Rose Bengale Photothrombosis par imagerie optique confocal In Vivo: Un modèle de l'unité des maladies du navire

Summary

Ici, nous décrivons une approche de microscopie optique semi-invasive pour l’induction d’un caillot photothrombotique Rose Bengal dans le cortex somatosensoriel d’une souris in vivo. Les aspects techniques de la procédure d’imagerie sont décrits depuis l’induction d’un événement photothrombotique jusqu’à l’application et la collecte de données.

Abstract

Les techniques d’imagerie in vivo ont augmenté en utilisation en raison des progrès récents des colorants d’imagerie et des technologies optiques, permettant d’imager les événements cellulaires chez un animal intact. De plus, la capacité d’induire des états pathologiques physiologiques tels que l’AVC in vivo augmente son utilité. La technique décrite dans le présent document permet d’évaluer physiologiquement les réponses cellulaires dans le SNC à la suite d’un AVC et peut être adaptée à d’autres conditions pathologiques étudiées. La technique présentée utilise l’excitation laser du colorant photosensible Rose Bengal in vivo pour induire un événement ischémique focal dans un seul vaisseau sanguin.

Le protocole vidéo démontre la préparation d’une fenêtre crânienne mince sur le cortex somatosensoriel chez une souris pour l’induction d’un événement photothrombotique du Bengale de Rose, en réduisant au minimum les lésions à la matière dure-mère sous-jacente et au cerveau. La préparation chirurgicale est d’abord réalisée sous un microscope de dissection avec une plate-forme chirurgicale/d’imagerie sur mesure, qui est ensuite transférée sur un microscope confocal équipé d’un adaptateur d’objectif inversé. Des images représentatives acquises à l’aide de ce protocole sont présentées, ainsi que des séquences en accéléré de l’induction d’un AVC. Cette technique est puissante en ce sens que la même zone peut être imagée à plusieurs reprises les jours suivants, ce qui facilite les études longitudinales in vivo des processus pathologiques après un AVC.

Introduction

La technique décrite permet la visualisation de la réponse cellulaire in vivo, immédiatement après l'induction de Rose Bengale photothrombosis dans une souris intactes. Rose Bengale (4,5,6,7-tétrachloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tétraiodofluorescéine) est un colorant photosensible utilisée pour induire un AVC ischémique dans des modèles animaux (souris et le rat). Suite à une injection en bolus de RB par la veine de la queue et l'illumination ultérieure par un crâne amincie avec une lumière laser de 564 nm, un thrombus est induit provoque un accident vasculaire cérébral physiologique ^1. La méthode a été initialement décrit par Rosenblum et El-Sabban, en 1977, et a ensuite été adapté par Watson dans les milieu des années 1980 ^1,2. En bref, le rose Bengale est irradié avec de la lumière verte d'excitation (laser 561 nm dans notre cas), ce qui génère la production d'espèces réactives de l'oxygène, qui active ensuite le facteur tissulaire, un initiateur de la cascade de coagulation. L'induction de la cascade de coagulation produit une ischémie lesion qui est pathologiquement pertinentes pour AVC clinique ^3.

AVC a une physiopathologie complexe en raison de l'interaction de nombreux types de cellules différents, y compris les neurones, les cellules gliales, l'endothélium et le système immunitaire. Le choix de la meilleure technique pour étudier un processus cellulaire particulier nécessite plusieurs considérations. Techniques expérimentales retrouvent globalement dans une des trois catégories: in vitro, in vivo et in silico chacun ayant des avantages et des inconvénients Des études in vitro ont l'inconvénient principal de l'élimination des cellules de leur milieu naturel et peuvent donc ne pas reproduire les effets observés dans une intacte,. animal vivant. Dans les techniques in vivo Pour renforcer la réplication expérimentale d'états pathologiques avec une importance accrue de translation. Dans silico se réfère généralement à la modélisation informatique d'une maladie ou d'un processus cellulaire, et alors que de plus en plus utilisé pour étudier les interactions médicamenteuses potentielles pour examenple, toute information recueillie doit encore être testée dans des cellules ou des tissus vivants.

