Article de méthode

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d'évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

DOI :

10.3791/52833

⸱

11 juillet 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Department of Veterinary Pathology, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 3UK Veterinary Laboratories Agency, 4Visual Services, National Centers for Animal Health, Animal and Plant Health Inspection Service, United States Department of Agriculture

Dans cet article

Résumé

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L'interféron γ cultivées dosage immuno-enzymatique à long terme est utilisée comme mesure de réponses de la mémoire centrale et est en corrélation avec les réponses des vaccins anti-mycobactériens protection. Avec cet essai, des cellules mononucléaires du sang périphérique sont stimulés avec des antigènes mycobactériens et l'interleukine-2 pendant 14 jours, permettant la différenciation et l'expansion de lymphocytes T mémoire centrale.

Résumé

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Les cellules effectrices et de la mémoire T sont générés par la programmation de développement des cellules naïves suite à la reconnaissance de l'antigène. Si l'infection est contrôlé jusqu'à 95% des cellules T générées pendant la phase d'expansion sont éliminés (par exemple., La phase de contraction) et les cellules T mémoire restent, parfois pour la vie. Chez l'homme, deux sous-ensembles fonctionnels distincts de cellules de mémoire T ont été décrits sur la base de l'expression de récepteurs ganglionnaires de ralliement. Cellules T mémoire centrale expriment CC chemokine receptor 7 et CD45RO et sont principalement situés dans les zones de cellules T des organes lymphoïdes secondaires. les cellules T mémoire effecteurs expriment CD45RO, manquent de CCR7 et d'affichage associés à des récepteurs homing des lymphocytes aux tissus périphériques ou enflammée. Cellules T effectrices ne expriment soit CCR7 ou CD45RO mais sur la rencontre avec des cytokines effectrices antigène produisent, comme l'interféron-γ. Interféron-γ tests de libération sont utilisés pour le diagnostic de la tuberculose humaine et bovine etdétecter principalement effecteur et des réponses de cellules T à mémoire effectrice. Mémoire réponses des lymphocytes T central par les cellules T CD4 + à la vaccination, d'autre part, peuvent être utilisés pour prédire l'efficacité du vaccin, tel que démontré par simien infection par le virus de l'immunodéficience des primates non humains, de la tuberculose chez la souris et le paludisme chez l'homme. Plusieurs études sur des souris et des êtres humains ainsi que les données non publiées de bovins, ont montré que l'interféron-γ analyses ELISPOT mesurer les réponses de cellules T à mémoire centrale. Avec cet essai, les cellules mononucléaires du sang périphérique sont cultivées dans la diminution de la concentration de l'antigène pendant 10 à 14 jours (à long terme) de la culture, ce qui permet des réponses effectrices à crête et décroissent; faciliter lymphocytes T mémoire centrale de différencier et de développer à l'intérieur de la culture.

Introduction

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Les cellules effectrices et de la mémoire T sont générés par la programmation de développement des cellules T CD4 + naïfs après reconnaissance de l'antigène. La différenciation des lymphocytes T CD4 + naïfs en cellules produisant de la cytokine de l'agent pathogène nécessite une reconnaissance par les cellules immunitaires innées, présentation de l'antigène aux cellules T, co-stimulation et des modifications de la transcription conduisant à la production de cytokines polarisée. Par exemple: les cellules présentatrices d'antigènes produisent l'interleukine (IL) -12, en réponse à des agents pathogènes intracellulaires, qui, conjointement avec la reconnaissance de l'antigène, favorise la différenciation des lymphocytes T en lymphocytes T auxiliaires 1 (Th1) 1,2 cellules par signalisation à travers transducteur de signal et activateur de la transcription 4 (STAT4) et T-box exprimés dans des cellules T (T-bet), conduisant à l'activation de la cellule, IL-2, l'expansion clonale et l'interféron (IFN) -γ production 3,4. Si l'infection est contrôlé, jusqu'à 95% des cellules T générées pendant la phase d'expansion sont éliminés (par exemple, la contractioncellules de phase) et la mémoire T restent, parfois pour une durée de vie 5. Sallusto et al. 6, a révélé deux sous-ensembles fonctionnels distincts de lymphocytes T mémoire chez l'être humain sur la base de l'expression de récepteurs ganglionnaires de ralliement. Cellules T mémoire centrale (TCM) expriment le récepteur des chimiokines CC (CCR) -7 et CD45RO et sont principalement situés dans les zones de cellules T des organes lymphoïdes secondaires. Tcm ont limité la fonction d'effecteur, un seuil de faible activation et de conserver une forte production d'IL-2 et la capacité proliférative. cellules mémoire T effecteurs (TEM) expriment CD45RO, manquent CCR7 et d'affichage pour les récepteurs homing vers les tissus périphériques ou enflammées. Les cellules effectrices expriment ne soit pas CCR7 ou CD45RO rapidement mais produisent des cytokines effectrices, telles que l'IFN-γ, lors de la reconnaissance d'antigène.

