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Article de méthode

Dépistage denrées alimentaires pour les intégrons de classe 1 et Gene Cassettes

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⸱

DOI :

10.3791/52889

⸱

19 juin 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la détection des intégrons de classe 1 et de leurs cassettes de gènes associées dans les denrées alimentaires.

Résumé

La résistance aux antibiotiques est l’une des plus grandes menaces pour la santé au 21esiècle. L’acquisition de gènes de résistance par transfert latéral de gènes est un facteur majeur dans la propagation de divers mécanismes de résistance. Parmi les éléments de l’ADN facilitant le transfert latéral, les intégrons de classe 1 ont été en grande partie responsables de la propagation des déterminants de la résistance aux antibiotiques parmi les agents pathogènes à Gram négatif. Au total, ces intégrons ont acquis et disséminé plus de 130 gènes de résistance aux antibiotiques différents. Avec l’utilisation continue d’antibiotiques, les intégrons de classe 1 sont devenus omniprésents dans les commensaux et les agents pathogènes des humains et de leurs animaux domestiques. En conséquence, ils peuvent maintenant être trouvés dans tous les flux de déchets humains, où ils continuent d’acquérir de nouveaux gènes et ont le potentiel de revenir à l’homme via la chaîne alimentaire. Ce protocole détaille une approche simplifiée pour la détection des intégrons de classe 1 et de leurs cassettes de gènes de résistance associés dans les denrées alimentaires, par culture et PCR. À l’aide de ce protocole, les chercheurs devraient être en mesure de : collecter et préparer des échantillons pour faire des cultures enrichies et dépister les intégrons de classe 1 ; isoler des colonies bactériennes uniques pour identifier les isolats positifs aux intégrons ; identifier les espèces bactériennes qui contiennent des intégrons de classe 1 ; et caractériser ces intégrons et leurs cassettes de gènes associées.

Introduction

La découverte des antibiotiques a été l'une des plus grandes réalisations scientifiques du 20 ème siècle. Cependant, l'utilisation et l'abus des antibiotiques a conduit à l'évolution rapide des bactéries résistantes aux antibiotiques, et ceux-ci pose maintenant une menace sérieuse pour la santé publique dans le 21 e siècle. La hausse de souches bactériennes résistantes à la plupart des options de traitement soulève la possibilité que nous entrons dans une ère où les médicaments antimicrobiens ne sont plus efficaces 1,2.

Le mécanisme génétique qui confère une résistance aux antibiotiques est un ancien système, précédant les humains et les pressions de sélection antibiotiques par des millions d'années 3. Éléments génétiques mobiles, tels que les plasmides, les transposons, îlots génomiques, les éléments et les intégrons conjugatifs intégratives peuvent diffuser des gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) à l'intérieur et entre les espèces bactériennes 4. Parmi ceux-ci, intégrons ont joué un rôle central dans la propagation de l'ARG, malgré lafait qu'ils reposent sur ​​des plasmides et des transposons pour la mobilisation et l'insertion dans les génomes bactériens 5. Les intégrons capturer cassettes de gènes en utilisant une intégron-intégrase, puis expriment cassettes en utilisant un promoteur intégron codé 6,7 (Figure 1). Integron gène cassettes sont de petits éléments mobiles constitués de simples cadres de lecture ouverts (ORF) dont les produits peuvent conférer une résistance aux antibiotiques ou de désinfectants 8. Intégrons de classe 1 sont les intégrons le plus souvent récupérées à partir d'isolats cliniques 5, où ils ont acquis collectivement plus de 130 différentes cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques 9.