Le modèle idéal de la course dans le cadre d'un laboratoire doit démontrer les caractéristiques pathologiques similaires à ceux observés dans la population humaine. Bien qu'il existe des caractéristiques physiologiques communes de l'AVC dans la population humaine, il ya aussi beaucoup de différences selon le type de dommage subi. AVC dans la population humaine se produit que de petites ou grandes occlusions des vaisseaux, des lésions hémorragiques, et l'artère à artère ou cardio-embolies qui se traduisent par des volumes d'infarctus variées ainsi que des différences dans les mécanismes liés à chaque pathologie. L'avantage de l'utilisation de modèles de course des animaux est la génération des infarctus reproductibles qui imitent les caractéristiques d'un AVC humaine. Les modèles les plus courants de course d'origine animale comprennent occlusion de l'artère en utilisant: occlusion de l'artère cérébrale moyenne (méthodes de filaments ou emboliques endovasculaires) qui distale MCAO modèles et le modèle de photothrombosis. Les avantages d'uninconvénients de chaque modèle d ont été examinés ailleurs (voir ⁴ et ^5). Les modèles globaux ischémiques (MCAO), tout en étant relativement facile à réaliser sont moins pertinents pour la course humaine que sont les modèles de course focaux. En outre, ces procédés sont très variables dans l'induction de lésions d'infarctus cérébral reproductibles. Le modèle de photothrombosis est hautement reproductible aussi longtemps que l'expérimentateur contrôle leurs expériences bien, offrant un net avantage sur les modèles MCAO. Toutefois, en raison de la microvascularisation insulte le modèle a été décrit pour afficher une pénombre ischémique minimale, la zone où les cellules sont pensés pour être récupérable ^6,7. En outre, l'oedème vasogénique et la formation de l'oedème cytotoxique peut également être induites après irradiation de la zone d'imagerie. Malgré ces limites de la technique a fourni un nouvel aperçu de nombreux processus physiologiques suivants course ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Remarque: Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université du Texas Health Science Center de San Antonio et étaient conformes aux directives arrivent.

1. L'anesthésie pour corticale Préparation

1. Passer la souris dans une chambre d'induction avec 2-3% d'isofluorane mélangé avec l'oxygène pour induire une anesthésie. Observez la diminution du taux de respiration que la souris est induite. Pincez la patte de la souris pour déterminer si la souris est prête à passer à l'ogive. Remarque: le niveau d'anesthésie est une étape critique dans une préparation in vivo et il faut veiller à ne pas induire un niveau qui va provoquer une ischémie globale.
2. Une fois que la souris est suffisamment anesthésié, transférer l'animal à la chirurgie / plate-forme d'imagerie et placer le nez de la souris dans le cône de nez et d'appliquer 1-1,2% isofluorane de maintenir un état anesthésié. Assurez-vous que la souris est allongée sur un co de températureCoussin chauffant ntrolled pour maintenir la température corporelle (37 ° C +/- 0,5 ° C) tout au long des procédures restantes. Placez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
3. Surveiller la physiologie de la souris en utilisant un système d'oxymétrie de pouls à l'aide du pied ou de la queue de clip fourni avec le système. Vérifiez que la fréquence respiratoire est maintenue entre 50-65 respirations / min. Vérifiez que la fréquence cardiaque reste entre 300 à 450 bpm et la saturation en oxygène est maintenue entre 97-98% pour assurer la survie à long terme de l'animal.
4. Lorsque la souris est correctement anesthésié, de se raser les cheveux sur le crâne à l'aide des tondeuses électriques, enlever les poils résiduelle et propre avec de la bétadine, suivi par un tampon imbibé d'éthanol. Répétez cette procédure jusqu'à trois fois pour assurer un environnement chirurgical stérile.

2. Procédure chirurgicale

1. Avec le cuir chevelu entièrement nettoyée et rasée, faire une incision de 5 mm dans le cuir chevelu de la souris pour révéler le fissu crânienneres et de localiser bregma.
2. Utilisez un applicateur de coton stérile pour éliminer toute fascia restants recouvrant le crâne.
3. Collez une bague sur mesure en acier inoxydable (figure 1) avec de la colle de tissu à l'os recouvrant le cortex pariétal en utilisant les coordonnées stéréotaxiques de Bregma: -1 à -3 mm et latérale: 2-4 mm. Remarque: La colle définit généralement dans les 2 minutes après le placement de l'anneau sur l'os.
4. Fixez la bague à un titulaire stéréotaxique (figure 2) pour stabiliser la souris et empêcher tout mouvement pendant l'imagerie.
5. En vertu d'une dissection chirurgicale de qualité microscope, percer lentement une section de 1-2 mm dans le crâne à l'aide d'un outil de dremel-comme la vitesse contrôlée (Meisinger 3,9 mm foret) en veillant à maintenir le niveau de la zone comme il est percé. Atteindre cet objectif en utilisant un motif en zig-zag. Pour éviter l'accumulation de chaleur, régler la vitesse de forage à bas et prendre des pauses fréquentes.
6. Lorsque le crâne crânienne devient brillant en apparence, continuer l'amincissementdu crâne en utilisant une lame de scalpel en utilisant le même motif en zig-zag afin de maintenir le niveau de surface amincie pour faciliter le retrait en douceur de couches minces de crâne crânienne. Avec la pointe de la lame de bistouri faire de petits coups de linéaires avec une légère pression pour enlever des couches minces d'os à la fois. Continuer jusqu'à ce que le système vasculaire est clairement visible à travers le microscope de dissection.
7. Si l'expérimentateur perce à travers ou briser le crâne pendant le processus d'amincissement, euthanasier l'animal en raison de dommages susceptibles de le cortex sous-jacent.
   Remarque: le crâne de la souris est d'environ 300 um d'épaisseur et est constituée de deux couches minces d'os compact (une externe et une couche interne) et une couche d'os spongieux pris en sandwich entre les deux couches de l'os compact. La couche externe de l'os compact et plus de l'os spongieux sont éliminés dans la zone de perçage 5 mm pour résultat une couche d'environ 50 um d'os compact restant (voir la figure 2B). Visualization de la vascularisation fera en sorte que le crâne amincie intact finale est d'environ 50 um d'épaisseur. Le crâne est donc toujours présent lorsque amincie à cette épaisseur.

