Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l'analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem

Résumé

Ce protocole permet l’extraction et la concentration de protéines et d’ADN à partir de biomasse microbienne prélevée dans l’eau de mer, suivie de la génération de peptides tryptiques adaptés à l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse en tandem.

Résumé

Les technologies méta-omiques telles que la métagénomique, la métatranscriptomique et la métaprotéomique peuvent aider à la compréhension de la structure et du métabolisme des communautés microbiennes. Bien que puissante, la métagénomique ne peut à elle seule qu’élucider le potentiel fonctionnel. D’autre part, la métaprotéomique permet de décrire le métabolisme et la fonction exprimés in situ d’une communauté. Nous décrivons ici un protocole pour la lyse cellulaire, l’isolement des protéines et de l’ADN, ainsi que la digestion et l’extraction des peptides à partir de cellules microbiennes marines collectées sur une unité de filtre à cartouche (comme l’unité de filtre Sterivex) et conservées dans une solution de stabilisation d’ARN (comme RNAlater). Dans les études de protéomique basées sur la spectrométrie de masse, l’identification des peptides et des protéines est réalisée en comparant les spectres de masse en tandem peptidiques à une base de données de séquences nucléotidiques traduites. L’inclusion du métagénome d’un échantillon dans la base de données de recherche augmente le nombre de peptides et de protéines qui peuvent être identifiés à partir des spectres de masse. Par conséquent, dans ce protocole, l’ADN est isolé à partir du même filtre, qui peut être utilisé par la suite pour l’analyse métagénomique.

Introduction

Les microorganismes sont omniprésents et jouent des rôles essentiels dans les cycles biogéochimiques de la Terre ^1. Actuellement, il existe de nombreuses approches moléculaires disponibles pour caractériser la structure de la communauté microbienne et la fonction. La plus courante est l'analyse du gène ARNr 16S séquences amplifié par PCR de l'ADN de l'environnement ^{2 - 4.} Un inconvénient de l'analyse du gène ARNr 16S est qu'elle ne fournit des informations sur l'identité phylogénétique et structure de la communauté, avec peu d'informations sur la fonction métabolique. En revanche, les approches telles que la métagénom....

Protocole

1. Préparer Réactifs

1. Préparer la solution de SDS-extraction: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% de glycerol, 10 mM d'EDTA et 1% de SDS. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C.
2. Préparer les réactifs sous licence nécessaires au gel de Polyacrylamide.
   1. Préparer 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante.
   2. 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante.
   3. Préparer 10% de SDS. Stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. <....

Résultats

Comme une démonstration, nous avons effectué le protocole sur deux échantillons d'eau de mer prélevés dans la surface et le maximum de la chlorophylle de l'océan côtier dans le Nord canadien. En mer, l'eau de mer 7/6 L a été passé à travers un 3 um GF / D préfiltre, puis les cellules microbiennes ont été recueillis sur un filtre à cartouche de 0,22 pm en suivant le protocole de Walsh et al. ^20. Les cellules ont été immédiatement stockés dans une solution de stabilisation de l'ARN jusq.......

Discussion

Exemple de préservation est essentielle pour metaproteomic études et des travaux antérieurs ont démontré que la solution de stabilisation de l'ARN est un tampon de stockage pour stocker des cellules utile avant l'extraction des protéines ^28. Idéalement, les échantillons seraient conservés in situ pour annuler des changements dans l'expression des protéines pendant la manipulation ^33,34. En effet, in situ technologies d'échantillonnage et de fixation ont été dévelop.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sterivex -GP 0.22 &mu ; m unité de filtration	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling Tris
;	Bio Basic	77-86-1 ou TB0196-500G	Extraction de protéines/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Extraction
de protéines SDS	Bio Basic	15-21-3	Extraction de protéines/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Extraction de protéines
Glycérol	Fisher Scientific	56-81-5	Extraction
de protéines10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Extraction de protéines
Méthanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Précipitation de protéines
Acétone	Fisher Scientific	67-64-1	Précipitation de protéines
MPC Réactif de précipitation de protéines Epicenter		mmP03750	Précipitation d’ADN
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	Précipitation de l’ADN
Qubit dsDNA BR Kit de dosage	Life Technologies	Q32850	Quantification de l’ADN
Kit de dosage des protéines Qubit	Life Technologies	Q33211	Quantification des protéines
Saccharose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30 % Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Tampon d’échantillon	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaléidoscope Echelle	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acétonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsine digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsine digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsine digest
Acide Formique	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsine digest
Qualité HPLC H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsine digest
Iodoacétamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsine		Promega V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1,5 ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2 ml ROBO flacon 9 mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	Digestion de trypsine dans le gel
Insert PP BM, sans ressort	Candian Life Science	4025P-631	Digestion de trypsine en gel