Conception et construction de la matrice extracellulaire artificielle (AECM) Protéines de Escherichia coli Pour l'ingénierie tissulaire de la peau

Résumé

Les technologies recombinantes ont permis aux concepteurs de matériaux de créer de nouvelles protéines artificielles avec des fonctionnalités personnalisées pour des applications d’ingénierie tissulaire. Par exemple, les protéines de la matrice extracellulaire artificielle peuvent être conçues pour incorporer des domaines structurels et biologiques dérivés des ECM natifs. Ici, nous décrivons la construction et la purification de protéines aECM contenant des répétitions de type élastine.

Résumé

La technologie recombinante est une plate-forme polyvalente pour créer de nouvelles protéines artificielles aux propriétés réglables. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses protéines artificielles qui ont incorporé des domaines fonctionnels dérivés de la nature (ou créés de novo) ont été signalées. En particulier, des protéines de matrice extracellulaire artificielle (aECM) ont été développées ; ces protéines aECM sont constituées de domaines biologiques extraits de la fibronectine, des laminines et des collagènes et sont combinées avec des domaines structurels, notamment des répétitions de type élastine, des répétitions de soie et de collagène. À ce jour, les protéines aECM ont été largement étudiées pour des applications en ingénierie tissulaire et en réparation de plaies. Récemment, Tjin et ses collègues ont développé des protéines aECM spécifiques à l’intégrine conçues pour favoriser l’attachement et la propagation des kératinocytes de la peau humaine. Dans leur travail, les protéines aECM incorporent des domaines de liaison cellulaire provenant de la fibronectine, de la laminine-5 et du collagène IV, ainsi que des répétitions flanquantes de type élastine. Ils ont démontré que les protéines aECM développées dans leurs travaux étaient des candidats prometteurs pour une utilisation comme substrats dans la peau artificielle. Ici, nous décrivons la conception et la construction de ces protéines aECM ainsi que leur processus de purification en utilisant les caractéristiques thermosensibles de l’élastine.

Introduction

Depuis plusieurs décennies, des matériaux synthétiques et naturels ont été explorés pour être utilisés comme échafaudages dans l’ingénierie tissulaire^1,2. Bien que les matériaux synthétiques tels que les polymères offrent une excellente intégrité structurelle et des propriétés mécaniques réglables, ils ont souvent une bioactivité insuffisante pour favoriser la croissance et l’infiltration des tissus. D’autre part, les matériaux naturels tels que les protéines de matrice extracellulaire (ECM) ont une excellente activité biologique, mais présentent des limites telles que la variabilité d’un lot à l’autre, une dégradation rapide et des problèmes d’immunogénicité. En tant que telles, les protéines recombinantes sont souhaitées, car elles peuvent être conçues pour imiter uniquement les propriétés souhaitables des protéines natives^3,4.

L’ingénierie des protéines recombinantes a suscité un grand intérêt en tant que plate-forme polyvalente pour la conception et la production de nouveaux biopolymères de protéines artificielles. En contrôlant la séquence génétique, les fonctionnalités des protéines artificielles peuvent être adaptées à une grande variété d’applications^5,6. En particulier, les protéines de la matrice extracellulaire artificielle (aECM) peuvent être adaptées pour avoir de multiples fonctionnalités pour des applications dans l’ingénierie tissulaire, la régénération et la réparation des plaies^2,7. Plus important encore, les progrès des technologies de clonage et de purification ont augmenté l’évolutivité et réduit considérablement le coût de fabrication des protéines recombinantes. Il est possible de produire de grandes quantités de protéines recombinantes à de faibles coûts de production et économiques pour une utilisation en clinique⁵.

