Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Résumé

Nous avons développé une préparation génique-chimérique du circuit hippocampique ventral – accumbens in vitro qui permet l’imagerie directe en direct pour analyser les mécanismes présynaptiques de la transmission synaptique médiée par les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChR). Cette préparation fournit également une approche informative pour étudier les mécanismes pré- et post-synaptiques de la plasticité synaptique.

Résumé

L’amélioration soutenue de la signalisation axonale et l’augmentation de la libération de neurotransmetteurs par l’activation des récepteurs nicotiniques pré-synaptiques de l’acétylcholine (nAChRs) constituent un mécanisme important de la neuromodulation par l’acétylcholine (ACh). La difficulté d’accès pour sonder les mécanismes de signalisation à l’intérieur des axones intacts et des terminaisons nerveuses in vitro et in vivo a limité les progrès dans l’étude des composants pré-synaptiques de la plasticité synaptique. Ici, nous introduisons une préparation génique-chimérique du circuit hippocampique ventral (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro qui permet l’imagerie directe en direct pour analyser à la fois les composants pré- et post-synaptiques de la transmission tout en faisant varier sélectivement le profil génétique des neurones pré- vs post-synaptiques. Nous démontrons que les projections des microtranches vHipp, en tant qu’entrée axonale pré-synaptique, forment plusieurs synapses glutamatergiques fiables avec des cibles post-synaptiques, les neurones dispersés de nAcc. La localisation pré-synaptique de divers sous-types de nAChR est détectée et la transmission synaptique médiée par la signalisation nicotinique pré-synaptique est surveillée par enregistrement électrophysiologique simultané et imagerie de cellules vivantes. Cette préparation fournit également une approche informative pour étudier les mécanismes pré- et post-synaptiques de la plasticité synaptique glutamatergique in vitro.

Introduction

Modulation cholinergique du circuit excitabilité contribue à des aspects fondamentaux de la cognition, et la modulation cholinergique modifié est une caractéristique de neurodégénératives et neuropsychiatriques troubles y compris la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie ^1-4. Un mécanisme établi de la facilitation de la transmission synaptique cholinergique dans le SNC est via l'activation directe de nAChRs localisées sur des sites pré-synaptiques. L'activation de ces récepteurs pré-synaptiques entraîne une augmentation de Ca ²⁺ intracellulaire ([Ca2 ^+] _i) dans les terminaux présynaptiques - à la fois directement, en raison de la conductance de calcium relativement élevé de certains sous-types de nAChR, et indirectement, par l'intermédiaire de cascades de signalisation intracellulaires ^5, améliorant ainsi la libération de neurotransmetteurs. En effet, l'activation des nAChR pré-synaptiques a été liée à des changements dans la libération d'une grande variété de neurotransmetteurs, y compris le glutamate, GABA, acétylcholine, une dopamine ^6-10. Bien que ce processus a été étudié indirectement en utilisant des méthodes électrophysiologiques à divers synapses, les journalistes optiques de [Ca ^2+] _i et vésicule synaptique recyclage permettent de mesurer plus directe et temporellement précise des phénomènes pré-synaptiques.

Localisation pré-synaptique de nAChR a été démontré de façon convaincante direct étiquetage immuno-or de nAChRs au microscope électronique (EM) de niveau ^11,12. Plusieurs autres techniques ont également été utilisés pour traiter la localisation nAChR indirectement, y compris la détection de l'emplacement des chimères protéiques fluorescents de nAChR dans des neurones en culture ^13,14, enregistrement électrophysiologique des courants nAChR dans les terminaux synaptiques ^15,16, la surveillance des changements induits par la nicotine en [Ca ^2+] _i dans les terminaisons nerveuses synaptiques par imagerie de cellules vivantes ^17, et la surveillance indirecte de la libération des neurotransmetteurs à la terminaison synaptique partechniques d'imagerie cellulaire en direct avec des indicateurs fluorescents, y compris l'exocytose des vésicules synaptiques vus par les colorants de styryle amphipathiques FM (FM1-43 et FM4-64) et / ou synapto-pHluorin et par des journalistes de neurotransmetteurs fluorescentes spécifiques, tels que CNiFERs pour ACh et iGluSnFr pour le glutamate ^18-20. Globalement, ces approches actuelles pour identifier la localisation pré-synaptique de nAChRs sont complexes, et nécessitent des systèmes et des techniques spéciales pour permettre une identification fiable et surveillance physiologique de l'activité pré-synaptique.