3. Microscope Set-up

1. Utiliser un système de microscope inversé (classique, à foyer commun ou système à deux photons) qui a un onduleur objectif. Remarque: Il est également possible d'utiliser un microscope droit standard. Le facteur limitant sera l'espace entre la scène et les objectifs. Les modifications apportées à la scène peuvent être nécessaires pour accomplir cette configuration.
2. Fixez la plate-forme chirurgicale / imagerie à un stade sur mesure qui se trouve côté de la base du microscope. Remarque: La plate-forme est faite en utilisant un vérin de laboratoire pour permettre un mouvement vertical de la plate-forme chirurgicale / imagerie sous l'objectif. Le vérin de laboratoire est monté sur une plaque fixée à quatre pôles cylindriques. (Voir Figure 2).
3. Positionner l'onduleur objectif contenant un 20Xobjectif sur la fenêtre crânienne. Utilisez une source de lumière externe pour trouver la fenêtre crânienne en regardant à travers les oculaires du microscope et de positionner l'objectif dans le domaine de l'imagerie. Remarque: La zone de formation d'image sera noté par la présence de la vasculature.
4. Pour les objectifs à base d'eau, en utilisant le fluide spinal cérébral artificiel (aCSF) (NaCl 130 mM; KCl 30 mM; 12 mM de KH ₂ PO _4; 200 mM de NaHCO _3; 30 mM de HEPES et 100 mM de glucose) en tant que milieu en raison du risque fuite dans la cavité crânienne pendant l'imagerie (Figure 3).

4. Rose Bengale Dye préparation, l'administration et l'induction de l'AVC

1. Préparer une solution / ml frais de 20 mg de Rose Bengale artificielle liquide céphalo-rachidien (aCSF); filtrer et stériliser avant l'administration. Ne pas réutiliser ou stocker le Bengale Rose une fois qu'il a été mitigée. Faire une solution fraîche pour chaque expérience.
2. Donner une injection dans la veine de la queue 0,1 ml de Rose Bengale tandis que sla mise en conserve fenêtre crânienne avec un laser 561 nm pour assurer l'injection adéquate de la solution. Remarque: Rose Bengale sera visualisée dans les 5 secondes après l'injection dans le système vasculaire du cerveau. Le navire entier doit être rempli avec Rose Bengale.
3. Après une injection suffisante de colorant rose Bengale choisir un récipient approprié pour une thrombose sur la base de récipient de diamètre (40 à 80 um) pour assurer la reproductibilité d'un volume de la lésion donnée. Différencier les artères et les veines en regardant la direction du flux sanguin: artères vont se déplacer de plus grand diamètre à des navires de plus petit diamètre, les veines se déplacent de plus petits navires de plus grand diamètre. Ceci est facilement accompli par la visualisation une fois Rose Bengale est injecté.
4. Changez le réglage de microscope comme suit:
   1. Augmenter le temps de séjour. Remarque: Ce variera en fonction du système de microscope est utilisée.
   2. Augmenter la puissance du laser à 100%.
   3. Recueillir des images de séquence de temps à 1 image / s en utilisant lavitesse de balayage maximale.
5. Balayer la souris jusqu'à un caillot stable est formé à l'intérieur de la cuve. Note: Ceci est généralement réalisé dans les 5 min de balayage continu (Voir Figure 4).
6. Suite à l'induction de la formation de caillot avec Rose Bengale, retirer la souris à partir de la zone d'imagerie revenir à la loupe binoculaire. Retirez délicatement l'anneau en acier inoxydable du crâne crânienne. Examinez la fenêtre crânienne pour des saignements. Si le saignement se produit, mettre fin à l'expérience.
7. Utilisez 6.0 monofilament suture pour fermer l'incision sur le crâne. Passer onguent antibiotique sur la ligne de suture pour prévenir l'infection. Injecter Buprenex (0,05 mg / kg) sous-cutanée toutes les 12 heures pendant trois jours pour la gestion de la douleur.
8. Retourner la souris pour une chambre de récupération après le retrait de l'anesthésie jusqu'à pleinement éveillé et se déplacer librement.
9. Retour de la souris dans une cage propre pour complément d'enquête à une date ultérieure.

