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Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine

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DOI :

10.3791/52752

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30 mai 2015

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1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

Dans cet article

Résumé

Un ELISA offrant une nouvelle approche quantitative est décrit. Il détecte spécifiquement l'α-synucléine associée à la maladie (αSD) dans un modèle de souris transgénique (M83) de synucléinopathie en utilisant plusieurs anticorps contre la forme αS phosphorylée sur la Ser129 ou la partie C-terminale de la protéine.

Résumé

En plus des méthodes établies comme Western blot, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour quantifier rapidement et facilement associé à une maladie α-synucléine (aS D) dans des modèles expérimentaux de synucléopathies. Une lignée de souris transgéniques (M83) sur-exprimant les aS de A53T humaines et développer spontanément un phénotype clinique dramatique entre huit et 22 mois d'âge, caractérisées par des symptômes tels que la perte de poids, une prostration, et sévère déficience motrice, a été utilisé dans cette étude. Pour les analyses moléculaires de aS D (aS associée à la maladie) chez ces souris, un test ELISA a été conçu pour quantifier spécifiquement aS D chez des souris malades. L'analyse du système nerveux central dans ce modèle de souris a montré la présence de D aS principalement dans les régions du cerveau et caudale de la moelle épinière. Il n'y avait pas de différences dans la distribution aS D entre différentes conditions expérimentales conduisant à la maladie clinique, à savoir, dans uninoculATED et le vieillissement normalement souris transgéniques et des souris inoculées avec des extraits de cerveau de souris malades. La détection spécifique de aS D immunoréactivité en utilisant un anticorps contre Ser129 phosphorylé aS par ELISA essentiellement en corrélation avec celle obtenue par transfert de Western et immunohistochimie. De façon inattendue, des résultats similaires ont été observés avec d'autres anticorps dirigés contre la partie C-terminale de aS. La propagation de aS D, suggérant l'implication d'un mécanisme de «prion-like", peut donc être facilement contrôlée et quantifiée dans ce modèle de souris en utilisant une approche ELISA.

Introduction

La plupart des méthodes actuelles pour détecter l'α-synucléine associée à la maladie (αSD) dans les modèles expérimentaux de la maladie de Parkinson (MP), telles que l'immunohistochimie ou le Western blot, sont longues et non quantitatives. Cette maladie neurodégénérative est caractérisée par l'agrégation d'alpha-synucléine principalement sous forme d'inclusions contenant une forme agrégée de la protéine présynaptique normalement soluble αS1,2 (corps de Lewy et neurites de Lewy). Normalement seulement marginalement phosphorylée, αS est hyperphosphorylée à sa sérine 129 résiduelle dans ces inclusions3 et peut être surveillée par des anticorps spécifiquement dirigés contre αS phosphorylée sur Ser129, fournissant ainsi un marqueur fiable de la pathologie.

Des recherches récentes suggèrent qu'un mécanisme « prion-like » pourrait être impliqué dans la propagation de l'agrégation αS au sein du système nerveux d'un patient atteint4,5. Ces études ont rapporté l'accélération d'une synucléinopathie par inoculation d'extraits de cerveau contenant αSD dans un modèle de souris transgénique (M83) exprimant une protéine αS humaine mutée A53T associée à un handicap moteur sévère survenant à mesure que les souris vieillissent6. De la même manière, l'inoculation intracérébrale d'αS recombinante agrégée dans le même modèle de souris M83 a confirmé l'accélération de l'agrégation5. L'induction de dépôts d'αS phosphorylée a également été rapportée après inoculation de souris C57Bl/6 de type sauvage avec soit αS recombinante fibrillaire, soit des extraits de cerveau de patients DLB humains7,8. Sacino et al.9 ont récemment souligné qu'après injection d'αS humaine fibrillaire, une formation d'inclusions cérébrales αS généralisée et progressive pouvait être induite chez les souris M83, mais pas chez les souris transgéniques E46K ou les souris non transgéniques chez lesquelles les inclusions αS induites étaient transitoires, et principalement limitées au site d'injection. Des études récentes sur des singes ont confirmé la propagation des agrégats αS après inoculation d'extraits dérivés de MP chez des espèces plus proches de l'humain10.

Le lien entre les altérations αS et la maladie de Parkinson suggère que αSD est un biomarqueur potentiel de la maladie de Parkinson11. Une étude récente a montré la détection d'agrégats solubles oligomériques d'α-synucléine dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le plasma humain comme biomarqueur potentiel de la maladie de Parkinson basé sur un système ELISA sandwich conventionnel utilisant le même anticorps pour capturer et détecter αS12. Basé sur la même méthode, des protéines multimériques ont été reconnues dans des échantillons biologiques, y compris le cerveau, car il y a plusieurs copies d'épitopes présentes dans les formes assemblées13. Très récemment, αS pathologique dans le LCR de patients avec une pathologie corpos de Lewy prouvée a été détecté à l'aide à la fois d'un kit ELISA avec un anticorps hautement spécifique contre αSD (5G4) et d'un dosage d'immunoprécipitation14. Ces méthodes pourraient différencier les patients atteints de MP/DLB des autres types de démences.