IFN-γ dosages libération (TLIG) sont utilisés pour le diagnostic de la tuberculose bovine et humaine 7. Mycobacterium bovis est l'agent principal de la tuberculose bovine (bTB) tout ca humaineSES de la tuberculose sont causées principalement par Mycobacterium tuberculosis. Grâce à ces tests, le sang entier ou des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont stimulées par des antigènes mycobactériens pendant 16 à 24 heures et la production d'IFN-γ à l'intérieur du surnageant est mesurée par ELISA ou par la détection de cellules produisant l'IFN-γ en utilisant des techniques ELISPOT. En raison de la courte période de stimulation (par exemple., De 16 à 24 h) et la production de cytokines rapide, ex vivo dosages détectent principalement les réponses effectrices et Tem. Cela a été confirmé par analyse par cytométrie en flux des populations de cellules dans ces cultures 10.8.

Ex vivo réponses IFN-γ sont systématiquement inclus dans l'évaluation du panneau de la réponse immunitaire des vaccins contre la tuberculose, y compris ceux utilisés pour évaluer les réponses par le bétail. La plupart des vaccins efficaces contre la tuberculose bovine provoquent des réponses spécifiques de l'IFN-γ, mais tous les vaccins qui induisent des réponses d'IFN-γ sont pas Protective. En outre, les niveaux d'IFN-γ induite par la vaccination, telle que mesurée avant l'infection, ne correspondent pas nécessairement à la protection. Par exemple, différentes souches de BCG peuvent avoir différentes capacités à induire ex vivo une réponse IFN-γ, en dépit des niveaux de protection 11 similaires. Ainsi, ex vivo TDIG sont précieux pour le diagnostic de la tuberculose et pour accéder à l'immunogénicité du vaccin; cependant, leur utilisation comme prédicteurs de l'efficacité du vaccin est limitée. Tcm réponses à la vaccination, d'autre part, peuvent être utilisés pour prédire l'efficacité du vaccin, tel que démontré par le virus de l'immunodéficience simienne (SIV) chez les primates non humains, 12,13 tuberculose chez la souris 14 et le paludisme chez l'homme 15,16.

Après une réponse immunitaire efficace résultant de la clairance des agents pathogènes, Tcm sont maintenues et fournir une protection à une seconde infection éventuelle par le même agent. Une exception notable à ce scénario est M. la tuberculose INFEction de l'homme dans laquelle les patients recevant un traitement anti-mycobactérienne curative sont sensibles à la réinfection 17,18. En outre, les événements qui régissent la mémoire immunologique au cours des infections chroniques, dans lequel la stimulation antigénique persiste, ne sont pas bien comprises 19. Au cours des infections chroniques, telles que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et la tuberculose, une réponse significative Tcm est associé à une issue favorable (par exemple, la latence de la tuberculose et la maladie subclinique avec le VIH) 20,21. Plusieurs études sur des souris et des humains ont démontré que de culture des tests ELISPOT IFN-γ à long terme mesurent Tcm réponses 16,20-22. Avec ce dosage, les PBMC sont cultivées en diminuant la concentration de l'antigène de 10 à 14 jours, ce qui permet des réponses effectrices de crête et décroissent; faciliter Tcm de différencier et de développer au sein de la culture.

Culture tests ELISPOT IFN-γ de longue durée ont également été utilisés dans vétérinairela recherche, pour l'instant le phénotype des cellules répondantes a été difficile à évaluer en raison de l'absence de réactifs critiques, en particulier un anticorps anti-CCR7. Vaccins efficaces contre la tuberculose bovine [par exemple. utilisant une dose unique de M. bovis Bacille de Calmette et Guérin (BCG), le BCG suivie par vaccin viral à vecteur unité antigène 85A, ou M atténué. bovis ΔRD1] susciter culture réponses ELISPOT IFN-γ à long terme après la vaccination qui sont en corrélation avec la protection (c.-à-fardeau mycobactérienne inférieure et diminué TB-pathologie associée) contre une provocation ultérieure avec virulente M. bovis 23,24. En outre, le nombre de cellules IFN-γ-sécrétant spécifiques de l'antigène dans les cultures de CMSP à long terme sont plus élevés à 12 mois, mais diminuent à 24 mois après la vaccination BCG des veaux nouveau-nés, en corrélation avec le degré de protection détectable après M. bovis défi 25. Dans ce scénario, la culture ELISPOT IFN-γ est unoutil n important pour prédire l'efficacité du vaccin, offrant un moyen de prioriser les candidats vaccins pour des essais d'efficacité à coût élevé. En outre, les techniques de ELISPOT en culture peuvent être adaptées pour différents hôtes, les agents pathogènes et les cytokines par modification des antigènes ou des anticorps pour une variété de buts dans les champs de recherche différents.