La propagation de la classe 1 intégrons dans commensales et bactéries pathogènes humains associés génère des flux de déchets humains qui contiennent un grand nombre de ces éléments génétiques 10. On estime à 10 19 bactéries qui contiennent intégrons de classe 1 sont libérés par les boues chaque année in le Royaume-Uni 11. Il est donc pas surprenant que les intégrons de classe 1 conférant des résistances aux antibiotiques sont maintenant détectés dans le microbiote des oiseaux sauvages, de poissons et d'autres animaux sauvages indigènes de 12-14. Libérer intégrons dans l'environnement constitue une menace importante pour la santé publique, depuis l'acquisition de nouvelles cassettes de gènes et des réarrangements complexes avec d'autres éléments mobiles continue à se produire, en particulier dans les stations d'épuration et d'autres plans d'eau 15-18. L'environnement naturel devient alors un terrain fertile pour le recrutement de nouveaux déterminants de la résistance et des pathogènes opportunistes 19,20. Bactéries contenant de intégron-nouveaux et de nouvelles ARG peuvent encercler retour dans la communauté humaine à travers l'eau et les aliments contaminés 21,22. Surveillance de l'environnement ARG est une stratégie clé pour la compréhension et la gestion de la résistance aux antibiotiques dans l'avenir 23. En particulier, l'attention devrait être accordée aux denrées alimentaires qui sont consommés crus oulégèrement cuits, puisque ceux-ci présentent la plus grande menace pour la transmission de nouveaux éléments mobiles et des agents pathogènes.

Dans ce protocole, une approche simplifiée pour détecter, identifier et caractériser les intégrons de classe 1 et leurs cassettes de gènes associés dans les denrées alimentaires sont décrits (Figure 2). En utilisant une combinaison de la réaction et de la culture en chaîne par polymérase (PCR), intégrons peuvent être détectés rapidement dans les communautés bactériennes complexes et les isolats individuels. Des procédés pour l'identification des espèces de bactéries et de la conformation et de l'identité des cassettes de gènes associés à intégron sont donnés. La méthode est adaptée pour une large gamme d'aliments végétaux et animaux, et des exemples de workflows typiques sont donnés pour chacun de ces types d'aliments.

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Protocole

Les denrées alimentaires qui sont consommés crus ou légèrement cuits sont des plus préoccupantes pour la santé humaine. Les exemples incluent la salade de légumes, les fruits, les coquillages et les crustacés.

Collection 1. Echantillon

  1. Prélever des échantillons dans des conditions qui minimisent la contamination, et stockées dans des sacs propres, séparés pendant le transport. Une fois collectés, les échantillons doivent être conservés à 4 ° C et traitées dans les 24 heures.

2. Culture préparation enrichie

  1. Fruits et légumes:
    1. Placer environ 10 g de matière dans un sac en plastique durable. Si le traitement des matériaux plus volumineux, se concentrer sur la peau du fruit ou du légume. Ajouter 90 ml 0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,0 et processus dans un malaxeur à pales pendant 30 sec. Alternativement, le matériau peut être agité manuellement si un mélangeur à aubes ne sont pas disponibles.
    2. Recueillir le liquide en deux 50 ml tubes Falcon. Tubes à centrifuger à 4000 g pendant 7 min pour bactéries de pellets.
    3. Retirer délicatement le surnageant et suspendre les bactéries en culot dans 30 ml de bouillon Luria Bertani stérile (LB).
    4. Incuber sur un agitateur O / N, tenant un tube à 25 ° C et l'autre à 37 ° C. Les cultures doivent être secoués à 200 oscillations par minute (OPM). cultures de conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  2. Fruits de mer:
    1. Disséquer l'estomac (huîtres) ou le tube digestif (de crevettes) à l'aide de pinces et pinces stériles et la placer dans un tube de 1,5 ml stérile contenant 200 ul de 0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,0. Laisser macérer l'échantillon pour créer un homogénat.
    2. Distribuer 5 ml de bouillon LB en deux stériles tubes de 5 ml, et ensemencer chacun avec le broyat de fruits de mer.
    3. Incuber sur un agitateur O / N, tenant un tube à 25 ° C et l'autre 37 ° C. Les cultures doivent être secoués à 200 cpm. cultures de conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

3. Cultures de dépistage pour intégrons

Remarque: les protocoles de PCR standard sont utilisées tout au long de cette méthode, en utilisant les tampons fournis avec l'enzyme, et une concentration finale de MgCl2 2,5 mM. Si nécessaire, Lorenz (2011) 24 a indiqué PCR optimisation et de dépannage méthodes dans un numéro précédent de cette revue.