Des protéines de matrice extracellulaire artificielle ont été développées pour des applications d’ingénierie tissulaire^8-11. Par exemple, Tirrell et al. ont conçu une greffe vasculaire de petit diamètre à l’aide de protéines artificielles contenant la séquence CS5 de la fibronectine et des répétitions semblables à l’élastine (ELP-CS5). Ils ont montré que les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) étaient capables d’adhérer et de se développer sur ces matériaux¹². D’autres ont également incorporé de courtes séquences bioactives tirées de la fibronectine, du collagène, de la laminine, du fibrinogène et de la vitronectine, ainsi que des domaines structurels qui imitent l’élastine, la soie d’araignée et les collagènes pour créer une variété de protéines de fusion¹⁰. Les films réticulés en vrac fabriqués à partir de protéines aECM à base d’élastine présentaient également des propriétés mécaniques similaires à celles de l’élastine native (les modules élastiques varient entre 0,3 et 0,6 MPa)¹³. Par la suite, il a également été rapporté que les protéines aECM contenant des fragments de fibronectine plus longs accéléraient la cicatrisation des plaies in vitro en raison de l’augmentation des affinités de liaison à l’intégrine⁸.

Récemment, des protéines ECM artificielles spécifiques à l’intégrine ont été développées par Tjin et ses collègues¹⁴. Chaque protéine aECM contient un domaine de liaison cellulaire bioactif provenant de composants ECM de la peau humaine native^2,7,15, tels que la laminine-5, le collagène-IV et la fibronectine. Par exemple, il a été démontré que l’intégrine α₃Β₁ se lie à la séquence PPFLMLLKGSTR trouvée dans la chaîne laminine-5 alpha-3 du domaine globulaire 3 (LG3)^16,17. Dans leur rapport, ils ont montré que les kératinocytes épidermiques primaires de la peau humaine engagent préférentiellement différentes intégrines pour se lier à chacune des protéines aECM, en fonction du type de domaine de liaison cellulaire présent.

Les protéines aECM discutées dans les travaux de Tjin et al. contiennent des domaines flanquants de type élastine {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG₎₂}₈ qui confèrent une élasticité qui imite les propriétés mécaniques de la peau humaine. De plus, l’incorporation de résidus de lysine dans les répétitions de type élastine augmente également la solubilité globale des protéines dans les solvants aqueux. De plus, les résidus de lysine servent également de sites de réticulation pour faciliter la formation de films aECM réticulés¹². L’inclusion de répétitions semblables à l’élastine dans la séquence protéique aECM permet aux protéines d’être facilement purifiées via le cycle de transition inverse (ITC)¹⁴. Les élastines subissent une transition de phase brusque et réversible à une température spécifique connue sous le nom de température de solution critique inférieure (LCST) ou de température de transition inverse (T_t)^18-20. Les élastines et les répétitions similaires à l’élastine adoptent des conformations de bobines aléatoires hydrophiles en dessous de leur LCST et deviennent solubles dans l’eau, tandis qu’au-dessus de leur LCST, les élastines s’agrègent rapidement en particules de taille micronique. De telles transitions de phase sont réversibles et peuvent donc être exploitées pour permettre aux protéines aECM à base d’élastine d’être facilement purifiées via la technique ITC²¹.

Dans ce travail, nous rapportons une procédure généralisée pour concevoir, construire et purifier des protéines ECM artificielles contenant des domaines de liaison cellulaire bioactifs, fusionnés à des répétitions similaires à l’élastine. Le processus de conception et de clonage des plasmides qui codent pour les séquences d’acides aminés des protéines aECM est décrit. Les étapes de purification des protéines aECM à l’aide de l’ITC sont décrites. Enfin, les méthodes de détermination de la pureté des protéines aECM obtenues à l’aide de l’électrophorèse SDS-PAGE et du Western Blot sont discutées.