Protocole

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1. Préparer les solutions suivantes

  1. Préparer RPMI complet (cRMPI) en ajoutant du sérum bovin fœtal (FBS) à une concentration de 10% (volume / volume), de la glutamine (2 uM), du pyruvate de sodium (1 M), des acides aminés non essentiels (0,1 uM), de la pénicilline -streptomycin (100 unités / ml de pénicilline et 0,1 mg / ml de streptomycine) et de 2-mercaptoéthanol (50 mM) dans du milieu RPMI 1640.
  2. Préparer 2 X citrate de dextrose acide, par mélange de citrate de sodium (77 uM), de l'acide citrique (38 uM), et du dextrose (122 uM), dans de l'eau distillée.
  3. Préparer Ca 2+ Mg 2+ libre solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na 2 HPO 4 (dibasique, 10 mM), KH 2 PO 4 (monobasique, 2 mM) dans de l'eau distillée; ajuster le pH à 7,2.
  4. Préparer PBS à 1% (PBS 1% de BSA) en ajoutant de l'albumine de sérum bovin dans du PBS (volume / poids, 1 g / 100 ml de PBS).
  5. Préparer PBS + 0,05% de Tween 20(PBST) en ajoutant 0,05% de Tween 20 dans du PBS (volume / volume, 500 pi de Tween 20/1 L de PBS).
  6. Préparer mM de Tris HCl, pH 8,2 tampon 100 par mélange de Tris (100 mM), de HCl (0,50 mM) dans de l'eau distillée.
  7. Préparer une solution d'éthanol à 35% par dilution de l'alcool d'éthyle (pureté ≥99.5%) dans de l'eau distillée (volume / volume, 35 ml d'alcool éthylique / 100 ml d'eau distillée).
  8. Filtre stériliser cRPMI, 2 x acide citrate dextrose, PBS, PBS 1% de BSA en utilisant 0,22 um filtres.

2. Les cellules de culture à long terme (Protocole 14 jours)

(Jour un)

  1. Préparer des solutions antigène à deux fois la concentration finale dans cRPMI. choix de l'antigène est critique et doit être adaptée à l'objet de l'étude.
  2. Diluer recombinant M. les antigènes de la tuberculose et de l'antigène TB10.4 Ag85A à 2 ug / ml (de chaque antigène, la concentration finale est de 1 ug / ml).
  3. Diluer M. bovis dérivé protéique purifié(PPD-B, Prionics Ag) à 10 ug / ml (la concentration finale est de 5 ug / ml).
  4. Diluer le début de sécrétion recombinant cible antigénique 6 (ESAT-6) et de la culture protéine de filtrat 10 (CFP-10) protéine de fusion (Reşat-6: CFP10) à 2 ug / ml (concentration finale de 1 ug / ml).
    REMARQUE: Ces antigènes sont de l'IFN-γ immunodominant induire des antigènes de mycobactéries tuberculeuses et peuvent être inclus pour stimuler les PBMC à partir de M. bovis animaux infectés. BCG ou M. bovis ΔRD1 animaux vaccinés ne répondent pas à Reşat-6: CFP10, comme la région codant pour ces antigènes (par exemple, RD1) est supprimé dans ces souches. Reşat-6: CFP10 utilisé dans ces études était une sorte don du Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 et Ag85A antigène sont des antigènes immunodominants présents dans le vaccin et virulent M. souches bovis 37. PPDB, comme un dérivé de protéine purifiée, est un complexe de plusieurs antigènes, y compris des antigènes partagés par des mycobactéries non tuberculeuses. Infecanimaux TED potentiellement répondre à tous les antigènes (à savoir: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: CFP10 et PPDB), tandis que les animaux vaccinés ne doivent pas répondre à Reşat-6: CFP10 11.
  5. Planche 500 ul / puits de solution d'antigène dans quatre exemplaires pour chaque animal dans une plaque à 24 puits. Pour ce protocole, utiliser des antigènes comme une piscine; utilisent donc tous les puits contiennent tous les antigènes et les pas de contrôle (tels que, nulle ou mitogene) cette étape. Incuber la plaque à 39 ° C / 5% de CO 2. La température normale de bétail est de 39 ° C; Ainsi, certains chercheurs utilisent 39 ° C pour la culture de cellules bovines. En outre, dans certains cas, avec des cellules humaines, la culture de cellules à 39 ° C procure des avantages 26,30 ajouté.
  6. Des seringues pré-charge couplée avec 16 ou 18 g d'aiguilles hypodermiques avec 6 ml d'acide 2-X citrate-dextrose; et de recueillir 60 ml de sang par ponction veineuse jugulaire bovine.
  7. Isoler PBMC par la norme centrifugation en gradient de densité des fractions de sang périphérique couenneajuster la concentration de cellules à 4 x 10 6 cellules / ml, comme décrit par Maue et al. 27
  8. Ajouter cellules (500 pl / puits) dans l'antigène préchargé plaque à 24 puits, en quatre exemplaires pour chaque animal (étape 2.5). Incuber la plaque à 39 ° C / 5% de CO 2.

(Trois jours et sept)

  1. En utilisant une technique stérile, retirez soigneusement 500 pi du surnageant de chaque puits sans déranger la couche de cellules.
  2. Reconstituer le volume et en ajoutant 500 pl / puits de cRPMI contenant IL-2 (30 U / pl, soit 15 U / puits; IL-2 humaine recombinante Sigma I7908). Incuber la plaque à 39 ° C / 5% de CO 2.