  1. Boiled préparation de l'ADN:
    1. Distribuer 100 ul de culture enrichi en 0,5 ml tube stérile PCR. Chauffer l'échantillon à 99 ° C pendant 10 min, en utilisant un bain-marie ou un bloc chauffant. Enclenchez froid sur la glace pendant 2 min.
    2. Microcentrifugeuse à 14 000 g pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires. Retour à la glace. Des échantillons d'ADN peuvent être congelés à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire, mais doivent être décongelés sur de la glace.
  2. Le dépistage de la classe 1 intégrons par PCR:
    NOTE: cultures mixtes de la O / N incubation sont criblés pour intégrons de classe 1 utilisant le protocole HS463a / HS464 PCR (Tableau 1).
    1. Décongeler tous les réactifs PCR sur la glace, loin de toute sou potentielrces de l'ADN contaminant. Maquillage 48 pi mastermix PCR par échantillon, y compris les contrôles négatifs (tableau 2). Distribuer 48 pi de mélange maître PCR dans chaque tube, à l'aide des conseils de barrière.
    2. Ajouter 2 ul d'ADN décongelés dans des tubes de PCR individuels à l'aide des conseils de barrière. Exécutez programme approprié dans le thermocycleur.
    3. Pour évaluer les résultats de l'amplification, l'électrophorèse 7 pi de produit de PCR sur un gel d'agarose à 2% coulé et fonctionner dans un tampon TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA). Inclure un marqueur de poids moléculaire, comme une échelle de 100 pb.
    4. Poster tacher le gel avec une tache d'ADN, et de visualiser l'aide d'un transilluminateur UV. Vérifiez qu'il n'y a pas eu d'amplification dans le contrôle négatif. Une forte bande à environ 470 pb pour tout échantillon particulier indique que la culture mixte contient des bactéries qui portent un intégron de classe 1. Colonies pures vont maintenant être isolés de toute culture mixte qui a retourné une PCR positive.

4. Projection du simple Colonies pour intégrons de classe 1

  1. Des dilutions en série et des plaques de propagation:
    Remarque: pour isoler des colonies uniques à partir des cultures mixtes PCR-positifs, la culture mixte est dilué en série 10 fois dans un tampon de phosphate de sodium, et ensuite plaquées à récupérer des colonies uniques.
    1. Ajouter 1 ml de la culture mixte à 9 ml de tampon de phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0 et mélanger par retournement. Ajouter 1 ml de la dilution à une plus 9 ml de tampon phosphate, et répéter jusqu'à ce qu'une dilution en série de 10 -8 soit atteinte.
    2. Étaler 100 pi des 10 -4 et 10 -8 dilutions sur une gélose LB, en double exemplaire. Incuber les plaques O / N à la même température utilisée pour la culture mixte initial. Les plaques peuvent ensuite être stockés à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire, mais il est préférable de traiter les colonies isolées assez rapidement.
  2. Sélection de colonie unique et préparation d'ADN bouillie:
    1. Choisissez des colonies isolées à partir des plaques de dilution de série, soilecte autant de types de colonies différentes que possible, en utilisant des critères tels que la taille de la colonie, la forme et la couleur. Utiliser des cure-dents stériles pour sélectionner des colonies isolées de la plaque de diffusion.
    2. Touchez le cure-dent à la colonie, puis transférer dans un tube PCR contenant 100 pi d'eau stérile. Si un grand nombre de colonies doivent être examiné, puis les colonies peuvent être préparés dans une plaque de microtitrage. Faites tourner le cure-dent entre les doigts pour déloger certaines des cellules dans l'eau.
    3. En utilisant la même cure-dent, inoculer une plaque LB avec une strie de la colonie. Un grand nombre de colonies peuvent être stockés sur des plaques marquées si chaque série est d'environ 1 cm de long. Répétez les étapes 1 à 3 jusqu'à ce que vous avez sélectionné un nombre approprié d'isolats.
    4. Incuber les plaques LB O / N, à la même température que celle utilisée pour la culture d'enrichi initial. Les cultures peuvent ensuite être conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation.
    5. Pour la préparation de l'ADN à partir des suspensions bactériennes, suivez les étapes que oustlined dans la section 3.1. Pour le dépistage de lysats de culture pure, effectuer le / HS464 PCR HS463a comme indiqué à la section 3.2. Isolats qui renvoient une PCR positive sera utilisé pour la préparation de l'ADN génomique (section 5), et pour d'autres analyses.