Protocole

1. Clonage de plasmides recombinants Encodage pour AECM Protéines

1. Conception de la séquence d'acides aminés du domaine fonctionnel (par exemple, le domaine de liaison aux cellules et d'élastine répétitions analogues). les sites de restriction flanquant design les extrémités des domaines fonctionnels pour faciliter la sous-clonage en utilisant le logiciel libre selon l'une des instructions de logiciel (par exemple, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Ici, sélectionner des sites de restriction uniques qui ne sont pas présents dans le domaine fonctionnel de limiter la digestion des sites destinés. Choisissez sites de restriction qui apparaissent dans le site de clonage multiple (MCS) du vecteur hôte (par exemple, pET22b (+)) pour le sous-clonage.
2. Inverser traduire la séquence d'acides aminés dans la séquence de nucleotides en utilisant des sites libres selon les instructions du logiciel. (Par exemple, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Assurer codons sont optimisés pour E. coli hôtes.
3. Gène d'intérêt peut être Purchasoligonucléotides échoués ed commercialement comme simples (par exemple, si les oligonucléotides <100 paires de bases (pb)) et effectuer l'ADN recuit (voir l'étape 1.4) afin de réduire le coût. Sinon, pour les gènes de plus de 100 pb, ils pourraient être achetés par les sociétés commerciales.
4. ADN annelage des oligonucleotides
   1. Recuire les oligomères d'ADN pour obtenir la séquence de gène souhaité. Dissoudre oligonucleotides d'ADN dans un tampon d'ADN oligomère (Tris 10 mM: 2-amino-2- (hydroxyméthyl) -propane-1,3-diol, pH 8,0, filtré) jusqu'à une concentration finale de 1 pg / pl.
   2. Ajouter 4 ul de chaque oligomère à 32 pi de tampon d'hybridation d'ADN (Tris 10 mM, NaCl 100 mM et _MgCl2 100 nM) afin d'obtenir un mélange total de 40 ul.
   3. Faire bouillir un bécher d'eau en utilisant une plaque de cuisson et plongez le mélange pendant 5 min, 95 ° C. Retirer le bécher et refroidir progressivement l'ensemble mis en place dans une boîte en polystyrène O / N. Les oligomères ont été recuit et sont prêts pour la digestion.
5. Ajouter les enzymes de restriction correspondantes pour digérer les oligomères recuites (ie, dénommée insert) et vecteur hôte (par exemple, pET22b (+)) séparément. Utiliser la recette suivante (1-2 ug d'ADN, 2 ul de chaque enzyme de restriction, 5 ul de tampon de l'enzyme de restriction 10x, et de l'eau jusqu'à un mélange total 50 ul) pour 3-4 heures à 37 ° C.
   NOTE: Le pET22b (+) vecteur plasmidique est antibiotique ampicilline-résistant et contient une 6x-His à l'extrémité C-terminale. Le 6x-His présent dans pET22b (+) nous permet d'utiliser ses anticorps marqués pour identifier la protéine cible par western blot à l'étape 7.
6. Ajouter 6x colorant de chargement de chaque mélange de digestion. Exécuter les mélanges de digestion comprenant séparément une échelle d'ADN de 1,2% de gels d'ADN d'agarose contenant un colorant d'ADN fluorescent aux UV pendant 1 heure à 100 V. Visualiser le gel d'agarose d'ADN de 1,2% avec un illuminateur UV.
7. Trancher le gel pour extraire les produits de ADN digéré en utilisant des kits de purification de gel commerciale. Elute en utilisant le volume minimum de la colonne pour obtenir une concentration minimum d'ADN de 50-100 ng / ul.
