Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

Résumé

Un nouveau protocole d’imagerie a été développé à l’aide d’un actionneur mécanique motorisé personnalisé pour permettre la mesure des réponses en temps réel à la déformation mécanique dans les cellules vivantes. Pertinent pour la mécanobiologie, le système peut appliquer des contraintes allant jusqu’à 20 % tout en permettant une imagerie en temps quasi réel avec la microscopie confocale ou à force atomique.

Résumé

Il y a actuellement un intérêt significatif à comprendre comment les cellules et les tissus réagissent aux stimuli mécaniques, mais les approches actuelles sont limitées dans leur capacité à mesurer les réponses en temps réel dans des cellules vivantes ou des tissus viables. Un protocole a été mis au point à l’aide d’un actionneur cellulaire pour distendre les cellules vivantes cultivées sur un substrat élastique ou les tissus attachés à celui-ci lors de l’imagerie par microscopie confocale et à force atomique (AFM). Des études préliminaires montrent que l’étirement tonique des cellules épithéliales bronchiques humaines a provoqué une augmentation significative de la production de superoxyde mitochondrial. De plus, à l’aide de ce protocole, les cellules épithéliales alvéolaires ont été étirées et imagées, ce qui a montré des dommages directs aux cellules épithéliales par une surdistension simulant une forme de lésion pulmonaire in vitro. Un protocole pour effectuer une nano-indentation AFM sur des cellules étirées est également fourni.

Introduction

Les cellules sont soumises à des contraintes mécaniques dans de nombreux tissus, et cette stimulation mécanique a été montré pour promouvoir des changements dans les profils d'expression de gène, la libération de facteurs de croissance, des cytokines, ou le remodelage de la matrice extracellulaire et du cytosquelette ^4.1. Les signaux intracellulaires transduction de ces stimuli mécaniques se produisent à travers le processus de mécanotransduction ^5-7. Dans le système respiratoire, une issue de mécanotransduction est l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et ^8,9 cytokines pro-inflammatoires dans ¹⁰ les cellules epitheliales pulmonaires en présence de contrainte de traction cyclique. Des preuves solides suggère également que la contrainte de tension excessive conduit à diriger un dommage à l'épithélium alvéolaire, en plus des réactions biochimiques de cellules ^11-14. Bien que l'accent est mis ici principalement sur la réponse des cellules pulmonaires à la déformation mécanique, voies induites par mécanotransduction jouent un rôle clé dans les basic fonction de nombreux tissus dans le corps humain, y compris la régulation du tonus vasculaire ¹⁵ et le développement de la plaque de croissance ^16.

L'intérêt croissant pour mécanotransduction a donné lieu à la mise au point de nombreux dispositifs pour l'application de contraintes mécaniques physiologiquement pertinentes à des cellules en culture et des tissus. En particulier, les dispositifs en appliquant une contrainte de traction, qui est une forme courante de chargement mécanique subi par le tissu, sont populaires ^11,17-19. Cependant, de nombreux dispositifs disponibles sont soit conçu comme un bioréacteur pour les applications d'ingénierie tissulaire ou ne sont pas propices à une véritable imagerie de temps avec étirement. En tant que tel, il est nécessaire de développer des outils et des méthodes qui permettent de visualiser les cellules et les tissus en tension pour faciliter l'étude des voies de transduction mécanique.

Ici, un dispositif d'étirement mécanique dans le plan a été conçu et protocoles ont été élaborés pour appliquer multiples formes de la souche de tissus et de cellules, tout en permettant l'imagerie des réponses biochimiques et mécaniques en temps réel (figure 1A-D). Le dispositif utilise six pinces régulièrement espacées disposées circonférentiellement pour saisir une membrane flexible et d'appliquer une dans le plan, une distension radiale jusqu'à environ 20% (figure 1B). Le dispositif d'actionnement peut être placé dans un incubateur de culture cellulaire pendant une période prolongée de temps, tandis que le moteur (Figure 1C) est placée à l'extérieur de l'incubateur et contrôlé par un logiciel propriétaire fourni par le fournisseur du moteur. Le moteur est connecté à un conducteur linéaire, ce qui fait tourner une came interne, entraînant les six pinces Châssis uniformément en tension et de détente.