5. Imagerie longitudinale les jours suivants

1. Employer les méthodes suivantes pour effectuer l'imagerie longitudinale les jours suivants post-photothrombosis.
   1. Anesthésier la souris comme décrit dans la section 1 des méthodes.
   2. Après une anesthésie adéquate ré-ouvrir le cuir chevelu en supprimant toutes les sutures résiduelles de rouvrir la peau recouvrant le domaine de l'imagerie percé précédemment.
   3. Utilisez un applicateur de coton stérile pour éliminer toute fascia restants recouvrant le crâne.
   4. Collez une bague sur mesure en acier inoxydable (figure 1) avec de la colle de tissu à l'os recouvrant le domaine de l'imagerie précédente.
   5. Fixez la bague à un titulaire stéréotaxique (figure 2) pour stabiliser la souris et empêcher tout mouvement pendant l'imagerie.
   6. Localisez le système vasculaire sous-jacente du crâne préalablement amincie. Utilisation injection dans la veine de la queue de FITC-dextrane pour vérifier la présence du caillot précédemment induit.
   7. Utilisez 6.0 monofilament suture pour fermer la danscision sur le crâne. Passer onguent antibiotique sur la ligne de suture pour prévenir l'infection. Injecter Buprenex (0,05 mg / kg) sous-cutanée toutes les 12 heures pendant trois jours pour la gestion de la douleur.
   8. Retourner la souris pour une chambre de récupération après le retrait de l'anesthésie jusqu'à pleinement éveillé et se déplacer librement.

6. Vérification de l'induction de l'AVC (post-mortem)

1. À la conclusion d'une étude, vérifier que le volume de la course en utilisant 2,3,5-triphényltétrazolium chlorure (TTC) coloration comme indiqué sur la Figure 5. La méthode complète peut être trouvée dans ^12.

Results

Le but de cette méthode est d'induire un AVC ischémique dans des modèles animaux (souris et rats) après une injection en bolus de RB par la veine de la queue et l'illumination subséquente d'un crâne amincie avec une lumière laser de 561 nm. Les images de la figure 4 montrent l'évolution de la formation de caillots à l'intérieur d'une seule cuve après irradiation de la zone à 0, 1, 1,5 et 2 min. Avant la formation de caillots tout le navire est blanche due à écoulement libre Rose Bengale. Suite à l'induc...

Discussion

La capacité à traduire expérimentale course physiopathologie de l'animal à l'application humaine a été en proie à l'échec. Cependant, l'utilisation de modèles animaux, tels que le modèle de photothrombosis, permet d'améliorer la compréhension de la physiopathologie de la course et l'exploration de nouvelles approches thérapeutiques pour fournir une neuroprotection après un AVC. Petits coups et microinfarctions produites par le modèle photothrombotique corticales sont cliniquement pertinentes à in...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthésique	MWI Approvisionnement vétérinaire	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF  ;	126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 10 mM de glucose et 26 mM de NaHCO3 (pH de 7,4).
[en-tête]
Équipement
Ciseaux de dissection	Produits bioindustriels	500-410
Ciseaux opératoires 14 cm	Produits bioindustriels	12-055
Pince Dumont High Tech #5 style, droite	Produits bioindustriels	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Plate-forme pour Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Support de barre d’oreille de configuration stéréotaxique	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Appareil d’anesthésie pour rongeurs	DRE, Inc.	15001
Tech IV Vaporisateur d’isoflurane	DRE, Inc.	34001
F Cartouche d’air	DRE, Inc	80120
Tube respiratoire à circuit de bain	DRE, Inc	86111B
Adaptateur pour rongeurs pour tube	de bain DRE, Inc	891000
O2 régulateur pour bouteilles d’oxygène	DRE, Inc	CE001E
Chambre à induction pour rongeurs	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0 ; 18 po avec aiguille P-3	Suture Express	1639G
Inverseur d’objectif Adaptateur optique	Technologies LSM
Foret Foredom Double tension 110/120	Foredom	134.53
Mèche Meisinger 3.9 mm	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)