8. Moissonneuse le gène d'intérêt séquentiellement par ligature l'insert d'ADN digéré (par exemple, des répétitions d'élastine ou des domaines de liaison de cellules obtenues par l'ADN recuit) dans le vecteur plasmidique en utilisant la ligase de T4 en utilisant la recette suivante: (2 pi de vecteur, 1 pi de ligase de T4, 1,5 pi de tampon de ligature T4, x ul de l'insert, 10,5 pi x-eau pour un mélange total 15 ul). Incuber le mélange de ligature à la température ambiante pendant 2 heures.
   NOTE: concentration molaire de vecteur à insérer doit être modifiée pour optimiser l'efficacité de ligature. Volume de l'insert comme décrit dans la recette x dépend de la concentration de l'ADN élué à l'étape 1.7.
9. Thaw E. coli DH5a cellules chimiquement compétentes (ou toute souche de clonage) sur de la glace. Des plaques de gélose YT 2x chaud (tableau 1) contenant de l'ampicilline (25 ug / ml) à 37 ° C.
10. Transformer les cellules en utilisantchoc thermique:
    1. Aliquote de 50 pi de cellules compétentes dans des tubes micro-centrifugeuse propres, pré-réfrigérés. Introduire à la pipette 5 ul (entre 100 pg à 100 ng) du mélange de ligation dans les cellules, le pipetage de haut en bas doucement pour mélanger. Laisser le mélange sur de la glace pendant 20 min.
    2. Immerger le tube de micro-centrifugation contenant le mélange de cellules dans un bain d'eau à 42 ° C pendant 2 min et est retourné à la glace pendant 2 min. Chronométrer le temps d'immersion pour minimiser les dommages de la chaleur vers les cellules.
    3. Ajouter 500 ul de milieu SOC (tableau 1) dans le tube de micro-centrifugeuse et incuber à 37 ° C avec agitation par secousses pendant 1 heure.
    4. Diffuser 50 500 ul du mélange de cellules / ligation sur une plaque de gélose YT 2x qui a été pré-chauffé à la température ambiante, contenant de l'ampicilline (25 ug / ml) et on incube les plaques à l'envers à 37 ° CO / N (12-16 h) .
11. Le lendemain, ramasser colonies d'ADN provenant de la plaque de gélose en utilisant des embouts de pipette propres. Développer les colonies dans 5 ml de milieu 2YT (tableau1) contenant de l'ampicilline (25 pg / ml) O / N à 37 ° CO / N (12 à 16 h) sous agitation (225 rpm).
12. Le jour suivant, utiliser un kit d'isolement de plasmide pour extraire les plasmides d'ADN de chaque colonie choisi selon le protocole du fabricant. Eluer l'ADN avec 50 ul d'eau.
13. Effectuez un test digérer avec des enzymes de restriction en utilisant la recette suivante: (ADN 5 pi, 0,2 pi de chaque enzyme de restriction, tampons de l'enzyme 1 ul 10x de restriction et l'appoint d'eau pour un mélange total de 10 pi), incuber pendant 2 heures à 37 ° C à l'écran pour les colonies qui contiennent probablement l'insert et sur un gel de l'ADN d'agarose à 1,2% comme dans l'étape 1.6.
    REMARQUE: Lors de la digestion, d'une ligature réussie devrait les résultats dans deux bandes, une pour chaque vecteur et insert qui correspondent à leur poids moléculaire respectif (Figure 1).
14. Envoyer les colonies probables pour le séquençage de l'ADN en utilisant le promoteur T7 amorces sens et antisens à séquenceurs commerciales.