5. Colonies simples ADN génomique Extraction de Integron-positifs Utilisation Perle Battre 25

  1. Inoculer 5 ml de bouillon LB avec un échantillon de la culture pure isolée dans la section 4.2. Incuber O / N, en agitant à la même température que celle utilisée pour la culture enrichi initial.
  2. Pellet cellules à 4000 g pendant 7 min, puis retirez le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 1 ml de solution CLS-TC dans un tube de préparation rapide Lysing Matrice E. En utilisant une machine de battage bourrelet, traiter l'échantillon à 5,5 m / s pendant 30 s.
  3. tube de centrifugeuse à 14 000 xg pendant 5 min et récupérer 700 pl de surnageant dans un tube stérile de 1,5 ml.
  4. Ajouter 700 pi de matrice de liaison dilué 1: 5 à 6 M guanidinium THIOCYANATE et mélanger à température ambiante pendant 5 min. Centrifugeuse à 14.000 g pendant 1 min, surnageant défausse.
  5. Ajouter 800 ul de lavage à l'éthanol de sel (70% d'éthanol, 0,1 M d'acétate de sodium) et le vortex jusqu'à ce que le culot est remis en suspension entièrement. Laver pendant 5 min à température ambiante, centrifugeuse à 14.000 g pendant 1 min et éliminer le surnageant. Assurez-vous tout surnageant a été retiré, en utilisant une micropipette si nécessaire, puis laisser sécher à l'air pendant 5 min.
  6. Remettre en suspension le culot de matrice dans 200 ul de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) par pipetage de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Centrifuger à 14 000 g pendant 3 min et le transfert de 160 ul de l'ADN élue dans un tube stérile. Exécuter une aliquote de l'extraction de l'ADN génomique sur un gel d'agarose à 2% p / v de vérifier le rendement et l'intégrité de l'extraction de l'ADN. L'ADN génomique purifié est stocké à -20 ° C et décongelés sur de la glace lorsque cela est nécessaire pour les tests de PCR.

6. PCR de diagnostic et séquençage de l'ADN

NOTE: Lel'ADN génomique préparé à l'article 5 sera utilisé pour toutes les PCR de diagnostic, et pour confirmer le test positif pour intégrons de classe 1.

  1. Décongeler l'ADN génomique sur la glace, Vortex brièvement l'échantillon d'ADN et l'impulsion de spin à 14.000 g pendant 20 sec. Répétez le PCR pour le gène de classe 1 de intégron-intégrase utilisant HS463a / HS464 (tableau 1), ce qui confirme que l'isolat est positif pour l'amplicon de 471 pb (section 3.2).
  2. Identification des cultures positives à niveau de l'espèce est obtenue par l'analyse de la petite sous-unité de gène ARNr (ADNr 16S). Amplifier le gène 16S utilisant les amorces F27 / r1492 (tableau 1). Vérifiez les produits de PCR par électrophorèse. Toutes les cibles bactériennes devraient générer un amplicon 16S d'environ 1450 pb.
  3. Séquence du gène amplicon ARNr 16S pour déterminer l'identité de l'espèce, mais comme il ya probablement plusieurs PCR positifs de l'étape 6.2, et beaucoup de ces points positifs seront les mêmes espèces bactériennes, nous allons d'abord distinguer les différentes espèces using digestion de restriction du produit PCR 16S.
    1. Digérer un aliquote de la PCR 16S avec l'enzyme de restriction Hinf 1. Toute enzyme qui reconnaît les sites de clivage de 4 pb feront, mais Hinf 1 génère une bonne diversité d'objectifs de 16S, et est, une enzyme fiable et économique.
  4. Mettre en place une restriction de 30 ul digérer mastermix (tableau 2) dans un tube stérile et ajouter 20 ul de produit PCR 16S non purfied. Incuber dans un bain à 37 ° C de l'eau O / N. Vérifiez la digestion sur un gel agarose à 2%.
  5. Note les profils de digestion produites par Hinf 1. Les isolats avec le même profil de restriction 16S sont susceptibles d'être la même espèce. Plutôt que de séquençage de chaque produit PCR 16S, séquence au plus trois représentants de chaque motif de restriction Hinf 1.
  6. Purifier les produits PCR 16S en utilisant un kit commercial. Un kit d'exonucléase simple brin peut être utilisé, mais basée colonne ou des procédés de précipitation fonctionne aussi bien pour enlever Unincamorces orporated et des ADN simple brin. Séquence amplicons 16S en utilisant l'amorce r910 (tableau 1), mise en place des réactions comme spécifié par l'installation de séquençage.
  7. Utilisation de la séquence d'ADN résultant d'interroger la base de données NCBI d'ADN avec la fonction de BLASTN ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). D'identité en nucléotides supérieur à 97% est généralement considéré comme l'identité de l'espèce.

