Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Sandra Meyer; Philipp Wörsdörfer; Katharina Günther; Marc Thier; Frank Edenhofer

doi:10.3791/52831

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Article de méthode

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

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DOI :

10.3791/52831

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29 juillet 2015

Sandra Meyer¹^,² , Philipp Wörsdörfer¹ , Katharina Günther¹ , Marc Thier²^,³ , Frank Edenhofer¹^,²

¹Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Würzburg, ²Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, ³German Cancer Research Center, Heidelberg

Dans cet article

Résumé

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Résumé

Génération de cellules souches induites pluripotentes (CSPi) à partir de fibroblastes adultes de la peau et de la différenciation subséquente dans des cellules somatiques fournit des perspectives fascinantes pour la dérivation de greffes autologues qui contournent les barrières d'histocompatibilité. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et la différenciation complète subséquente en lignées désirées reste un obstacle pour la traduction clinique de la technologie iPSC raison de l'instabilité génomique potentiel et néoplasiques. Récemment, nous et d'autres avons montré que les cellules somatiques peuvent non seulement être converties en CSPi mais aussi en différents types de cellules souches somatiques multipotentes en utilisant des facteurs définis, contournant ainsi la progression à travers l'état pluripotent. En particulier, la conversion directe de fibroblastes humains en cellules progénitrices neurales induites (iNPCs) annonce la possibilité d'une source cellulaire autologue roman pour diverses applications telles que le remplacement de la cellule, la modélisation des maladieset le dépistage de la drogue. Ici, nous décrivons l'isolement des adultes fibroblastes primaires humains par biopsie de la peau et de leur conversion directe efficace en temps opportun iNPCs par l'expression restreinte de Oct4, Sox2, Klf4, ainsi que c-Myc. Colonies neuroépithéliales Sox2 positifs apparaissent après 17 jours d'induction et de lignes INPC peuvent être établies de manière efficace par l'isolement et l'expansion monoclonal. Réglage précis de la multiplicité de l'infection virale et la supplémentation du facteur inhibiteur de la leucémie au cours de la phase d'induction représentent des facteurs critiques pour atteindre des rendements de conversion de jusqu'à 0,2%. Jusqu'à présent, les lignes INPC spécifiques au patient pourraient être élargis pour plus de 12 passages et uniformément présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires de cellules souches / progénitrices neurales, comme l'expression de la nestine et Sox2. Les lignes INPC peuvent être différenciées en neurones et les astrocytes comme jugé par coloration TUJ1 et contre GFAP, respectivement. En conclusion, nous rapportons un protocole robuste pour la dérivation et de direconversion de ct de fibroblastes humains en cellules progénitrices neurales stable extensibles qui pourraient fournir une source cellulaire pour des applications biomédicales telles que le remplacement des cellules neurales autologue et de la modélisation de la maladie.

Introduction

En 2006 Yamanaka et ses collègues ont pu montrer pour la première fois la possibilité d'une reprogrammation de cellules somatiques dans un état pluripotent ^1. Cette dédifférenciation a été obtenue par la surexpression de quatre facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc dans des fibroblastes murins. Les dits induits des cellules souches pluripotentes générés (CISP) montrent l'équivalence fonctionnelle de cellules souches embryonnaires (CSE) et peuvent donc être différenciées en tous les types de l'organisme adulte cellulaires. Un an plus tard, à la reprogrammation CSPi pourrait aussi être atteint pour les fibroblastes humains ^2....