Xenopus laevis dans cette solution, couvrir le bécher pour éviter l'évasion et attendre environ 45 minutes pour que l'animal soit complètement sous sédation (sans aucune réaction à une pincée de la jambe).
  3. Laver la grenouille avec du savon et rincer avec de l'eau du robinet puis placez l'animal sur son dos sur une feuille d'aluminium propre.
  4. Serrez la peau de la partie latérale de l'abdomen et au niveau des ovaires avec des pinces.Faire une incision d'environ 1 cm avec des ciseaux nettoyés avant utilisation avec de l'éthanol 70%. Assurez-vous que la section est assez profond et d'atteindre la paroi abdominale sous-jacente pour permettre l'excision du tissu ovarien dans laquelle se trouvent plusieurs ovocytes à différents stades de développement.
  5. On dissèque les lobes ovaire, les laver 4 fois dans une boîte de Petri (50 mm) avec du milieu ND96 (mM NaCl 96, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de HEPES ajusté à pH 7,4 avec NaOH, complétée avec 50 pg / ml de streptomycine / pénicilline, 225 ug / ml de pyruvate de sodium, 30 ug / ml d'inhibiteur de trypsine de soja, 1 pl / ml de tetracycline) pour éliminer toute trace de sang et de débris.
    Remarque: la tétracycline permet une conservation optimale et une bonne récupération après le traitement de micro-injection.
  6. Rangez-les dans une boîte de Petri couverte immergée dans le milieu à 14 ° C, ce qui permet leur conservation pendant une semaine.
  7. Piquer la paroi abdominale et la peau avec vétérinaire absorbable tHLit et une aiguille de suture (3 ou 4 points seront nécessaires).
  8. Placez l'animal dans un bécher sans eau et plus humide de la peau avec de l'eau du robinet jusqu'à ce que la grenouille se déplace à nouveau. Couvrir le bécher pour empêcher la fuite.
  9. Séparer les lobes d'ovaire soigneusement dans le milieu en groupes de 5 à 10 en utilisant des ovocytes de 2 paires de pinces sous un stéréomicroscope avec un grossissement de 10 fois. Sélectionnez ovocytes au stade VI. Ils peuvent être reconnus par i) leur forme et leur couleur avec un pôle animal pigmenté brun et jaune pôle végétatif séparés par une bande claire ii) leur taille supérieure à 1,2 mm de diamètre 10.
  10. Incuber les ovocytes sélectionnés dans une solution de collagénase (1 mg / ml de collagénase A de Clostridium histolyticum, dissous dans ND96 sans tetracycline) dans une boîte de Pétri sous agitation douce pendant 45 min à faciliter la defolliculation de l'ovocyte (collagénase digère les connexions des cellules folliculaires des ovocytes /). Rincer le ovocytes 3 ou 4 fois avec du milieu ND96 maintenus à 14° C.
    Note: Ne pas incuber les ovocytes moins ou plus de 45 min en raison du risque de détruire les protéines de surface de l'ovocyte et de provoquer faible viabilité. Traitement à la collagénase peut induire GVBD spontanée.
  11. Incuber ovocytes dans le milieu pendant 3-4 heures. Éliminer les cellules folliculaires avec pinces fines sous loupe binoculaire et gardez-les à 19 ° C dans un milieu ND96.