2. La transformation du plasmide recombinant dans l'hôte d'expression bactérienne

1. A partir du résultat de séquençage, sélectionner une colonie qui a été ligaturé avec succès et en utilisant le plasmide d'ADN pour la transformation dans un E. hôte d'expression coli.
2. Thaw E. coli souche d'expression (BL21 (DE3) pLysS) sur de la glace. Pendant ce temps, des plaques d'agar contenant de l'ampicilline chaudes (25 ug / ml) et du chloramphenicol (34 ug / ml) à TA.
   NOTE: Le plasmide pLysS présent dans les bactéries souche BL21 (DE3) pLysS contient un gène de résistance au chloramphénicol. Le plasmide pLysS contient un gène de répresseur T7 qui est exprimé de manière constitutive à limiter l'expression de la protéine qui fuit AECM. Le chloramphénicol est nécessaire de sélectionner les cellules bactériennes qui contiennent pLysS au cours de la culture.
3. Répétez l'étape 1.10 pour obtenir transformé E. cellules de E. coli qui sont prêts à exprimer les protéines artificielles. Enveloppez plaques d'agar dans Parafilm et stocker à l'envers dans 4 6; C pendant jusqu'à un mois.

3. Expression bactérienne de l'AECM Protéines

1. Reportez-vous à la figure 2, choisir une colonie à partir de la plaque de gélose transformée avec une pointe de pipette et l'inoculer dans 10 ml de bouillon Terrific (TB) milieux stériles (tableau 1) contenant de l'ampicilline et les antibiotiques de chloramphénicol dans un tube à essai. Incuber cette culture de départ à 37 ° CO / N (12-16 h) avec agitation à 225 rpm.
2. Transfert 10 ml de la culture de départ dans 1 litre du milieu frais et stériles TB supplémenté avec les mêmes antibiotiques dans un flacon Erlenmeyer de 3 litres. Incuber la culture à 37 ° C sous agitation à 225 tours par minute pendant 2-3 heures et observer la densité optique de la culture (OD ₆₀₀₎ atteint 0,6-0,8 par pipetage 1 ml de la culture dans une cuvette vide pour la lecture. Enregistrer 1 ml de culture avant l'induction pour SDS-PAGE caractérisation.
   1. Pour mesurer DO ₆₀₀ de la culture cellulaire, préparer 1 flacon de médias de la tuberculose dans une cuvettepour une mesure à blanc. Séparément, transférer 1 ml de la culture de la fiole de culture dans une nouvelle cuvette vide. Mesurer la densité optique de la culture en utilisant un spectrophotomètre par rapport au témoin à blanc à une absorbance de 600 nm.
   2. Économisez de l'échantillon (pour analyse ultérieure SDS-PAGE) en transférant les 1 ml d'échantillon de la culture dans un tube de 1,5 ml, centrifuger à 12 000 g pendant 2 min et décanter le surnageant.
3. Induire la culture avec isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et on incube à 37 ° C sous agitation à 225 tours par minute pendant 4 h un autre. Enregistrer 1 ml de la culture à la fin de l'induction à 4 h pour SDS-PAGE caractérisation.
4. Récolter les cellules par transfert de la culture à 1 L flacons de centrifugation et centrifuger à 12 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Jeter le surnageant, peser les culots de cellules et remettre en suspension dans un tampon TEN (1 M de Tris, 0,01 M d'EDTA, 0,1 M de NaCl, pH = 8,0) à 0,5 g / ml.

4. lyse des cultures bactériennes

1. Geler la culture de cellules remises en suspension à -80 ° CO / N. Décongeler la culture de cellules congelées dans un bain d'eau à température ambiante ou sur de la glace pour lyser les cellules. Ajouter 10 ug / ml de désoxyribonucléase I (DNase I), 10 ug / ml de ribonucléase A (RNase I), et 50 ug / ml de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) pendant la décongélation et homogénéiser la solution sous agitation lente.
2. Une fois que toutes les cellules remises en suspension sont décongelés, ajuster la solution à un pH de 9,0 à augmenter la solubilité de la protéine dans de l'eau ^12. Ajouter NaOH 6 N goutte à goutte sous agitation sur de la glace pour obtenir une consistance homogène. Lyse par la perturbation ultrasons pendant 20 min sur la glace en utilisant un diamètre pointe plate de 2 mm, 5 impulsion de sec.
3. Centrifuger la solution de cellules à 12.000 g pendant 30 min à 4 ° C. Transférer le surnageant, une bouteille et un magasin vide propre à 4 ° C pour la purification plus tard.
4. Pendant ce temps, la remise en suspension de nouveau le culot cellulaire avec un tampon TEN et re-congélation à -80 ° C. Àlyse cellulaire complète, répétez gel / dégel et sonication processus jusqu'à trois fois. Économisez 20 lysat cellulaire pi pour SDS-PAGE caractérisation.