La propagation « prion-like » de l'agrégation αS a été étudiée plus en détail dans le modèle de souris transgénique M83 en utilisant une approche ELISA conçue pour identifier spécifiquement αSD15. Dans cette étude, nous rapportons le protocole ELISA détaillé utilisé pour détecter quantitativement αSD chez les souris malades (inoculées ou non avec αSD provenant de souris M83 malades) et plus particulièrement dans les régions cérébrales spécifiquement ciblées par le processus pathologique dans ce modèle de souris transgénique M834.

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Protocole

Toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux ont été conformément à la directive CE 86/609 / CEE du Conseil et ratifiée par Cometh, le comité national français pour l'examen de l'éthique dans l'expérimentation animale (protocole 11-0043). Les animaux ont été logés et soignés dans l'Anses approuvé d'installations expérimentales à Lyon (approbation B 69387 0801).

1. Préparation des souris

  1. Euthanasier souris par une injection intraperitoneale de dose létale de pentobarbital de sodium.
  2. Récupérer l'ensemble du cerveau de crâne de la souris et le placer dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm sur la glace jusqu'à l'extraction.
  3. Extraire la moelle épinière cervicale.
    REMARQUE: aS d'extrait soit à partir de l'une des moitiés du cerveau après sectionnement sagittal ou de cerveaux de souris disséquées, disponible après les expériences énumérées dans le tableau 1.
Experiment Souris
Inoculum (cerveau équivalent) 		Période de survie
(Dpi) 		Median / survie maximale
(vieux jours) 		aS détection de d par ELISA
/ WB / IHC
1 Souris inoculées 441 ± 166 419/736 8/8
2 Souris inoculées (0,2 mg) 150 ± 52 140/241 9/9

Tableau 1. Liste des expériences réalisées sur des souris M83. Les inoculations ont été réalisées à 6 semaines pour l'expérience 2 dans la zone de striato-corticale avec 20 ul d'un homogénat de cerveau de souris malade (1% poids / volume dans du glucose 5%), à la suite anesthésie de six semaines vieilles souris M83 homozygotes de 3% inhalation isoflurane. dpi: jours après inoculation.

2. aS Extraction de Brain moitiés

  1. Sagittalement coupé le cerveau pour obtenir deux moitiés. Peser chaque moitié dans un tube contenant ribolysis boulets de broyage.
  2. Préparer High Salt (HS) un tampon contenant 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% phosphatase et inhibiteurs de protéase cocktails. Ajouter tampon sel élevée aux moitiés du cerveau pour obtenir 20% (poids / volume) homogénats.
  3. Préparer les échantillons provenant des moitiés du cerveau à l'aide d'un homogénéiseur mécanique à 6,0 m / s pendant 23 sec deux fois. Après la première homogénéisation de 23 sec, placer les tubes contenant les homogénats sur de la glace pendant 2 minutes avant le second cycle de 23 sec.
  4. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 5 min pour éliminer les fragments de cerveau non broyées. Récupérer les surnageants, diviser en 200 aliquotes et les conserver à -80 ° C pour analyse ultérieure ELISA.