(Jours 10 et 12)

  1. En utilisant une technique aseptique, retirer 750 pi de surnageant de chaque puits. Reconstituer le volume avec 750 ul / puits de cRPMI (sans IL-2). Incuber la plaque à 39 ° C / 5% de CO 2.
3. ELISPOT Assay (Protocole Troisième Jour)

(Day one (12 e jour du protocole de culture à long terme))

  1. Étiqueter la plaque ELISPOT correctement pour chaque ensemble d'échantillons, pour éviter les erreurs lors du placage cellules: les cellules à long terme, plus les cellules présentatrices d'antigène (CPA), les cellules à long terme sans CPA et ex vivo de cellules / court terme (Figure 1). Réplique pour chaque traitement (c.-à-stimulation antigénique) devrait être fait au moins en double.
  2. Préparer une solution d'anticorps de capture par dilution de souris anti-bovine anticorps IFN-γ (MCA2112, clone CC330) dans du PBS (8 ug / ml).
  3. En utilisant une pipette multicanaux pré-mouiller les puits de la plaque ELISPOT avec 15 pl / puits de 35% d'éthanol pendant 1 min. Pour éviter d'endommager la membrane, ne pas toucher le fond du puits avec des embouts de pipette à tout moment au cours de l'essai.
  4. Laver la plaque à six reprises avec 300 pl / puits de PBS. Fluide de lavage doit être jeté par la plaque d'inversion. Lavages doivent être effectuées rapidement, ne permettant pas des puits de plaque à sécher.
  5. Introduire à la pipette 100 ul / puits de capture anticorps anti-IFN-γ (de l'étape 1 ci-dessus). Incuber à 4 ° CO / N (garder la plaque à l'intérieur d'un sac de rangement à glissière).

(La deuxième journée (13 e jour du protocole de culture à long terme))

  1. Préparer des solutions antigène à deux fois la concentration finale. Les traitements sont: pas de stimulation (cRPMI), PPD-B (20 ug / ml, concentration finale: 10 pg / ml), la protéine de cocktail TB10.4 et Ag85A (2 ug / ml de chaque protéine, concentration finale: 1 pg / ml de chaque protéine), Reşat-6: CFP10 (pour l'infection à M. bovis, 2 ug / ml, concentration finale: 1 ug / ml), et un témoin positif, tel que pokeweed (20 ug / ml, concentration finale: 10 ug / ml). Autres mitogène peuvent être utilisés à la place du PWM (par exemple, la concanavaline A).
    REMARQUE: pour cette étape antigènes composent quatre traitements différents et sont not utilisé comme une piscine (comme dans l'étape 2.5). Les quatre traitements sont: NS, PPDB, protéines cocktail (TB10.4 et Ag85A constituent un traitement) et PWM.

4. court terme Culture cellulaire et cellules adhérentes (APC) Isolation

  1. Recueillir 60 ml de sang à partir des mêmes animaux saignés le jour 1 (sous: culture à long terme, 14 protocole de jour) et d'isoler les CMSP comme avant.
  2. Ajuster la concentration cellulaire à 2 x 10 6 cellules / ml. tubes d'étiquetage clairement pour éviter une mauvaise affectation lors du placage cellules. Ces cellules seront utilisés pour les APC isolement et aussi comme culture cellulaire à court terme (étape 6.5). Identifier les tubes à la fois le nombre d'animaux et le type de culture (dans ce cas: ex vivo, à court terme ou des cellules fraîches).
  3. Retirer anticorps de capture excédentaire de la plaque ELISPOT par inversion. Laver les plaques 6 fois avec 300 pi de PBST.
  4. Retirez autant que possible PBST. Pipette 50 pi de suspensions de cellules dans les puits étiquetés comme des cellules à long terme ainsi que des APC. Bloquer autre wells avec 200 ul / puits de cRPMI. Incuber 90 min à 39 ° C ou Préchauffer cRPMI ou 39 ° C (nécessaire pour les étapes ultérieures). CMSP frais ne sont pas utilisés pour les cellules adhérentes (CPA) l'isolement seront nécessaires dans les étapes suivantes et doivent être stockés.

5. cellules cultivées

  1. Au cours de l'incubation de 90 min (étape 4.4, la culture à court terme et adhérent étape d'isolement des cellules), des cellules en culture à long terme récolte.
  2. Utilisation de 5 ou 10 pipettes ul, les médias de pipette avec des cellules haut et bas pour détacher les cellules, combiner le quadruple réplique à partir de chaque animal dans un seul tube de 15 ml. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 400 g.
  3. Après centrifugation, éliminer le surnageant par le tube inversion. Déloger culot cellulaire. Ajouter 5 ml de PBS, remettre en suspension doucement pastille, le cas échéant. Répétez la centrifugation. Répéter deux fois l'étape de lavage. Rejeter le surnageant par le tube inversion et en douceur les cellules dans 1 ml cRPMI remettre en suspension. Ajuster la concentration cellulaireà 2 X 10 5 cellules / ml.

