Système de Gel concentrique à étudier le rôle biophysique de Matrix microenvironnement sur 3D migration cellulaire

Résumé

Les propriétés mécaniques et la microstructure de la matrice extracellulaire affectent fortement la migration de cellules 3D. Une méthode in vitro pour étudier le comportement de migration cellulaire spatio-temporelle dans des environnements biophysique variables, à des niveaux de cellules individuelles à la fois la population et, est décrit.

Résumé

La capacité des cellules à migrer est crucial dans une grande variété de fonctions cellulaires long de la vie de développement embryonnaire et la cicatrisation des plaies de la tumeur et les métastases du cancer. Malgré les efforts de recherche intenses, les principes biochimiques et biophysiques de base de la migration des cellules ne sont pas encore entièrement compris, en particulier dans les micro-environnements (3D) en trois dimensions physiologiquement pertinents. Ici, nous décrivons un essai in vitro destiné à permettre l'examen quantitatif de 3D ​​comportements de migration cellulaire. Le procédé exploite la capacité et mechanosensing propension de la cellule à migrer dans la matrice extracellulaire précédemment inoccupé (ECM). Nous utilisons l'invasion des cellules cancéreuses du sein hautement invasives, MDA-MB-231, dans des gels de collagène en tant que système modèle. La propagation de la population de cellules et de la dynamique de migration des cellules individuelles pendant des semaines de la culture peuvent être surveillés en utilisant l'imagerie des cellules vivantes et analysées pour extraire des données spatio-temporellement résolues. En outre, La méthode est facilement adaptable pour diverses matrices extracellulaires, offrant ainsi un moyen simple mais puissant pour étudier le rôle de facteurs biophysiques dans le microenvironnement sur la migration cellulaire.

Introduction

Migration de cellules joue un rôle clé dans diverses réponses physiologiques tels que le développement embryonnaire, l'hémostase et la réponse immunitaire ainsi que dans les processus pathologiques tels que les maladies vasculaires, l'inflammation et le cancer ^1. Disséquer les facteurs biochimiques et biophysiques sous-jacentes migration cellulaire est donc fondamentalement important non seulement de comprendre les principes de base des fonctions cellulaires, mais aussi pour faire avancer diverses applications biomédicales, comme dans l'ingénierie tissulaire, anti-métastases et le développement médicament anti-inflammatoire. Depuis l'observ....

Protocole

1. Cellule récolte

1. Obtenir MD-MBA-231 cellules provenant de la 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Détacher les cellules de tissus plaque de culture à l'aide de 0,5% de solution de trypsine-EDTA. Utiliser 1 ml de solution de trypsine-EDTA pour la cellule en culture dans un flacon T25.
2. cellules de granules dans un tube de 15 ml conique par centrifugation à 200 g pendant 4 min, aspirer le surnageant et remettre les cellules dans 5 ml de milieu de culture.
3. Compter densité cellulaire, ρ, en utilisant un hémocytomètre.
   Remarque: Pour préparer le gel interne cellule graines, la suspension cellulaire sera par la suite....

Résultats

L'analyse sur gel concentrique présenté ici a été réalisée en utilisant des cellules de cancer du sein hautement invasives, MDA-MB-231, avec 2,4 mg / ml de gel de collagène interne et une densité d'ensemencement de cellules de = 2 × 10 ⁶ cellules / ml, par exemple. Comme le montre la figure 2, généralement après quelques jours de culture, les cellules ont violé l'interface de gel interne-externe et ont commencé à envahir le gel extérieure. La population de cellules se étend princi.......

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons un essai in vitro pour étudier le comportement migratoire 3D de cellules dans des environnements matriciels qui ressemblent topologiquement aux ECM rencontrées in vivo. Il y a trois points forts principaux de ce test par rapport aux autres méthodes actuellement disponibles. Tout d’abord, ce test permet d’examiner simultanément les mécanismes de migration cellulaire au niveau de la population et au niveau des cellules individuelles. Cela ouvre des possibilités d’étudier .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur de culture cellulaire	Fisher Scientific Pte Ltd	Modèle : 371, S/No 318854-6055
Microscope confocal	Nikon A1R		Microscope confocal à balayage laser inversé équipé d’une chambre d’incubation
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Sérum de veau fœtal (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescent CellTracker colorant CMTMR	Life Technologies	C2927
Boîte à fond en verre	IWAKI Cell Biology	3931-035	Boîte de 35 mm de diamètre avec puits à fond en verre de 12 mm de diamètre
Hémocytomètre	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
PH-mètre à microprocesseur	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagène	Advanced BioMatrix	#5010-D	Collagène bovin solubilisé dans l’acide de type I (pH d’origine ~ 2)
Objectif	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Pénicilline-Streptomycine	Life Technologies	15140-122
PH-mètre	Sartorius	S/No 29153352	PH-mètre basique PB-11
Trypsine-EDTA	Life Technologies	15400-054