Nous décrivons ici les protocoles et l'équipement pour un système de co-culture in vitro d'un hippocampe ventral (vHipp) - noyau accumbens (NACC) circuit qui offre un accès direct à identifier et analyser les deux composants pré et post-synaptiques de la transmission synaptique. Nous montrons des exemples de localisation pré-synaptique de nAChRs et l'imagerie des cellules vivantes de nAChR médiation Ca ²⁺ signalisation et de la libération de neurotransmetteurs aloaxones ng vHipp. Une extension naturelle (et simple) du protocole présenté ici est la préparation des contacts pré- et post-synaptiques constitués de neurones à partir de différents génotypes. De cette manière, la contribution d'un produit de gène particulier de la pré- et / ou post-synaptiques des mécanismes de modulation peut être évaluée directement.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n ° 80-23, révisé 2012) et des études ont été approuvés par Institutional Animal Care et à utiliser pour les comités de recherche à Stony Brook University (# 1618 et # 1792).

1. vHipp ANCC synaptiques Co-cultures

1. souris Sacrifice (jour postnatal 0 - 3, de type sauvage (WT) ou nAChRs α7 de ligne de souris transgénique) avec CO _2. Décapitez chaque chiot et enregistrer la queue dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse pour le génotypage post facto. Effectuez les étapes suivantes dans une hotte stérile.
2. Retirez le sommet du crâne avec des ciseaux et des pinces pour exposer l'ensemble du cerveau. À partir de la jonction où les cortex cérébraux partie caudale de l'autre, d'obtenir une section coronale qui contient les cortex postérieur dont la vHipp ^5,21 sous un microscope à dissection.
3. Disséquer vBandes de tissu Hipp contenant la région CA1-subiculum selon un cerveau de souris en développement atlas ²² (figure 1A). Transfert à une boîte de culture de 35 mm contenant des milieux de culture froid (4 ° C), les couper en petites tranches minces (environ 100 um x 100 um de microslices).
4. Pré-incuber 12 mm de poly-D-lysine / laminine lamelles de verre revêtu à l'intérieur 24 des plaques de culture de tissu avec un milieu de culture (~ 500 ul) pendant au moins 30 min à l'étuve à 37 ° C. Retirez le support avant l'étalement microslices.
5. Plaque avec une pipette Pasteur polie au feu au centre de la lamelle avec une quantité minimale de médias (~ 50 pi, contenant ~ 20 morceaux de microslices) pour faciliter la fixation des explants. Plate microslices vHipp provenant d'un seul animal (soit le + / + ou - / - génotype de la ligne de α7 transgénique) sur chaque lamelle.
6. Après les explants se déposent sur la lamelle, ajouter doucement les médias supplémentaires (~ 100 pi) par ee mur de sorte que le niveau des médias est suffisamment élevé pour couvrir complètement les explants sur la périphérie, mais pas ceux qui sont au centre de la lamelle.
7. Après un O / N incubation dans 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur, disperser neurones embryonnaires CNAC de jours 18 en jour 1 souris WT postnatales et ajouter à des explants.
   1. Disséquer les tissus CNAC selon un développement du cerveau de la souris atlas ²⁰ (figure 1B).
   2. Coupez-les en petits morceaux (environ 500 um x 500 um microslices) et transférer dans un tube de 15 ml.
   3. Traiter avec 0,25% de trypsine (2 ml) pendant 15 min à 37 ° C. Wash Les morceaux de tissus à trois reprises avec les médias de lavage à froid (5 ml, 4 ° C), suivie par un lavage dans des milieux de culture froide (5 ml, 4 ° C). Laisser la suspension reposer pendant 5 min dans chaque étape de lavage, puis versez le surnageant avec précaution.
   4. Dissocier les cellules par trituration ménagée dans 2 ml de milieux de culture avec une pipette Pasteur légèrement poli-le-feu.
   5. Transfer suspension cellulaire à un autre tube de 15 ml et on centrifuge à 2000 x rpm pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans des milieux de culture à 1 ml par 6 chiots. Disperser les cellules par pipetage dans les médias à plusieurs reprises avec une pipette Pasteur polie au feu.
   6. Ajouter 0,25 ml de cellules CNAC dispersées à chaque lamelle avec des explants vHipp.
   7. Maintenir les cultures dans une humidifié à 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Placez des plaques de culture sur des tampons de gaze stérile humide pour stabiliser mécaniquement et maintenir l'humidité, faciliter la formation des synapses.