3. aS Extraction de disséqués régions cérébrales

  1. Disséquer unensemble du cerveau dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm sur la glace avec une loupe de faible puissance (8X grossissement) en utilisant deux forcipes dont les extrémités sont maintenues ensemble sauf lorsque disséquer l'hippocampe. Ne pas dépasser 10 min pour préserver l'intégrité du cerveau. Placez le côté droit du cerveau et récupérer les régions du cerveau suivants dans cet ordre:
    1. Séparé des deux bulbes olfactifs aide de pinces placées juste derrière l'ampoule. Détacher du cerveau par un mouvement vers le bas. Répétez cette opération pour la deuxième ampoule.
    2. Caler doucement la pince entre les deux cortex et le déplacer vers l'avant pour faciliter la dissociation des deux cortex. Garder le cerveau en place avec une pince, utiliser un autre pour séparer le cortex de l'hippocampe.
    3. Placez la pince 2 mm en dessous du cortex. Maintenir une légère pression sur la pince jusqu'à ce que le haut de l'hippocampe est visible. Décoller la première partie du cortex, et répéter avec la deuxième partie. Utilisez la pince pour séparer les deux cortexà partir de l'hippocampe et le déplacement vers l'avant du cerveau.
    4. Placez la pince ouverte autour de l'un des hippocampes. Fermez la pince au bas de l'hippocampe, puis retirez-le délicatement, récupérer autant que possible. Répétez la procédure pour la deuxième hippocampe.
    5. Positionner les pinces ouvertes en dessous de la striata une douceur et le séparer du cerveau. Utilisez la pince pour enlever tout le cortex restant dans le striatum. Répétez cette procédure pour le deuxième striatum.
    6. Utiliser la pince pour abaisser doucement par 2 mm le contour du cervelet pour faciliter la séparation du cervelet de cerveau. Placez la pince juste derrière le cervelet et le retirer en déplaçant la pince avant.
    7. Utilisez la partie large de la pince à élever le mésencéphale afin de voir clairement où il rejoint le tronc cérébral. Faire une incision verticale à la jonction puis retirez le tronc cérébral.
    8. Placez la pince derrière le mésencéphale, qui is composé de quatre structures arrondies. Inciser verticalement jusqu'à ce que le mésencéphale a été complètement séparé du cerveau restant.
  2. Préparation des homogénats de variable% (poids / volume) dans du tampon HS, en fonction de la quantité de tissus disponibles, à savoir, 5% d'homogénat pour un poids compris entre 10 et 30 mg, 10% pour un poids compris entre 30 et 80 mg, et 20% pour un poids de plus de 80 mg.
    1. Ajouter un volume suffisant de tampon HS aux régions du cerveau disséqués pour obtenir le% d'homogénat attendu.
    2. Vortex et vérifier que les tissus sont totalement immergés dans la mémoire tampon de HS.
    3. Homogénéiser les échantillons préparés à partir des régions du cerveau disséqués ou la moelle épinière cervicale avec un broyeur de tissu composée d'un tube en verre de borosilicate et deux pilons, A et B.
    4. Pour chaque région du cerveau d'être écrasé directement dans le tube. Un pilon insérer dans le tube et rétracter. Répétez ce mouvement une dizaine de fois pour dissocier le tissu. Ensuite, utilisez un pilon B à Continuer en broyant le tissu avec 20 autres mouvements. Transférer les homogénats dans un tube de 1,5 ml avec une pipette de transfert de 1 ml.
  3. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer tous les fragments de cerveau non broyées. Récupérer les surnageants, les diviser dans 200 aliquotes et les conserver à -80 ° C pour analyse ultérieure ELISA.

4. Détection par ELISA de aS

  1. Diluer les anticorps de revêtement à 0,01 ng / ml. Utilisez soit anti-aS polyclonaux de lapin ou de l'anticorps monoclonal clone 42 mM Na 2 CO 3 / tampon NaHCO3 50 (pH 9,6).
  2. Enduire le microplaques de 96 puits avec 100 pi par puits de cette solution de revêtement, et laisser à 4 ° CO / N. Utilisation de l'anticorps polyclonal de lapin anti-aS dans la solution de revêtement pour ELISA en utilisant des anticorps de détection syn514, clone 42, LB509, AS11, 4D6 ou 8A5. Utilisez la aS monoclonal anti-clone 42 d'anticorps en tant que solution de revêtementen combinaison avec l'anticorps de détection de l'anti-pSer129.
    NOTE: Si nécessaire, les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant une semaine avant le test ELISA est effectuée.
  3. Utiliser un laveur de plaques pour laver les plaques cinq fois avec 300 ul de solution saline tamponnée au phosphate avec 0,05% de Tween 20 (PBST) par puits. De cette étape en avant, l'incubation est à température ambiante.
  4. Ajouter 200 pi de T20 tampon PBS par puits de blocage. Agiter pendant 1 heure à 150 tours par minute. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
  5. Diluer les homogénats de cerveau (dilution de 1: 100 des 20% homogénats, 01:50 10% des broyats et 01h25 des broyats de 5% dans PBST BSA 1%), et ajouter 100 ul à chaque puits. Puis incuber pendant 2 heures tout en agitant à 150 tpm. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
  6. Ajouter les différents anticorps de détection aS en PBS avec de la BSA 1% aux dilutions mentionnées dans la liste des matériaux. Incuber pendant 1 heure à 150 tours par minute. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
  7. Ajouter soit anti--mouse ou anti-lapin conjugués IgG HRP dilué à 1: 8000 dans du PBST complété avec de la BSA 1% pendant 1 heure en agitant à 150 tpm. Laver les plaques cinq fois avec du PBST.
  8. Ajouter 100 pi de 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) à chaque puits et incuber pendant 15 min dans l'obscurité tout en agitant à 150 tpm.
  9. Arrêter la réaction en ajoutant 100 pi de HCl 1 N par puits puis mesurer l'absorbance à 450 nm avec le lecteur de microplaques.
  10. Pour l'analyse des données, il faut soustraire la valeur de DO obtenue dans un puits avec tous les réactifs à l'exception des échantillons de cerveau de la souris (de puits vierge) à partir des valeurs de DO mesurées pour chacun des échantillons analysés.