En plus du dispositif mécanique, les membranes flexibles personnalisés ont été créés à partir de culture disponibles dans le commerce des membranes de cellules prêtes à être utilisé dans le système mécanique. Ensuite, les parois circulaires (avec un diamètre d'environ28 mm) ont été faites sur et fixé à la membrane souple de sorte que les cellules peuvent être cultivées seulement dans cette région de bien décrit le profil de contrainte. Afin de déterminer si le placement de ces membranes dans le dispositif d'actionnement de fournir souche uniforme et isotrope dans le centre de la membrane flexible, l'analyse d'éléments finis a été réalisée en utilisant un logiciel disponible dans le commerce (figure 1E-F). La membrane flexible a été modélisée avec des conditions aux limites symétriques et en utilisant tous les éléments quadrilatères pour la maille. Les anneaux concentriques vu dans le tracé de contour de la souche maximum principal illustré à la figure 1F indiquent la distribution isotrope de la souche.

La souche subie par la membrane a été mesurée en enregistrant des images des repères à travers chargement (figure 2). La figure 2D montre que la souche de membrane moyenne mesurée dans les directions radiale et axiale est approximativement linéaireen ce qui concerne le moteur appliqué compte jusqu'à une déformation linéaire maximum de 20%. Il n'y avait aucune différence significative entre les niveaux de déformation mesurées pendant la distension par rapport à celles mesurées pendant la rétraction à la position de repos. Ensuite, le déplacement de cellules epitheliales bronchiques humaines (16HBE) et de leurs noyaux de culture sur la membrane souple sur mesure ont été mesurées. Marqué par fluorescence (DAPI) noyaux des cellules ont été imagées 16HBE en utilisant un objectif 20X sous un microscope confocal, alors que le déplacement de la cellule entière a été mesuré à l'aide des images à contraste de phase enregistrées avec un microscope numérique. Comme on le voit sur ​​la figure 3, la déformation mesurée par déplacement des noyaux était similaire à celle mesurée par déplacement de marquage sur la membrane, jusqu'à environ 20% de déformation linéaire. Cela confirme que la contrainte appliquée aux membranes a été transmis aux cellules adhérentes. Les protocoles décrivant l'utilisation de l'appareil de mesure sur un microscope traditionnelle et un microscop à force atomiquee sont fournies dans les étapes suivantes.

Protocole

1. Construction de la membrane avec le bien Murs pour la rétention de Cell Culture, des Médias (voir la figure 1D pour le produit final)

1. Utilisation de polydiméthylsiloxane (PDMS) tôles revêtues avec collagène I, découper le contour de la membrane flexible avec un scalpel ou une filière.
2. Placez chaque membrane dans une boîte de 60 mm de Pétri pour le stockage.
3. Création de murs:
   1. Mélanger PDMS à un ratio de 10: 1 en poids d'élastomère élastomère A à B (durcisseur).
   2. Verser 5 ml de PDMS entièrement mixtes en tubes de 50 ml.
   3. Passer tubes de 50 ml avec PDMS non durcies à l'horizontale dans un four à hybridation.
   4. Utiliser la fonction de rotor pour revêtir les parois intérieures des tubes à huit tours par minute pendant le temps de durcissement. A température ambiante, le PDMS seront entièrement durcies dans les 2 jours.
   5. Retirer les PDMS à partir du tube dans une hotte de culture cellulaire stérile.
   6. Utilisation d'une nouvelle lame de rasoir, partitionner le cylindre de PDMS en sections de 4 mm de hauteur.
   7. Placez les sections, qui serviront de wa membranells, dans un plat contenant Petri sans permettre les murs pour se froisser.
4. Sélectionnez et le centre d'un mur de PDMS sur une membrane, tout en maintenant les deux dans la boîte de Pétri.
5. Placez délicatement PDMS non durcis (10: 1 ratio) sur le périmètre extérieur de la paroi pour être utilisés comme de la colle. Eviter la formation de lacunes entre le mur et la membrane, car il est là pour retenir le liquide.
6. Placer chaque boîte de Pétri contenant la membrane rempli et recouvert dans un four à 70 ° C pendant 24 heures pour durcir.