2. Immunocytochemistry

1. Fixer cultures (5 - 7 jours in vitro) en paraformaldéhyde 4% / 4% de saccharose / PBS (~ 500 pi par lamelle, 20 min, RT).
2. Perméabiliser les cultures avec 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 ul par lamelle couvre-objet, 5 min, RT).
3. cultures de bloc avec 10% de sérum âne normale dans PBS (~ 500 pi par lamelle, 30 min, RT) avant Antibody coloration. Incuber avec des anticorps primaires O / N à 4 ° C. Utiliser les anticorps primaires suivants: anti-nAChR (α ₄ -ECD 1: 500; anti-sous-unités, α ₅ 1: 500), anti-glutamate transporteur vésiculaire 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
4. Laver les anticorps primaires avec du PBS (3 fois / ~ 500 ul par lamelle couvre-objet, 5 min) et ensuite incuber les cultures dans des anticorps secondaires conjugués à de l'Alexa 488 (~ 500 ul par une lamelle couvre-objet,: 500) ou Alexa 594 (~ 500 ul par lamelle couvre- , 1: 500) pendant 1 heure à 37 ° C.
5. Incuber les cultures à αBgTx conjugué à Alexa 594 (~ 500 ul par une lamelle couvre-objet,: 1000 dans du milieu de culture) pendant 45 min à 37 ° C avant la fixation pour le marquage surface α7 nAChR *.
6. Montage et de phoques lamelles.
7. Capturez des images avec un microscope à fluorescence équipé d'objectifs Plan-Apochromat (20X avec 0,8 NA ou 63X huile avec 1,4 NA) et une caméra CCD.

3. FM1-43 Based vésiculeuse Fusion

1. Maintenir cultures (5 - 7 jours in vitro) dans une chambre de l'imagerie, monter la chambre sur disque rotatif microscope confocal. Perfuser en continu (1 ml / min) avec HBS cocktail au RT.
2. Arrêtez perfusion et de charge cultures avec 10 uM FM1-43 dans 56 mM K ⁺ ACSF (~ 500 pi) pendant 90 secondes (coloration), laver colorant externe distance pendant 15 min avec Ca ²⁺ HBS gratuit contenant ADVASEP-7 (0,1 mM) pour piéger FM1-43 liée à la membrane.
3. Stimuler les cultures avec 56 mM K ⁺ ACSF (~ 500 pi) sans FM1-43 pendant 120 secondes (décoloration), rechargez cultures avec FM1-43 en utilisant les mêmes conditions, et lavez à nouveau avec Ca ²⁺ HBS gratuit contenant ADVASEP-7 pour 15 min.
4. Acquérir FM1-43 images de fluorescence avec disque rotatif microscope confocal équipé d'un objectif Plan-Apochromat (60X eau avec 1,4 NA, excitation 488 nm, émission 530 nm) et de capturer des images avec une caméra CCD.
5. Recueillir base d'images de fluorescence de FM1-43 (tous les 2 s pendant 1 min) Que le contrôle pré-nicotine; appliquer la nicotine (1 uM) par perfusion rapide (2 ml / min) pendant 1 min, puis laver la nicotine avec HBS cocktail. Gardez capture des images en accéléré avant, pendant, et après l'application de la nicotine toutes les 2 secondes pendant 5 min.
6. Quantifier FM1-43 intensité de fluorescence avant (F _{de coloration)} et après (F _{décoloration)} l'application de la nicotine à chaque bouton synaptique.
7. Calculer la quantité totale de fluorescence de FM1-43 amovible le long des axones vHipp en quantifiant la différence de FM1-43 intensité de fluorescence avant et après l'application de nicotine (AF = F -F _{coloration de décoloration).} Analyser fraction de la diminution de l'intensité de fluorescence après la nicotine avec l'équation suivante: F% = _diminution AF / F _coloration.