2. Préparation de l'ARNm de synthèse

  1. Linéariser 5 ug des plasmides suivants par digestion enzymatique à l'aide Pme I enzyme.
    REMARQUE: pcDNA6.2 / V5-DEST contenant un amino-acides eIF4G1 ADNc de type sauvage 1599 (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST contenant un ADNc dominant négatif eIF4G1 (eIF4G1-DN) avec des mutations c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - et c.2126T> G dans la région d'interaction entre eIF4E eIF4G1 et à la position 612 à 618 de la protéine correspondante perturber le interaction between eIF4G1 et eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP contenant chloramphénicol acétyl-transférase (GFP). Préparer les mélanges 2 pour chacune des 3 plasmides: la première comprenant Pme I enzyme et la seconde enzyme comme sans contrôle.
  2. Précipiter l'ADN plasmidique en utilisant un mode opératoire classique à l'éthanol et remise en suspension dans 20 ul de nuclease-free H 2 O.
  3. Déterminer sa concentration à l'aide d'un spectrophotomètre. La concentration doit être supérieure à 150 ng / pl pour transcrire l'ARNc.
  4. Run 1 pi d'échantillons et leurs commandes avec 5 pl de tampon de charge sur un gel d'agarose à 0,8% afin de vérifier la linéarisation du plasmide.
  5. Utilisation d'un kit de transcription in vitro et la purification d'ARNc selon les instructions du fabricant. Les ARNc transcrits sont remises en suspension dans 20 pi de sans nucléase H 2 O. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C si nécessaire.
  6. Préparer le tampon de migration MOPS 10X contenant 0,2 M de MOPS (pH 7,0), 20 mL'acétate de sodium M et EDTA 10 mM (pH 8,0). Stériliser la solution avec un filtre de 0,45 um. Garnissez la solution à l'abri de la lumière à température ambiante pour éviter l'oxydation de la solution.
  7. Nettoyer le réservoir d'électrophorèse successivement avec NaOH, HCl et rincer abondamment avec de l'eau filtrée double pour un O / N pour éviter RNase et prévenir la dégradation de l'ARN.
  8. Monter un gel d'agarose à 1,5% contenant du formaldehyde et MOPS. Chaud jusqu'à ce que la dissolution de l'agarose complète et laissez-le refroidir à 55 ° C. Sous une hotte, ajouter 0,1 volume de MOPS 10X, 6,6% de formaldéhyde et 4 pg de bromure d'éthidium (10 mg / ml). Verser le gel sous la hotte et attendre environ 1 h pour le gel de durcir.
    Remarque: le formaldéhyde et le bromure d'éthidium sont toxiques.
  9. Préparer les échantillons pour la migration dans un tube de 0,2 ml avec 1 pi d'ARNc, 8,8% de formaldéhyde, 60% de formamide et 0,1 volume de MOPS 10X. Incuber pendant 3 min à 70 ° C et de mettre les tubes sur de la glace pendant 10 min. Centrifuger les échantillons quelques secondes à5000 x g. Ajouter 2 ul de tampon de chargement de gel.
    Remarque: Le formamide est toxique.
  10. Exécutez échantillons pendant 20 min à 90V. Faire tremper le gel dans exempte de nucléase H 2 OO / N pour décolorer le gel avant de l'analyser pour vérifier la qualité ARNc.
  11. Déterminer la concentration ARNc aide d'un spectrophotomètre et les stocker à -80 ° C.

3. microinjection d'ovocytes synthétisé l'ARN et de maturation Stimulation

  1. Préparer le matériel nécessaire pour les ovocytes microinjection. Utilisez un extracteur micropipette à tirer petite capillaire en verre. Sous stéréoscopique, rompre l'extrémité du capillaire avec la pince à épiler pour créer une extrémité franche. Remplir la micropipette capillaire avec l'huile minérale en utilisant une seringue de 1 ml avec un filtre Millipore de 0,45 um à l'extrémité opposée. Montez la micropipette sur la pipette de micro-injection. Choisissez une micropipette précise calibré par le fabricant pour donner une bonne précision lorsqu'il est utilisé avec capillaire en verre approprié.
  2. Effectuer microinjection 1-2 heures après defolliculation, délai nécessaire pour la récupération d'ovocytes sur les ovocytes maintenue à 14 ° C. Utilisez des plats de Pétri avec le fond grattées avec une pince pour créer une surface adhésive pour les ovocytes et les remplir avec du milieu ND96.
  3. Disposer ovocytes long d'une voie raclée dans une boîte de Petri permettant une injection successive des ovocytes avec la micropipette capillaire à un angle de 45 ° C.
  4. Injecter dans la zone équatoriale de l'ovocyte, sous la zone de l'animal pigmenté pour une diffusion optimale d'échantillons dans le cytoplasme. Insérez seulement la partie la plus mince de la pointe capillaire sur environ 150-200 um de profondeur.
  5. Injecter 30 ng d'ARNc obtenues respectivement à partir des plasmides différents dans un volume de 60 nl dans un premier ovocyte. Après l'injection, attendez 5-10 secondes avant de retirer la pointe capillaire pour éviter évasion échantillon (figure 2A).
    Note: Ne pas dépasser 120 nl. Injecter aussi lentement que vous le pouvez. Un contrôle à l'eau distillée est recommandé.
  6. Déplacer manuellement la boîte de Pétri pour injecter la prochaine ovocyte.
    Remarque: Assurez-vous que la pointe ne soit pas bouché en générant une petite impulsion sur la solution de bain après 2 à 3 micro-injections.
  7. Transfert injecté ovocytes dans 24 puits des plaques de culture (10 ovocytes / bien) rempli avec 3 ml de milieu ND96 fraîche et laissez-les à 19 ° C.
  8. Incuber les ovocytes dans ND96 avec de la progestérone (PG) (2 ug / ml) pour déclencher la maturation méiotique (GVBD) à 19 ° C, 15 heures ou 4 heures après la micro-injection d'ARNc polyadénylés obtenus respectivement à partir pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 et pcDNA6 0,2 / C-EmGFP utilisé comme contrôle (figure 2A).
    Remarque: Co-injection de marqueur fluorescent avec l'ARNc est un bel outil pour garantir que l'ARNc a été injecté et est resté dans l'ovocyte. Effectuez ces expériences préliminaires utilisant un ARNc d'intérêt avec une étiquette de la GFP.
  9. Micro-injection comme dans # 3.5 différents rapports (1: 3, 2: 2, 3: 1) de polyadénylé eIF4G1-WT et eIF4G1-DN ARNc afin de TEST Le effet de conversion des ARNc eIF4G1-WT sur le phénotype mutant (figure 2D).