5. Purification de protéines en utilisant l'AECM inverse transition vélo

1. Rassembler le lysat cellulaire de l'étape 4.3 et passez à purifier les protéines AECM utilisant ITC, similaire à celle utilisée pour la purification de protéines à base d'élastine ^21. Cycles seront effectuées avec les différentes températures qui sont de 4 ° C (appelés «à froid») et 37 ° C (appelés "chaudes") cycles, respectivement.
2. Diviser le lysat cellulaire dans 50 ml des flacons de centrifugation, et centrifuger à 40 000 g pendant 2 h à 4 ° C. L'apparition de la pastille cellulaire devrait être brun foncé et de regarder qui coule.
3. Eliminer le surnageant par pipetage pour obtenir une séparation nette du culot. Récupérer le surnageant dans des flacons à centrifuger propre et ajouter NaCl à une concentration finale de 1 M (pour un maximum de 3 M). Chaleureuxla solution à 37 ° C pendant 2 heures sous agitation à 225 tours par minute.
   NOTE: L'addition de NaCl va déclencher la transition de la composante de l'élastine provoquant l'agrégation AECM. Le surnageant deviendra trouble. Si la concentration en protéine est suffisamment élevée, la protéine de blanc mousseux peut être vu sur les côtés de la bouteille de centrifugeuse.
4. Centrifuger le surnageant de l'étape 5.3 à 40.000 g pendant 2 heures à 37 ° C. Décanter le surnageant. Écraser la pastille à l'aide d'une spatule métallique et remettre les morceaux de boulettes dans l'autoclave de l'eau distillée glacée (50 mg / ml) avec agitation vigoureuse O / N à 4 ° C en utilisant une barre d'agitation magnétique et la plaque. Le culot doit être complètement dissous.
5. Répéter les étapes 5.2 à 5.4 pendant trois à cinq fois pour obtenir une plus grande pureté de la protéine.
6. Après le cycle final de purification, dessaler la solution de protéine par dialyse contre de l'eau distillée à 4 ° C. Dialyser solution de protéines contre l'eau pendant 2-3 jours avec des changements dans l'eau tous les 4h ou 8 h pour O / N. Économisez 20 pi de la protéine purifiée pour SDS-PAGE et lyophiliser le reste de la protéine purifiée et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

6. Caractérisation des protéines en utilisant l'AECM Electrophorèse SDS-PAGE

1. Préparer un gel SDS-PAGE 12% (si le poids moléculaire est grande, utiliser 8% de gels de SDS-PAGE pour une meilleure séparation). Ajouter tampon 2x de chargement SDS à chaque échantillon, chauffer les échantillons pendant 10 min à 100 ° C et analyser des échantillons sur le gel pendant 1 heure à 100 V ou jusqu'à ce que l'échelle de la protéine correspondant au poids moléculaire de la protéine AECM atteint le milieu de la gel.
2. Récupérer le gel de la SDS-PAGE mettre en place et ajouter du bleu de Coomassie tache (tableau 2) avec un volume de submerger le gel pendant 1 h dans une boîte de Petri. Rincer gel dans une solution de décoloration (tableau 2) pendant 5 minutes sur une bascule. Changer la solution de décoloration, et de continuer à décolorer le gel avec bascule jusqu'à ce que le fond de la til devient clair gel. Les bandes de protéines doivent être clairement visibles.
3. Comparer la position de la protéine cible contre l'échelle de la protéine pour déterminer le poids moléculaire de la protéine cible.
4. Pour confirmer en outre la présence de la protéine cible, effectuer un transfert de Western comme à l'étape 7.