6. Placage frais et CMSP de culture

  1. Après 90 minutes d'incubation, secouez plaques sur la plaque agitateur pendant 30 sec. Éliminer les cellules non adhérentes par la plaque d'inversion. Pipette 150 ul / puits de chaleur cRPMI (de l'étape 4, sous: cellules à court terme et de cellules adhérentes (APC) étape d'isolement).
  2. Agiter les plaques et jeter le fluide de lavage. Répétez lavage 3 fois. Ajouter 100 pl / puits de chaque antigène dans les puits appropriés (pré-étiquetés).
  3. Pour étaler les cellules, une pipette 100 ul / puits de culture suspension cellulaire à long terme (2 x 10 5 cellules / ml) dans les puits étiquetés comme des cellules à long terme ainsi que des APC. Veiller à ce que les cellules ajoutées dans cette étape à long terme sont du même animal que l'APC est déjà dans le puits. Ne pas mélanger des cellules en culture de l'APC et à long terme provenant de différents animaux.
  4. Pipette 100 pl / puits de la suspension de cellules en culture à long terme (2 x 10 5 cellules / ml) dans les puits sans APCs pour l'évaluation de APC exigence de la réponse de la culture à long terme.
  5. Ajouter 100 pl / puits de cellules à court terme (fraîchement isolées et ajustées à 2 x 10 6 cellules / ml) pour l'évaluation ex vivo de la réponse. Incuber les plaques O / N à 39 ° C / 5% de CO 2 incubateur. Veiller à ce que les plaques sont couchés à plat et ne pas empiler des plaques.
    REMARQUE: si l'analyse du phénotype de la cellule est désirée, la cytométrie en flux peut être réalisée comme un test auxiliaire. Les cellules sont étalées dans des plaques à 96 puits de fond (U au lieu de plaques ELISPOT) comme décrit pour le dosage ELISPOT. Capture d'anticorps adsorption (étapes 3.4 à 3.5) doit être ignoré. Les cellules sont ensuite mises en incubation O / N à 39 ° C / 5% de CO2 et un protocole de coloration de cellules standard effectuée. Réactifs cellule de coloration sont inclus dans le tableau des réactifs.

Trois jours (14 ème jour du protocole de culture à long terme)

  1. Diluer l'anticorps de détection (anti-souris IFN-γ bovine, clone CC302) à 5 ug / ml dans du PBS 1% de BSA. Jeter fluides de puits et laver plaques: six fois avec du PBST (300 pl / puits), la mise sur shaker à chaque fois pendant 10 secondes avant et entre les lavages, une fois avec dH 2 O (300 pl / puits), un supplément de 6 fois avec du PBST (300 pl / puits) et deux fois avec du PBS (300 ul / puits). Après que les cellules sont retirées des plaques, et si aucun problèmes de biosécurité applicables, les procédures peuvent être effectuées en dehors des enceintes de sécurité biologiques.
  2. Jeter le fluide de lavage. Retirer autant de liquide de lavage que possible en tapant la plaque sur du papier absorbant. Ajouter l'anticorps de détection (100 pl / puits).
  3. Incuber les plaques pendant 120 minutes à 39 ° C ou Au cours de cette étape d'incubation, préparer une solution de phosphatase alcaline suivant les instructions du fabricant. Trente minutes avant utilisation (par exemple, 90 minutes après l'addition de l'anticorps de détection à puits) diluer le réactif dans du PBST. Inverser le tube doucement pour mélanger les réactifs et incubées à RT.
  4. Après la 120 min d'incubation, jeter anticorps de détection en excès par la plaque d'inversion. Laver la plaque 6 fois avec du PBST (300 pl / puits). Retirer autant de liquide de lavage que possible en tapant la plaque sur du papier absorbant.
  5. Ajouter 100 pl / puits d'une solution de phosphatase alcaline (provenant de l'étape 3 ci-dessus). Incuber les plaques pendant 45 minutes à température ambiante. Jeter fluide et laver chaque plaque 6 fois avec PBST (300 pl / puits).
  6. Préparer la solution de substrat en suivant les instructions du fabricant (Vector Bleu AP de substrat III): Diluer réactifs dans Tris HCL pH 8,2 tampon de 100. Introduire à la pipette 50 ul / puits de la solution de substrat.
  7. Incubation à température ambiante jusqu'à ce que la couleur bleue commence à se développer (environ 30 min). Jeter fluide et laver les plaques avec de grandes quantités de dH 2 O. Retirer la plaque inférieure à exposer la membrane, laver dos de puits et laisser la plaque sécher à l'air.
  8. Lire plaques sur analyseur immunospot image ou ELISPOT lecteur (tableau 1), ou manuellement, à l'aide d'un stéréomicroscope. Sinon, gardez plaquesdans l'obscurité à la température ambiante jusqu'à ce que la lecture. En raison de la grande stabilité du substrat de réaction, la qualité est conservée pendant plusieurs années.
    Note: Les cellules et les concentrations d'antigène ont été optimisés pour éviter les puits avec des taches innombrables 23,24,27,37. Il est possible que la formation de taches innombrables se produire dans différents milieux ou en raison de la variation biologique. Si tel est le cas, la concentration cellulaire doit être optimisé de sorte une réponse point de comptage lisible est obtenue.