4. Répartition des vésicules Germinal Détermination

  1. Comptez le nombre d'ovocytes matures après PG stimulation par l'observation de la présence d'une tache blanche au pôle animal noir avec une loupe binoculaire. Répétez le comptage toutes les heures jusqu'à la vingt-quatrième heure (figure 2B, 2C).

5. Western Blot (WB) Analyse

  1. Homogénéiser le groupe de 10 ovocytes par allers et retours avec une pointe de micropipette, à 4 ° C dans 200 pi dans le tampon suivant: 50 mM Hepes, pH 7,4, NaCl 500 mM, 0,05% de SDS, 5 mM MgCl2, 1 mg / ml d'albumine de sérum bovin, 10 mg / ml de leupeptine, 10 mg / ml d'aprotinine, inhibiteur ml 10 mg / trypsine de soja, 10 mg / ml de benzamidine, 1 mM PMSF, vanadate de sodium 1 mM.
  2. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 10 000 x g pour éliminer les lipides (phase supérieure) et la membrane (phase inférieure) fractions. Recueillir la fraction cytoplasmique, stocker une partie aliquote pour déterminer la concentration de protéine et compléter avec le restant Laemmli ou un tampon d'échantillon de Bis-Tris (1: 1).
    Remarque: gels Bis-Tris et le tampon de charge ont un pH plus neutre qui protège les protéines de l'hydrolyse
  3. Chauffer 20 ug d'échantillon à 95 ° C pendant 10 min. Charger chaque échantillon dans les puits du gel d'acrylamide. Placer le gel dans un réservoir avec un tampon approprié.
  4. Effectuer une électrophorèse pendant 1 h à 200 V.
  5. Réaliser un WB dans du TBS à pH 8,0 (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween à 0,1%, contenant 10% d'albumine de sérum bovin) avec un anticorps de chèvre anti-Aurora A / Eg2 (1: 3 000, 2 h), ou avec un anti-lapin -Aurora A / Eg2-P (1: 1 000, O / N à 4 ° C), de souris anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), de chèvre anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 h ), de lapin anti-mos (1: 5000, 4 h), de lapin anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use anticorps de souris anti-V5 (1: 10.000, 2 h) et de lapin anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (comme contrôles de chargement).
  6. lavagela membrane 3 fois pendant 10 min dans du TBS-Tween et on incube 1 heure avec soit un anticorps anti-souris ou anti-lapin ou anti-chèvre (IgM) d'anticorps secondaire peroxydase de raifort marquée à des dilutions de 1: 5000, 1: 7500 et 1 : 5000 respectivement.
  7. Effectuez 3 lavages de 10 min dans du TBS-Tween et de détecter les complexes antigène-anticorps avec le système de détection avancée ECL.

