Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

Résumé

Ce protocole décrit en détail la méthode de génération de progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches embryonnaires à l’aide d’une méthode monocouche sans sérum. Ces progéniteurs peuvent être utilisés pour dériver des types de cellules neurales matures ou pour étudier le processus de spécification neuronale et se prêtent à la mise à l’échelle de formats multipuits pour le criblage de composés.

Résumé

La capacité à différencier les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour progéniteurs neuronaux, permet l'étude des mécanismes de contrôle de la spécification de neurones ainsi que la génération de types de cellules neurales matures pour complément d'étude. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé pour la différenciation de cellules progénitrices neurales ESC à l'aide de la culture en monocouche sans sérum. Le procédé est évolutive, efficace et aboutit à la production de ~ 70% de cellules progénitrices neurales à l'intérieur de 4-6 jours. Il peut être appliqué à l'ESC de diverses souches cultivées dans une variété de conditions. Progéniteurs neuronaux peuvent être autorisés à différencier en neurones fonctionnels et cellules gliales ou analysés par microscopie, cytométrie en flux ou moléculaires techniques. Le processus de différenciation est prête à la microscopie time-lapse et peut être combiné avec l'utilisation de lignes de rapporteurs pour surveiller le processus de spécification de neurones. Nous fournissons des instructions détaillées sur la préparation des milieux et de l'optimisation de la densité des cellules pour permettre au processus à be appliquée à la plupart des lignées de CSE et une variété de récipients de culture cellulaire.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes dérivées de l'embryon précoce ayant la capacité de proliférer indéfiniment in vitro, tout en conservant la capacité de se différencier en tous les types cellulaires adulte suivantes réintroduction dans un embryon au stade approprié (par formation d'une chimère), l'injection dans syngéniques ou immunodéprimés hôtes (en formant un tératome) ou in vitro soumis à des indices appropriés ^1. La différenciation in vitro de souris des cellules souches embryonnaires dans des lignées neurales a été décrite la première fois en 1995 et a impliqué la formation d'....

Protocole

1. Préparation des médias

NOTE: Le protocole repose sur l'utilisation d'un mélange de deux supports séparés: DMEM / F12 additionné de supplément N2 modifié et Neurobasal additionné de supplément B27, typiquement dans un rapport de 1: 1.

1. Préparer le supplément N2 modifié en mélangeant les composants dans un tube de 15 ml. Ne pas vortex ou filtrer cette; mélanger en inversant le tube jusqu'à ce que la solution est claire.
   1. Commencez par pipetage 7,2 ml de DMEM / F12, puis ajouter 1 ml de 25 mg / ml d'insuline (constitué dans HCl 0,01 M) et bien mélanger en inversant le tube. Il prend quelques minutes jusqu....

Résultats

Dans cette expérience, nous avons utilisé la lignée cellulaire 46C ^14, les cellules souches embryonnaires de souris avec une endogène Sox1-GFP journaliste, pour suivre la différenciation neuronale. En utilisant cette lignée cellulaire, l'expression de Sox1, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux, peut être détectée par la fluorescence verte. Placage densité est un facteur critique pour atteindre la différenciation neuronale. Souris des cellules souches embryonnaires ont été étalées dans plaque de 6 p.......

Discussion

Le protocole de différenciation neurale monocouche a été en usage depuis plus d'une décennie ^6. Le protocole est très efficace, composée d'un milieu défini, et fait dans un système de monocouche qui rend le système plus applicable pour préclinique (par exemple, le criblage de médicaments) utilise. Toutefois, il existe certains facteurs critiques qui déterminent l'efficacité de différenciation. Cet article souligne les facteurs et la solution pour chaque obstacle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sérum fœtal bovin	Life Technologies	10270-106
DMEM/F12	Life Technologies	11320-074
Milieu neurobasal	Life Technologies	21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01
B-27 Supplément, sans sérum	Life Technologies	17504-044
Insuline	Sigma	I6634	Reconstituer avec de l’eau stérile 0,01 M HCl
Apo-transferrine	Sigma	T1147	Reconstituer avec de l’eau stérile
Progestérone	Sigma	P8783	Reconstituer avec de l’éthanol
Putrescine	Sigma	P5780	Reconstituer avec de l’eau stérile
Sélénite de sodium	Sigma	S5261	Reconstituer avec de l’eau stérile
Albumine bovine fraction V	Life Technologies	15260-037
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Assurez-vous qu’il est complètement dissous avant utilisation car la glutamine est généralement sédimentée Gélatine
	Sigma	G1890
Boîte de culture tissulaire à 6 puits	Thermo Scientific	140675
Boîte de culture tissulaire à 24 puits	Thermo Scientific	142475
Boîte de culture tissulaire à 96 puits	Thermo Scientific	167008
GMEM	Life Technologies	11710-035
MEM Solution d’acides aminés non essentiels	Life Technologies	11140-050
Pyruvate de sodium	Life Technologies	11360-070
2-mercaptoéthanol	Sigma	M7522
Facteur inhibiteur de la leucémie	préparé en interne comme dans Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20	Sigma	P1379
4&prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Protéger de la lumière
Souris anti &beta ; III tubuline Anticorps IgG	Covance	MMS-435P
Anticorps IgG anti-souris marqué par fluorescence	Life Technologies	A31571	Protéger de
la lumière 25 cm2 flacon de culture tissulaire	Thermo Scientific	156367