4. Imagerie de calcium

1. Rincer cultures (5 - 7 jours in vitro) rapidement avec HBS normale, puis charger cultures avec 5 uM Fluo-4 Ca ²⁺ indicateur (ester AM) et 0,02% de Pluronic F-127 dans du HBS (2 ml) pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Laver Fluo-4 solution avec HBS (3 fois / 5 min). Retour cultures dans l'incubateur (37 ° C / 5% CO ₂₎ pendant au moins 30 min.
3. Maintenir les cultures dans la même chambre de l'imagerie et les mêmes conditions que celles décrites dans FM1-43 section de fusion vésiculaire à base (voir l'étape 3.1).
4. Recueillir images Fluo-4 fluorescence des projections axonales des micro-tranches vHipp avec un objectif Plan-Apochromat (60X eau avec 1,4 NA, excitation 488 nm, émission 530 nm) et une caméra CCD.
5. Recueillir base Fluo-4 images de fluorescence (toutes les 10 sec pendant 2 min) que le contrôle pré-nicotine, appliquer la nicotine (1 uM) par perfusion rapide (2 ml / min) pendant 1 min, puis laver la nicotine avec HBS cocktail. Gardez capture des images en accéléré avant, pendant, et après l'application de la nicotine toutes les 10 secondes pendant 30 min.
6. Enregistrer tous les cadres des premières fluo-4 images de fluorescence, l'exportation comme une série deLes images au format TIFF pour pousser l'analyse.
7. Recueillir l'intensité intégrée de fluo-4 fluorescence le long des axones vHipp avant et après l'application de la nicotine.
8. Normaliser l'intensité de fluorescence intégrée avec l'équation suivante: AF / F ₀ = (FF ₀₎ / F _0, où F ₀ est la pré-nicotine intensité de fluorescence intégrée de fond corrigé et F est l'intensité de fluorescence intégrée le long des axones vHipp à chaque point de temps après l'application de la nicotine. Analyser et tracer l'intensité de fluorescence intégrée normalisée.

Résultats

La préparation employée se compose de gènes chimère co-cultures de circuits vHipp ANCC in vitro. Projections émanant microslices vHipp, comme entrée axonale pré-synaptique, peuvent faire des contacts synaptiques avec les objectifs post-synaptiques, les neurones dispersés du CNAC. La nicotine induit une (≥ 30 min) la facilitation de la transmission glutamatergique soutenue à partir de neurones CNAC innervés par vHipp axones ²¹ et prolongée calcium signalisation le long des axones vHipp ⁵ vi...

Discussion

La préparation de co-culture décrit re-capitule circuits de l'hippocampe-accumbens ventrales in vitro. Cet examen permet de préparation relativement simple et fiable des profils spatiaux et temporels qui activation des nAChR pré-synaptiques susciter améliorée transmission glutamatergique ^{5, 21.}

Co-cultures sont définis comme la croissance de différents types de cellules spécifiques dans un plat qui peut fournir des conditions physiologiques in vitro pour démo...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1. Milieux de culture (50 ml)
Neurobasal  ;	GIBCO	10888022	48 ml
Suppléments de B-27	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Pénicilline-Streptomycine	GIBCO	10908-010	0,5 ml
Supplément de GlutaMAX	GIBCO	35050-061	0,5 ml
Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. Milieu de lavage (HBSS, 100 ml)
HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3. SALINE tamponnée HEPES  ; (HBS)  ;   ; pH = 7,3
NaCl	Sigma	S9888  ;	135 millions d’euros
KCl	Sigma	P9333² ;	5 millions d’euros
MgCl2	Sigma	M8266  ;	1 million d’euros
CaCl2,Sigma		C1016  ;	2 millions d’euros
HEPES	Sigma	H3375  ;	10 millions d’euros
Glucose	Sigma	G0350500	10 millions d’euros
4. HBS Cocktail pour l’imagerie en direct pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888  ;	135 millions d’euros
KCl	Sigma	P9333² ;	5 millions d’euros
MgCl2	Sigma	M8266  ;	1 million d’euros
CaCl2,Sigma		C1016  ;	2 millions d’euros
HEPES	Sigma	H3375  ;	10 millions d’euros
Glucose	Sigma	G0350500	10 millions d’euros
tétrodotoxine  ;	Tocris	1078	2 & micro ; M
bicuculline	Tocris	131	10 & micro ; M
D-AP-5	Tocris	105	50 & micro ; M
CNQX	Tocris	1045	20 & micro ; M
LY341495	Tocris	1209	10 & micro ; M
5. Sans calcium  ; HBS  ;   ; pH = 7,3
NaCl	Sigma	S9888  ;	135 millions d’euros
KCl	Sigma	P9333² ;	5 millions d’euros
MgCl2	Sigma	M8266  ;	1 million d’euros
HEPES	Sigma	H3375  ;	10 millions d’euros
Glucose	Sigma	G0350500	10 millions d’euros
6.56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 millions d’euros