2. Corrélation des rotations moteur avec Clamp déplacement ou Radial croissance pour l'étalonnage (Figure 2)

1. Démarrez le logiciel de commande du moteur.
2. Déplacer les mâchoires de l'appareil à l'aide du réglage manuel dans le logiciel de moteur.
3. Mesurez la distance et enregistrer la position de comptage du moteur entre des pinces opposées à la fois le déplacement minimum et maximum des pinces.
4. Calculer le changement de pour cent dans la distance entre les pinces en fonction du comptage de moteur (~ 0-75k des chiffres). Cela indiquera la souche potentielle maximale atteinte sur la membrane.

3. Application du Plan sur la souris des cellules épithéliales du poumon Ligne (MLE12)

1. Seed MLE12 cellules à 2,5 millions de cellules sur la membrane souple (étape 1) par puits à être confluentes dans les deux jours. La densité d'ensemencement peut varier pour différents types de cellules.
2. Assurez-vous que l'actionneur mécanique est dans une position complètement détendue.
   1. Retirer milieux de culture cellulaire.
   2. Utilisation de 1,5 mm poinçons de biopsie, punch deux trous dans chacune des six pince (voir figure 1D) onglets de la membrane. Le positionnement radial des trous détermine la quantité de pré-tension de l'expérience de la membrane initialement. Percez les trous dans un rayon de 20,5 mm sur les onglets de la membrane si aucune pré-tension est souhaitée.
   3. Placer la membrane sur la civière avec les trous perforés alignant avec les broches à l'intérieur des pinces.Placez pinces supérieures en place. Serrer les vis une par une alternance côtés.
   4. Ajouter 1 ml de milieu de culture cellulaire.
3. Placer l'appareil sur la platine du microscope de centrage au milieu de la membrane avec le trajet de la lumière.
4. Utilisez du ruban adhésif ou des aimants (si possible) pour fixer le dispositif à la scène. Une fois fixé, le contrôle de l'en-plan (parallèle à la membrane) et verticale (direction z) du dispositif mécanique avec le contrôleur de platine du microscope.
5. Appliquer tronçon avec le logiciel fourni par le fabricant en commandant manuellement la position et la vitesse de rotation du moteur ^20.

4. Mesure de mitochondriales Reactive Oxygen Species (ROS)

1. Une fois que les cellules sont confluentes, ajouter 2.1 ml de DMEM avec indicateur RT superoxyde mitochondrial (5 uM de concentration finale) directement sur les cellules.
2. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
3. Laver les cellules doucement trois fois avec un tampon réchauffé dans un bain d'eau pour37 ° C.
4. Immédiatement placer la membrane flexible sur la civière (Étape 2.2) déjà en place en vertu d'un microscope confocal verticale.
5. Ajouter 1 ml de DMEM avec du milieu sans rouge de phénol et 25 mM de HEPES.
6. Définir des filtres d'excitation / émission de 510/580 nm.
7. Plusieurs champs image toutes les 15 min pour créer l'évolution temporelle souhaitée de la production de superoxyde mitochondrial.
8. A partir d'images capturées, l'intensité de fluorescence fiche histogrammes à chaque intervalle de temps en utilisant un logiciel capable de quantifier l'intensité de fluorescence.

5. Application de stretch et de microscopie à force atomique (AFM)

Remarque: Ces étapes sont prévues pour un AFM spécifique et la combinaison de microscope optique (Figure 4 et liste des matières).