5. Epitope Mapping

  1. Effectuer la cartographie d'épitopes selon la méthode décrite par Osman 16. En bref, les peptides spot de la séquence α-synucléine humaine contenant 12 acides aminés sur nitrocellulose avec 10 acides aminés qui se chevauchent.
  2. Bloc avec Tris 50 mM / NaCl 150 mM tampon à pH 10 contenant 0,05% de Tween 20 et 5% de lait en poudre. Incuber l'anticorps dans une solution de blocage à une concentration de 2 ug d'anticorps par ml à 2-10 ° CO / N.
  3. Laver la membrane trois fois avec du Tris 50 mM / NaCl 150 mM tampon pH 10 contenant 0,05% de Tween 20. Incuber avec l'anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à HRP. Laver la membrane cinq fois en utilisant le même tampon puis tache en utilisant un kit de coloration blot TMB occidentale.

6. Analyse statistique

  1. Utilisez le logiciel de R et nlme pour effectuer des régressions à effets mixtes pour modéliser OD. Pour chaque comparaison, effectuez un modèle d'effet de régression mixte. Utilisez un effet fixe de distinguer symptomatique des groupes asymptomatiques.
  2. Utilisez un effet aléatoire pour refléter la variabilité des répétitions pour une souris donnée. Vérifiez homoscédasticité en examinant les résidus et, si nécessaire, utiliser les fonctions de la variance pour modéliser la structure de variance des erreurs au sein des groupes en accord avec Pinheiro et Bates 17. Réglez 0,05 comme seuil de signification de P.

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Résultats

Dans cette étude, les tests ELISA utilisés spécifiquement identifiés aS associées à des maladies (aS D) dans des homogénats de cerveau préparés dans un tampon de sel élevée de souris M83 malades. En utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement pSer129 aS (p = 0,0074), l'ELISA distingue facilement vieux, souris malades (> 8 mois) à partir de jeunes (2-5 mois), les souris M83 sains (Figure 1). Plusieurs autres anticorps ont montré des signaux aussi élevés (> 0,6 OD) que dans le...

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Discussion

L'utilisation d'un test ELISA a été démontrée pour détecter spécifiquement aS D directement à partir d'homogénats de cerveau de souris au cours de la maladie dans le modèle de souris transgénique M83. En effet, cet ELISA pouvait facilement distinguer les souris malades de souris M83 M83 sains en utilisant des homogénats de cerveau ne entiers dans un tampon de sel élevée.

Les étapes les plus critiques pour de bons résultats à l'aide de cet ELISA sont: disséquer corr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun intérêt concurrentiel à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Damien Gaillard pour inoculations et le suivi de l'expérimentation animale. Ce travail a été soutenu par l'Anses (Agence française pour l'alimentation, l'environnement et la santé et sécurité au travail) et par une subvention de la Fondation France Parkinson.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
LB509Abcamab27766Anticorps de détection 1/2 000
AS11Produit à l'AnsesAnticorps de détection 1/1 000
4D6Abcamab1903Anticorps de détection 1/2 000
PSer129Abcamab59264Anticorps de détection 1/3 000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Anticorps de détection 1/1 000
syn514Abcamab24717Anticorps de détection 1/500
clone 42BD Biosciences610787Anticorps de revêtement et de détection (1/2 000)
8A5Fourni par le Dr AndersonAnticorps de détection 1/2 000
Anticorps polyclonaux anti-αsynMilliporeAB5038PAnticorps de revêtement
Conjugué HRP IgG anti-sourisSouthern Biotech1010-05
Conjugué HRP IgG anti-lapinSouthern Biotech4010-05
Conjugué HRP IgG anti-chèvreDianova115-035-164
Tampon HSAjuster à pH 7,5 et conserver à 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAjuster à pH 7,5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2,7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Solution mère 100 mM, toxique
Cocktail de phosphatase 1%Pierce78428
Cocktail d'inhibiteur de protéase 1%Roche04 693 132 00150x concentré
Microplaque MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9,6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602,86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293,36 g/L, pH 9,6
Tampon de blocage Superblock T20 PBSPierceE6423H10x concentré
TMBSigmaT0440Utilisé pour ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Utilisé pour la cartographie des épitopes
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120Conserver sur la glace à cette étape
Tubes de broyageBiorad355-1197
Laveur de plaquesTecanColumbus Pro
Lecteur de plaquesBioradModel 680
Loupe à faible grossissement VWR630-1062Grossissement 8X
Pince Dumont n°7WPI14097Pour les étapes de dissection
Pipette de transfert 1ml SamsoSamso043231
Tubes de 1,5 mlDutscher033290

Références

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Mots-clés

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