7. Plaques lecture et l'analyse des données

  1. Effectuer une analyse selon le Cellular Technology Limited (CTL) guide de lecteur de plaque ELISPOT (tableau 1). Une fois les taches chiffres sont obtenus pour chacun des puits, calculer la moyenne entre les doublons. La réponse immunitaire spécifique pour chaque stimulus antigénique est calculée en soustrayant le nombre moyen de spots dans les puits non stimulés de celle des puits stimulés par un antigène.

Résultats

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Environ un mois infection post-aérosol avec M. bovis (10 4 unités formant colonie), à partir de PBMC infectées (n = 8) et les animaux témoins (n = 8) ont été cultivées en présence d'antigènes et d'IL-2 pendant 13 jours. Développement des réponses Tcm après l'infection a été déterminée en utilisant IFN-γ ELISPOT. Représentant Tcm (en présence ou en l'absence de APC) et ex vivo de l'IFN-γ réponses ELISPOT à partir d'animaux infectés (trois animaux) et un animal non infecté (un animal) sont représentés sur la figure 1. A l'IFN-γ à long terme réussie les résultats d'analyse ELISPOT dans les cellules productrices d'IFN-γ (SPOT cellules formant, SFC) dans des conditions stimulées et près de l'absence d'une réponse à partir d'animaux non infectés et dans des conditions non stimulées. En outre, une forte réponse des lymphocytes T devrait se produire en réponse à PWM. Les réponses spécifiques à M. bovis ont été évalués par PPD-B ou Reşat-6: stimulation antigénique CFP10. Comme le montre la Figure1, robuste Tcm et ex vivo des réponses à PPD-B et Reşat-6: CFP10 ont été détectés à partir de tous les trois M. bovis animaux infectés par. Peu ou pas de Tcm et ex vivo des réponses ont été détectés à partir de l'animal de contrôle. En outre, la présence de APC était nécessaire pour des réponses optimales Tcm par des animaux infectés, comme le montre les réponses fortement réduits par des cellules en culture à long terme en l'absence d'APC autologues. IFN-γ réponse de PBMC de M. bovis animaux infectés et non infectés sont présentés dans la figure 2. Le nombre de SFC de chaque animal a été calculé comme le nombre moyen de SFC dans les échantillons en double en réponse à la PPD-B moins la réponse respective aux seuls médias. Les réponses ont été estimés pour 10 6 cellules. Les réponses différaient (P <0,05) sur la base de l'infection état, la présence ou l'absence d'APC et de la durée de culture (ie., De la culture par rapport ex culture à long terme vivo).

Image de l'acquisition de plaques
1. Tournez sur la machine
2. Ouvrir "Immuno Capture" du logiciel Version 6.3.
3. Étape 1: sélectionnez le type de plaque.
4. Étape 2: plaque de charge.
5. Étape 3: sélectionner les options de numérisation.
6. Étape 4: lancer la numérisation.
7. Obtenir image d'ensemble de la plaque.
8. Ejecter plaque.
9. Quittez le logiciel "Immuno Capture".
Compter les spots unités formant
1. Ouvrez "Immuno spot Capture" logiciel Version 5.0.
2. Sélectionnez objec t type: normal.
3. Sélectionnez module de comptage: comptage intelligent.
4. Étape 1: plaque de charge.
5. Etape 2: définir les paramètres de comptage: la précision du test de reconnaissance de tache sur puits avec différentes taches.
6. Lancer comptage automatique.
Contrôle de la qualité
1. Ouvrir "immunospot Capture" du logiciel Version 5.0.
2. Sélectionnez module de comptage: contrôle de la qualité.
3. Étape 1: plaque de charge.
4. Étape 2: Analyser puits en surbrillance individuellement.
5. Terminer contrôle de la qualité.

Tableau 1 - Autoimmun Diagnostika ELISPOT acquisition d'image de lecteur et la procédure de comptage cellulaire.

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Figure 1. Image puits à partir d'un IFN culture à long terme γ ELISPOT. Essai de culture de l'IFN-γ ELISPOT a été réalisée approximatelyone mois après défi avec virulente M. bovis (trois animaux). Les animaux non infectés ont été inclus en tant que témoins (un animal) des lignées cellulaires à long terme ont été générées en stimulant des PBMC avec un cocktail de Ag85A recombinant (1 pg / ml), TB10.4 (1 ug / ml), Reşat-6.: CFP10 (1 ug / ml) et PPD-B (5 pg / ml) pendant 13 jours, suivie d'un transfert sur des plaques ELISPOT en présence ou en l'absence de APC autologues. Cellules à court terme se composait de PBMC isolé le jour 13 et plaqué directement dans des plaques ELISPOT. Cellules à long terme et à court terme ont été stimulées avec PPD-B (10 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 pg / ml), le milieu seul ou mitogène pokeweed (5 &# 956; g / ml) pendant 24 h.

