Systèmes cellules HeLa base de la libre expression pour l&#39;expression des<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptries Protéines

Résumé

L'expression des protéines paludisme dans les systèmes à base de cellules reste difficile. Nous démontrons deux systèmes cellule libre expression étape et une IVT de l'étape (la traduction in vitro) pour exprimer des protéines recombinantes de rhoptries paludisme à partir de cellules HeLa. On utilise un système de purification par affinité à base de résine Ni-à purifier les protéines de rhoptries.

Résumé

Le paludisme entraîne une morbidité et une mortalité importantes mondiale. Aucun vaccin de routine est actuellement disponible. Une des principales raisons de l'absence d'un vaccin est le défi d'identifier des candidats vaccins appropriés. Protéines paludéennes exprimés en utilisant des systèmes d'expression à base de cellules procaryotes et eucaryotes sont mal glycosylés, généralement insolubles et subissent pliage impropre menant à immunogénicité réduite. Les systèmes d'expression exempt de germes de blé, de reticulocytes de lapin et Escherichia coli lysat cellulaire de lysat sont actuellement utilisés pour l'expression de protéines paludiques. Toutefois, la durée de temps d'expression et inappropriée glycosylation des protéines reste un défi. Nous démontrons l'expression de protéines de Plasmodium in vitro en utilisant des systèmes de la libre expression de cellules HeLa base, appelées "cellules sans systèmes d'expression in vitro humains». Les systèmes d'expression de cellules HeLa 2 basé libres transcrire l'ARNm en 75 min et 3 ul de transcribed ARNm est suffisante pour traduire des protéines en 90 min. Le système d'expression est une étape de transcription et une traduction couplé système d'expression; la transcription et la traduction co-produit dans 3 heures. Le processus peut également être prolongé pour 6 heures en fournissant une énergie supplémentaire. Dans le système d'expression en 2 étapes, l'ARNm est transcrit premier et ensuite ajouté au mélange de traduction de l'expression des protéines. Nous décrivons comment exprimer des protéines de paludisme; hydrophobe Fente de PF3D7_0114100 Maurer - 2 transmembranaire (GCFP-2TM) protéine, une protéine de PF3D7_0925900 hydrophile et une répétition de tatou contenant des protéines PF3D7_1361800, en utilisant le système de la libre expression dans des cellules HeLa base. Les protéines sont exprimées dans des micro volumes utilisant des stratégies d'expression en 2 étapes et 1-étape. Procédé de purification par affinité pour purifier 25 ul de protéines exprimées à l'aide du système cellulaire humaine libre d'expression in vitro est également décrit. le rendement en protéines est déterminée par le test de Bradford et l'a expriméet des protéines purifiées peuvent être confirmés par une analyse Western blot. Protéines recombinantes exprimées peuvent être utilisées pour des analyses immunologiques et des vaccinations, le séquençage de protéines.

Introduction

Dans la recherche du paludisme, l'expression de protéines immunogènes en utilisant des systèmes à base cellulaires procaryotes ou eucaryotes reste un défi. L'AT richesse du génome de Plasmodium et les mécanismes post-traductionnelles inconnus ^14,7, contribuent aux difficultés liées à l'obtention des protéines correctement repliées et immunogènes pour les études de production d'anticorps et de vaccins. Des systèmes procaryotes tels que Escherichia coli ont été utilisés pour l'expression de protéines recombinantes. Systèmes procaryotes sont à faible coût, efficaces, produisent des rendements élevés de protéine recombinan....

Protocole

1. Préparation des parasites des cultures cellulaires, Collection de Parasite Pellets

1. Préparer un milieu RPMI-1640-HEPES en ajoutant 10 g de poudre de milieu RPMI-1640, 66 mg de sulfate de gentamycine, 2 g de bicarbonate de sodium, un tampon de HEPES 5,9 g, 50 mg d'hypoxanthine et 3,8 g de dextrose dans 1 L stérile dH ₂ O. Mélanger à l'aide tableau agitateur magnétique jusqu'à ce que tous les poudre se dissout dans l'eau distillée 1 L. Effectuer micro filtration de milieux utilisant filtre de 0,22 um. Rangez les médias dans des flacons stériles.
2. Lavez non infectés (frais) de type A + érythrocytes utilisant RPMI. Prépare....

Résultats

Validation des protéines recombinantes exprimées par la réactivité avec des anticorps spécifiques est une première étape importante en confirmant le bon pliage des protéines exprimées. Protéines recombinantes paludisme ont été exprimées à l'aide d'une étape et en deux étapes dans des systèmes in vitro de la libre expression de cellules humaines. Les protéines recombinantes sont méthode d'affinité Ni-chélateur purifié. Nous avons ensuite utilisé des antiserums contre rhoptries mérozoïtes entiers dans western .......

Discussion

Les étapes importantes pour l'expression réussie de protéines en utilisant deux étapes dans le système de cellule humaine de la libre expression et la purification vitro sont: 1) l'amplification réussie et le clonage de gènes dans le vecteur plasmidique pT7CFE-Chis; 2) la transcription de l'ARN à 30 ^° C; 3) la traduction de protéine à 30 ° C en présence d'inhibiteur de la RNAse; 4) le développement du protocole de purification par affinité en utilisant des billes à base de résine revêtues de N.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d’expression libre de cellules humaines in vitro en 2 étapes	Thermo Fisher	88856	Arrêté. Stocker toujours à -80 ° ;C. Ne pas décongeler à l’eau tiède
1-step in vitro système de traduction couplé	Thermo fischer	88860	Stocker toujours à -80 ° ;C. Ne pas décongeler à l’eau chaude
Système de purification ProBond	Invitrogen	K850-01	Magasiner chez RT
Probond Résine chélatrice au nickel	Invitrogen	R801-01	Magasiner à 4oC.
A+ Magasin	de banque de		de sang humain à 4 ° ;C.

sang inter-États