7. Caractérisation des protéines en utilisant l'AECM Western Blot

1. Exécutez les échantillons sur un gel SDS-PAGE à 12%, comme dans l'article 6, sans taches.
2. Couper une membrane de nitrocellulose à une taille légèrement plus grande que le gel SDS-PAGE. Coupez quatre morceaux de papier filtre à la même taille.
3. Wet un morceau de papier filtre avec transfert Western tampon (20% v / v de méthanol, Tris 25 mM, glycine 190, pH 8,3), placer le gel SDS-PAGE sur le dessus du papier filtre, suivi par un autre morceau de papier filtre , puis la membrane de nitrocellulose et une finale autres deux morceaux de papier-filtre. Assurer l'ensemble set-up est submergé avec un tampon de transfert ouest suffisante.
   NOTE: Le gel et la membrane ne doivent pas être en contact à ce point du temps que les protéines pourraient se lier à la membrane au contact.
4. Transférer les protéines sur la membrane de nitrocellulose en plaçant deux papiers-filtres dans une unité de transfert semi-sec occidentale, suivie par la membrane de nitrocellulose, et placer soigneusement le gel SDS-PAGE à l'intérieur et sur la membrane, placer enfin les deux derniers papier filtre humide sur le gel SDS-PAGE. Exécutez le transfert ouest à 45 mA, 30 min. Ajouter tampon si la tension est supérieure à 30 V.
   REMARQUE: De préférence, placer le gel SDS-PAGE sur la membrane avec une tentative et éviter de déplacer inutilement le gel sur la membrane sous forme de protéines peuvent se lier à la membrane au moment du contact.
5. Récupérer et bloquer la membrane de nitrocellulose avec une solution de blocage (5% de lait écrémé dans du PBS pH 7,4, filtré avec un papier filtre) pendant 2 heures à la température ambiante. Éliminer tampon bloquant et ajouter PBS pour rincer.
   NOTE: Changer pour de nouveaux gants pour éviter la contamination de la membrane avec prote indésirablesins.
6. Incuber primaire anticorps anti-His avec dilution dans du PBS à 1: 1 000 à température ambiante pendant 1 h avec bascule. Préparer un mélange dans un volume qui peut submerger l'ensemble membrane, par exemple, avec un rapport de dilution de 1: 1000, ajouter 1 pl d'anticorps (concentration de valeurs: 1 mg / ml) à 999 ul de PBS pour un 1 ml mélange total.
7. Rincer la membrane avec 5 ml de PBST (PBS avec 0,1% de Tween 20).
8. Incuber avec l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) avec une dilution dans du PBS à 1: 5,000 à TA pendant 1 h à bascule. Préparer un mélange dans un volume qui pourrait plonger l'ensemble membrane, par exemple, avec un rapport de dilution de 1: 5000, ajouter 1 pl de l'anticorps (concentration du stock: 1 mg / ml) à 4999 pi de PBS pour un 5 ml mélange total.
9. Laver la membrane avec 5 ml de PBST et répéter deux fois.
10. Appliquer le substrat chimioluminescent à la membrane avec un volume pour couvrir la membrane et incuber en suivant les instructions pour le substrat utilisé.
    NOTE: La sensibilité du substrat à la détection de protéines peut varier, nous vous conseillons un substrat avec une sensibilité maximale pour les signaux très faibles dans le cas augmentation de la concentration d'anticorps ne pas augmenter signaux.
11. Capturez les signaux chimiluminescents en utilisant un imageur caméra CCD. Ajustez le taux d'anticorps dilution primaire et secondaire si les signaux sont faibles et non spécifique. Incuber plus dans la solution de blocage si le signal de fond est élevé.

Résultats

Lors de la conception des protéines de fusion contenant des séquences répétées en élastine analogue, il est important de maintenir une teneur en élastine dans l'ensemble, assez grande fraction de la protéine de fusion ^18. Ceci afin d'assurer que la construction de la protéine de fusion conserve ses caractéristiques de type élastine, afin d'utiliser l'ITC pour la purification. La conception et les séquences décrites dans cette section protéines AECM ont été spécifiquement pris de l'ouvrage de Tjin et al. <...

Discussion

Recombinant ingénierie des protéines est une technique polyvalent pour créer de nouveaux matériaux de protéines en utilisant une approche bottom-up. Les matériaux à base de protéines peuvent être conçues pour avoir de multiples fonctionnalités, adaptées en fonction de l'application d'intérêts. En raison de l'augmentation progrès dans les technologies de clonage et d'expression de protéine, il est devenu relativement simple (et rentable) pour créer une variété de protéines artificielles de façon reproduct...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
de pET22b (+)	Novagen	69744	T7 résistant à l’ampicilline  ;
BL21(DE3)pLysS  ;	Invitrogen	C6060-03	antibiotiques supplémentaires - chloramphénicol
Isopropyl-bêta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M solution mère avec de l’eau autoclave, faire frais avant l’induction.
QIAprep Spin Miniprep	Kit Qiagen	27106	kit d’isolement plasmidique
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicilline	Affymetrix	11259
Chloramphénicol	Affymetrix	23660
Zymoclean&trade ; gel Kit de récupération d’ADN	Zymo Research	D4001
XL10-gold souche	Agilent Technologies	200315