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Figure 2. Les résultats représentatifs d'un IFN culture à long terme γ ELISPOT réponse à M. bovis dérivé protéique purifié (PPD-B). dosage de culture IFN-γELISPOT a été réalisée approximatelyone mois après défi avec virulente M. bovis (huit animaux). Les animaux non infectés ont été inclus comme contrôles (cellules huit animaux à long terme ont été générées en stimulant des PBMC avec un cocktail de Ag85A recombinant (1 pg / ml), TB10.4 (1 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 ug / ml) et PPD-B (5 pg / ml) pendant 13 jours, suivie d'un transfert sur des plaques ELISPOT en présence ou en l'absence de APC autologues. cellules ont consisté à court terme de PBMC isolé sur 13 jours et plaqués directement dans la plaque ELISPOT . long terme et shocellules rt terme ont été stimulées avec PPD-B (10 ug / ml) ou le milieu seul pendant 24 h. Les réponses spécifiques de chaque animal (SFC / 10 6 cellules) sont présentés comme la réponse à la PPD-B (moyenne des échantillons en double) moins la réponse aux seuls médias.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La production d'IFN-γ en culture analyses ELISPOT à long terme est généralement due à Tcm chez l'homme, mais la façon dont cette réaction se développe en culture est mal comprise. Que Tcm sont présents dans la circulation et l'expansion in vitro, ou si les réponses Tcm résultent de la différenciation des cellules effectrices et Tem en culture pendant Tcm est pas connue. Cependant, des études avec des échantillons provenant d'êtres humains ont constaté que les cellules ex vivo et de l'IFN-γ dosages ELISPOT culture à long terme T CD4 + ont des spécificités d'épitope indépendants, ce qui implique que les réponses Tcm ne développent pas de cellules effectrices 28. Il est évident que la durée de la réaction peut varier, mais si la clairance de l'agent pathogène est obtenue, par la suite la fois ex vivo et réponses Tcm diminuer. En outre, les réponses des cultures à long terme mesurés au début et à long antigénique après amorçage (lorsque la réponse effectrice est plus faible) est représentée en corrélation, indiquant que les populations de circulation Tcm tôt et bien après anti-amorçage reste génique in vivo est associée. D'autre part, l'amplitude de la réponse ex vivo ne semble pas être liée à l'amplitude de la réponse de la mémoire 29. Ces résultats suggèrent que les réponses en culture à long terme de l'IFN-γ ELISPOT résultent de l'expansion in vitro de Tcm et un déclin associé de réponses effectrices dans l'échantillon, au lieu de la différenciation des cellules effectrices dans Tcm phénotype.

Avec les bovins, la contribution relative des effecteurs et des sous-ensembles de mémoire détectée par les réponses à long terme des dosages ELISPOT IFN-γ est pas connue. Des études récentes indiquent une corrélation entre le vaccin a suscité culture IFN-γ réponses ELISPOT et la protection à long terme contre l'infection expérimentale subséquente avec M. bovis 23-24. Il a été rapporté que de faibles à long terme de l'IFN-γ ELISPOT les réponses à la vaccination sont associés à l'absence de protection 30. Tous deux vivent et tuentvaccins és induisent ex vivo IFN-γ ELISPOT des réponses similaires, mais la vaccination par le BCG vivant provoque à long terme de culture IFN-γ réponses ELISPOT forts que faire des préparations de vaccins tués. Fait intéressant, les vaccins vivants sont de protection tandis que les formulations tués ne parviennent pas à fournir une protection contre une infection par des souches virulentes de mycobactéries tuberculeuses 31-32, 33.

Évaluation des réactions Tcm est également possible par le tri de ces cellules à partir de PBMC. L'enrichissement direct de Tcm à partir de PBMC, cependant, nécessite des dispositifs coûteux, hautement qualifiés personnelle et il est difficile que ces cellules ne sont pas nombreux dans la circulation sanguine. Culture à long terme des CMSP fournit enrichissement de Tcm sur Tem et de cellules effectrices sans dispositifs coûteux; Cependant, parce que ces populations de cellules T sont développées in vitro, ils peuvent être moins représentatif des réponses in vivo de mémoire. Il est possible d'accéder à la mémoire des réponses IFN-γ de (en utilisant la culture à long terme ou de tri Tcming stratégies) par des essais autres que l'ELISPOT tels que: ELISA cytokines 34, tableaux cytokine de perles (ABC), coloration intracellulaire (ICS), ou réseaux de protéines de cytokines (CPA). Ces méthodes; cependant, sont généralement moins sensibles que Dosages ELISPOT 35.

Un avantage de ELISPOT est sa capacité à détecter la capture immédiate de la cytokine peu de temps après sa sortie empêchant dilution dans le surnageant et de la dégradation par clivage enzymatique ou cytokine absorption par d'autres cellules. tests ELISPOT détecter des cellules individuelles produisant des cytokines fournissant des résultats précis même en faible signal scénarios de bruit (faible réponses spécifiques) 35. En outre, avec ICS, la détection des cytokines avant de libérer peut provoquer une fausse identification de cellules produisant des cytokines (par ex., En raison de la modulation post-traductionnelle avant ou pendant le processus de sécrétion) 34. Les inhibiteurs de transport utilisés avec ICS essais pour minimiser la sécrétion de cytokinesau cours de la stimulation antigénique (connu sous le nom de protéines de butée Golgi) limiter la durée de la stimulation des cellules en raison de la toxicité cellulaire de ces protéines ayant un impact en fin de compte la production de cytokines 35.