1. Préparer l'AFM pour l'expérience.
   1. Augmentation de la hauteur de la tête AFM à sa position maximale dans la direction z.
   2. Mettre diluants sur les jambes de l'AFM àsoulever l'avion à laquelle AFM contacts en porte à faux de l'échantillon. L'échantillon et la tête AFM doit être soulevé pour accueillir la hauteur du dispositif mécanique.
2. Préparer le microscope optique (si disponible).
   1. Retirer la plaque du scanner de l'AFM. Retirer l'objectif souhaité.
   2. Ajouter une entretoise à l'objectif. La hauteur de l'entretoise dépendrait de l'objectif et l'AFM spécifique set-up, mais il est nécessaire si l'imagerie optique est souhaitée depuis plan d'observation sera changement dans la direction z par un montant égal à la civière et la hauteur de l'adaptateur (Figure 5A). Notez que l'AFM fournit habituellement l'imagerie à faible grossissement d'un chemin optique au-dessus du dispositif.
   3. Montez le dos objectif souhaité dans son emplacement. Placez le scanner à l'AFM.
   4. Démarrez le logiciel de l'AFM. Lancer toutes les sources de lumière nécessaires, y compris la source de lumière pour les mesures de fluorescence.
   5. Monter une puce avec un faisceau cantileverest approprié pour les mesures souhaitées. 200 PN / rigidité nm ou moins est préférable lorsque l'on mesure le module d'élasticité de cellules vivantes.
   6. Aligner le laser et calibrer la rigidité en porte à faux selon les suggestions du fabricant sur une lamelle de verre monté sur le dispositif.
3. Préparer une membrane comme dans l'étape 1, mais avec les modifications suivantes.
   1. Immédiatement avant le montage de la membrane sur le dispositif d'étirement, couper les murs à environ 1 mm de hauteur. Ceci permet d'éviter les interférences entre les parois connu de membrane et la cellule de charge.
   2. Monter la membrane sur le dispositif mécanique comme décrit 3.2.1-3.2.3.
   3. Retirez le support de culture cellulaire pour éviter d'endommager le scanner de l'AFM en cas de déversement.
   4. Couple l'appareil avec un adaptateur (figure 5A). Placez le dispositif mécanique avec l'adaptateur sur le scanner.
   5. Étirer la membrane au niveau de la contrainte de traction désirée.
4. Nano-indentation des cellules étirées.
   1. Ajouter un limité (<0,5 ml) du volume des médias sur les cellules pour éviter scanner AFM ou des dommages en raison d'un microscope déversement.
   2. Engager la poutre en porte à faux avec la membrane.
   3. Suivez le protocole de l'appareil de l'AFM particulière à balayer des zones d'intérêt.

Résultats

Reactive Oxygen Species et Déformation

Des études antérieures ont démontré une augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les voies aériennes et les cellules épithéliales alvéolaires en réponse à l'étirement cyclique ^21. Les espèces réactives de l'oxygène comprennent des molécules et de radicaux libres dérivés de l'oxygène moléculaire avec une haute réactivité pour les lipides, les protéines, les polysaccharides et les acides nucléiques ^{de 22 à 24.}

Discussion

Un dispositif unique pour l'imagerie de cellules vivantes au cours stretch mécanique a été développé; et ce dispositif a été utilisé dans un protocole d'étudier épithéliale du poumon cellule mécanobiologie. Dans des études préliminaires, on a constaté que seul un tronçon tenue stimulé la production de superoxyde mitochondriale dans les cellules épithéliales bronchiques. En outre, il a été démontré que l'augmentation des niveaux de contrainte mécanique causé des dommages directs à l'intégrité d'une mo...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SmartMotor NEMA 34 : Série 3400	MOOG Animatics	SM3416D	Moteur intégré, contrôleur, amplificateur, codeur et bus de communication
Membrane Flexcell (revêtement Collagen I)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5"  ; x  ; 5.25"  ; x  ; 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342  ;	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI
coloration MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389  ;	Marquage du superoxyde mitochondrial
Inhibiteur de superoxyde	DMEM
FBS
Tubes de 50 ml	Fisher Scientific	06-443-19	N’importe quel tube de centriguge peut être utilisé pour créer une zone d’imagerie.
Four d’hybridation	Bellco Glass
MLE12 Cellules	ATCC	CRL-2110	Cellules épithéliales pulmonaires de souris  ;
16Cellules	HBE ATCC	CRL-2741	Cellules épithéliales bronchiques humaines
AFM Indentation ExperimentsCantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30 AFM  ;
	Asylum Research	MFP3D
Microscope Olympus	Olympus	IX-71	Microscope inversé avec objectifs 20X et 40X.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Non disponible	Microscope
Finite Elements Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Initialement une entreprise autonome, aujourd’hui détenue par Life Technologies.
Microscope confocal	Zeiss	LSM 710	Microscope droit à 2 photons