6. Polyadénylation Assay

  1. Echantillon 5 ovocytes par état dans un 1,5 ml. Lavez-les avec 1 ml de PBS sans nucléase 1X (pH 7,4). Les étapes suivantes seront effectuées sous une hotte.
  2. Extraire l'ARN en utilisant une procédure organique classique (voir les instructions du fabricant).
  3. Récupérer l'ARN par centrifugation (10 000 xg) pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et l'ARN sécher à l'air pendant 10 min.
  4. ARN Resuspendre le culot dans 30 ul de sans nucléase H 2 O.
  5. Prenez 15 ul d'échantillons dans un nouveau tube et ajouter 85 ul de sans nucléase H 2 O. Nettoyez leéchantillons soi pour améliorer leur qualité sur colonne de silice le selon les instructions du fabricant. Éluer l'ARN en utilisant 30 pi de sans nucléase H 2 O
  6. Exécutez 1 pi d'échantillons avec 5 pi de tampon de charge sur un gel d'agarose à 0,8% pour vérifier l'intégrité de l'ARN.
  7. Déterminer la concentration d'ARN en utilisant un spectrophotomètre.
  8. Préparez 2 mélanges de ligation par la condition (c.-à-eIF4G1-WT, eIF4G1-DN et le H 2 O témoin) avec les réactifs suivants: 10 U d'ARN ligase, 0,1 volume de tampon 10X, 1 mM d'ATP, 10% de PEG8000 à 50% , 0,1 ug de l'amorce P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 et amener le volume final à 10 pi avec sans nucléase H 2 O. Ajouter dans le premier ARN obtenu à partir d'ovocytes mélange PG sans stimulation et dans le deuxième ARN mélange obtenu à partir des ovocytes PG stimulée.
  9. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C puis pendant 20 min à 65 ° C pour inactiver l'enzyme.
  10. NousEA ADNc transcription inverse (RT) kit. Préparer le mélange RT, par tube: 0,1 volume de tampon 10X RT, 0,1 pg de l'amorce P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, mélange 4 mM dNTP, 50 U de transcriptase inverse et avec sans nucléase H 2 O au volume final de 10 ul. Ajouter 10 ul de la réaction de ligature obtenu précédemment. Effectuez la RT dans les conditions décrites par le fabricant.
  11. Préparer la réaction en chaîne de la polymérase mélange (PCR), par tube: 0,1 volume de tampon 10X, 1,5 mM de MgCl2, 133 mélange uM de dNTP, 0,2 uM de l'amorce spécifique, 0,2 uM de l'amorce P2, 0,025 U de Taq polymerase, 1 pi de l'ADNc et avec sans nucléase de H 2 O à volume final de 50 ul. Effectuer la PCR dans les conditions suivantes: 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, [95 ° C pendant 1 min, 56 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 30 s] * 40 cycles, 72 ° C 9 pendant 10 min. Les amorces spécifiques sont les suivants: G MOS,B4 TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histone-like, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cycline B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
  12. Préparation d'un gel d'agarose à 3%. Ajouter dans chaque produits de PCR 10 pi de tampon de charge. Exécuter le gel avec 10 pi d'échantillons à 110 V pour une migration optimale. Analyse du gel au bout de 10 et 20 min pour observer un changement de taille reflétant la longueur de la queue poly (A) et donc la maturation de l'ARN qui est une condition préalable à leur traduction.

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Résultats

Cinétique de maturation des ovocytes de Xenopus et la détermination du pourcentage d'ovocytes GVBD après 24 h de stimulation PG (figures 2B, 2C):

Afin d'étudier les conséquences de translation de la mutation eIF4G1-DN, la réponse de PG dans des ovocytes de Xenopus laevis micro-injectés avec l'ARNc-DN eIF4G1 est comparée à eIF4G1-WT et à d'autres conditions de commande (H 2 O, GFP). Les contrôles permettent d'évaluer l'inci...

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Discussion

La traduction est un mécanisme impliqué dans la physiopathologie de nombreuses maladies humaines, y compris plusieurs maladies neurodégénératives. Par exemple, dans la maladie de Parkinson plusieurs rapports ont suggéré la déficience en translation associée à des mutations héréditaires 8,12,13.