Cela dit - ABC, CPA et ICS sont des techniques utiles pour mesurer des cytokines multiples simultanément et / ou pour la détermination de l'expression des marqueurs de surface cellulaire (par exemple, avec ICS.). Par conséquent, ces procédés peuvent être utilisés en combinaison avec l'IFN-γ ELISPOT 36 dosage. Alors que les études sur l'efficacité du vaccin contre la tuberculose bovine précédentes réponses mesurées Tcm via test ELISPOT, la détection des réponses Tcm par d'autres techniques donnera probablement des résultats comparables. Surtout, le test ELISPOT est moins cher et plus simple à réaliser que l'ABC, l'APC et d'analyse des ICS techniques 34. Comptage manuel de la SFC est une alternative au comptage automatisé, et des plaques ELISPOT peut être conservé à température ambiante pendant une longue période de temps avec une perte de qualité minimale, avant ou après place contage 37.

Le long terme de culture réponse ELISPOT IFN-γ a été appliquée pour évaluer les réponses de mémoire par des humains, et le bétail lors de l'évaluation des réponses de vaccin contre la tuberculose 14-16,31-32,33. réponses de Tcm sont également supposés jouer un rôle important dans les réponses de l'hôte de plusieurs autres agents infectieux de bovins, tels que:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma marginale 38 et virus respiratoire syncytial bovin 39. Potentiellement, le test ELISPOT à long terme pourrait être adapté à d'autres espèces animales, les cytokines et les infections. Ces applications plus larges seront particulièrement utiles pour les applications de l'immunologie vétérinaire en raison de la disponibilité limitée actuelle de réactifs spécifiques.

réponses de Tcm sont cruciales pour la protection contre plusieurs infections, mais les mesurer tôt après l'infection / vaccination (pour la prédiction des résultats de la maladie ou l'efficacité du vaccin) may être encombrant. Analyse de la réponse immunitaire ex vivo et sous des conditions de court stimulation antigénique représentera plus souvent des réponses effectrices, en raison du chevauchement des réponses effectrices de mémoire et, en particulier pendant le début de formation de la mémoire immunologique. Dans le contexte de maladies chroniques dans lesquelles la charge de l'antigène est continue, ex vivo des réponses vont évaluer les réponses des cellules effectrices ou une combinaison des réponses de mémoire et de cellules effectrices. Le long terme cultivées test ELISPOT IFN-γ, décrit ici, susceptibles permet la mesure des réponses Tcm plutôt que des cellules T effectrices ou des réponses de lymphocytes T CD4 + combinées. En résumé, la culture à long terme test ELISPOT IFN-γ présente une approche utile pour estimer des réponses T de mémoire de la cellule et a été utilisée avec succès pour évaluer les réponses de la mémoire de plusieurs espèces à divers agents infectieux 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

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La recherche a été soutenue par l'USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 et l'agriculture et de l'Initiative de recherche alimentaire concurrentiel Grant pas. 2011-67015-30736 de l'Institut national de l'alimentation et de l'agriculture USDA. Nous remercions Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, et Tracy Porter pour leur excellente assistance technique ainsi que Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers , Robin Zeisness, et David Panthen pour l'excellent soin et la manipulation des animaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Citrate de sodium (dihydraté)Divers
Acide citrique (monohydraté)Divers
DextroseDivers
Plaque PVDF ELISPOTDivers
Vectastain ABC &ndash ; AP KIT StandardVector LaboratoriesAK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate KitVector LaboratoriesSK-5300
Ag85ALionexLRP-0004.323, 24, 25, 37
TB 10.4LionexLRP-0061.623, 24, 25, 37
PPDbPrionics AG7600055
rESAT-6 :CFP10Cadeau aimable Dr. Minion, Iastate23, 24, 25, 27,  ; 37
Souris anti-bovine IFN-&gamma ; Clone CC302SerotecMCA1783B23, 24, 25, 27,  ; 37
Souris anti-bovine IFN-&gamma ; Clone biotinylé CC330SerotecMCA211223, 24, 25, 27,  ; 37
Souris anti-bovine CD4 Clone CC8SerotecMCA1653GA
Souris anti-bovine CD45RO Clone IL116ASerotecMCA2434GA
Rat anti-humain CCR7 Clone 3D12Abcamab95665
Souris anti-bovine IFN-&gamma ;-Pe Clone CC302SerotecMCA1783PE
Chèvre anti-souris IgG2a- Alexa Fluor 350InvitrogenA-21130
Chèvre anti-souris IgG3 APC-CY7SouthernBiotechnology1080-193
Chèvre anti-rat IgG-APCInvitrogenA10540
BD Cytofix/Cytoperm&trade ;BD Biosciences554714
BrefeldinASigma-AldrichB7651
Pokeweed MitogenSigma-AldrichL8777
Recombinat human Interleukin 2Sigma-AldrichI7908

Références

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Mots-clés

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