Plusieurs modèles cellulaires sont disponibles pour étudier la traduction. Ici, dans le but d'étudier les conséquences d'une mutation de la traduction en eIF4G1 qui agit mutation do...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par une subvention de l’INSERM, Université de Lille 1, Université de Lille 2, Centre Hospitalier Régional de Lille (CHR de Lille). Le MCCH remercie la Fondation de France pour son soutien et tient à remercier l’IRCL, le Pr. Sonenberg pour le don des plasmides V5, le Dr Dissous (Institut Pasteur, Lille) pour le don d’anticorps anti-GFP, l’UMS 3387 (Université de Rennes) où sont achetés des ovocytes de xénope et le Dr Taymans (JPArc, Lille) pour la lecture critique du texte manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tricaïne, méthane sulfonateSandozMS-222manipulation des ovocytes
ForcepsMoriaDumont, MC40
Streptomycine/pénicilline,Sigma781
Pyruvate de sodiumSigmaP2256
Inhibiteur de la trypsine de sojaSigmaT9128
TétracyclineSigmaT7660
Fil Vicryl résorbable vétérinaireJohnson& Johson IntlJV1205
Collagénase ARoche diagnostics10103586001
PmeINew England BiolabsR0560SPréparation d’ARNm synthétique
DNAse/ARNn libre H2OLife Technologies10977
Acétate de sodiumMerck6268
Éthanol absoluSigma02854
Nano DropThermo Scientific
TBE 10XEppendorf0032006.507
Bromure d’éthidium 10 mg/mlLife Technologies15585-011
mMESSAGE mMACHINE KitAmbion by Life TechnologiesAM1344
MOPSSigmaM1254
EDTAFluka03609
AgaroseLife Technologies16500-500
Formaldéhyde 37 %Merck1.04003.1000
FormamideFluka47671
Gel Doc ImagerBiorad
Pipette d’ovocyte avec 100 capillaires en verre de 8"Drummond Scientific Company3-000-510-Xmicroinjection
Verre de remplacement 8Drummond Scientific Company3-000-210-G8
0.45 µ ; m filterMilliporeSLHA025NB
ProgestéroneSigmaP0130
HepesSigmaH3375Western Blot
NaClSigmaS5886
SDSBiorad161-0301
MgCl2SigmaA3294
Albumine sérique bovineSigmaA4612
leupeptineSigmaL8511
aprotinineSigmaA1153
benzamidineSigmaB6506
PMSFSigmaP7626
vanadate de sodiumSigmaS6508
Laemmli bufferBiorad161-0737
NuPAGE Novex 4-12 % Gels protéiques Bis-Tris, 1,0 mm, 15 puitsLife TechnologiesNP0323BOX
électrophorèse SDS-PAGE, mini-Protean TGXBiorad456-1036 et -1096
système de buvard semi-sec horizontalW.E.P. Compagny
GlycineBiorad161-0718
Tris-HClBiorad161-0719
Hybond ECL MembraneAmersham Life Science10401180
MéthanolVWR20846-292
Rouge Ponceau (0.5 %)SigmaP3504
Tween 20SigmaP2287
anti-GFPLife TechnologiesA11122
anti-V5Santa Cruz Biotechnologysc-58052
anti-Eg2Père Noël Cruz Biotechnologysc-27884
anti-Eg2-PCell SignalingC39D8
anti-ERK2Santa Cruz Biotechnologysc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)Santa Cruz Biotechnologysc-7976
anti-RskSanta Cruz Biotechnologysc-231
anti-mosSanta Cruz Biotechnologysc-86
anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort anti-sourisSanta Cruz Biotechnologysc-2005
peroxydase de raifort de lapinSanta Cruz Biotechnologysc-2812
peroxydase de raifort de chèvre marqué anticorps secondaireSanta Cruz Biotechnologysc-2378
Systèmede détection ECL avancéAmershan Life ScienceRPN2135
PBS 1xSigmaP4417polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)Qiagen79306
ChloroformSigma31998-8
IsopropanolSigma278475-1L
RNeasy mini kitQiagen74106
RTL buffer  ;Qiagen79216
RNAse free DNAse setQiagen79254
AmorcesEurogentec
T4 RNA ligase 1  ;New England BiolabsM0204S
Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacitéApplied Biosystems, Life Technologies4368813
Taq polymeraseLife Technologies10342020
, , , , , , , , , , " anticorps secondaire marqué à la

Références

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