7. Cartographie et caractérisation des intégrons et cassettes Arrays

NOTE: Classe 1 intégrons émanant écosystèmes dominés par les humains sont susceptibles d'être intégrons les plus communs dans tous les échantillons. Ces intégrons tous avoir une origine unique récente, et donc avoir une séquence d'ADN hautement conservée 5.

  1. La différence entre un intégrons de classe 1 émanant de sources humaines et ceux qui se produisent naturellement dans des échantillons environnementaux en effectuant unePCR avec l'amorce fixée intI1F165 / intI1R476 10 (tableau 1).
    NOTE: intégrons de classe 1 de bactéries commensales ou cliniques vont générer un produit ~ 300 pb, tandis que la classe environnementale 1 intégrons ne génèreront pas de produit.
  2. Caractériser les intégrons cliniques en amplifiant le tableau de cassette avec ensemble d'amorces HS458 / HS459. Cette PCR amplifier la région entre intI1 segment conservé et l'extrémité 3 'à l'extrémité de la plupart des ensembles de cassettes. Parce que le nombre et l'identité des cassettes est variable, la taille du produit de PCR varie également.
  3. Purifier amplicons et séquencer l'ADN en utilisant chacune des amorces d'amplification. Utiliser des séquences d'interroger les bases de données d'ADN en utilisant la fonction de blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Veiller à nommer des cassettes suivre la nomenclature normalisée 9, puisque de nombreux dépôts de données pour cassette du gène intégrons utiliser des noms incohérentes ou ambiguës. Accorder une attention particulière à de nouvelles cassettes de gènes, puisque ceux-ci peuvent encoder de nouveaux phénotypes, y compris les gènes qui confèrent une transmissibilité interhumaine accrue, la pathogénicité ou la virulence 8,21.
    NOTE: préclinique formes de la classe 1 intégron circulent encore dans les milieux naturels. En particulier, ceux qui sont liés aux actifs Tn 402 transposons sont plus d'intérêt 26. Les tableaux de ces intégrons de cassettes ne seront pas amplifier en présence des amorces HS458 / HS459, mais peuvent être amplifié avec l'MRG284 / MRG285 ensemble d'amorces (tableau 1), générant amplicons de taille variable dépendante sur le contenu de la cassette. Les produits de PCR doivent être purifiés et l'ADN séquencé tel que décrit dans 7.2.

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Résultats

Projection de cultures mixtes et isolats bactériens pour intI1

Amorce HS463a / HS464 PCR peut être utilisée pour détecter la présence du gène de classe 1 de intégron-intégrase, intI1 (Figure 1). Ce jeu d'amorces fonctionne bien pour détecter intI1 dans les cultures mixtes, et est également utilisé pour cribler des colonies bactériennes récoltées à partir de plaques de propagation (Figure 2). Isolats positifs devraient générer une seule ban...

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Discussion

L'identification des intégrons et leurs cassettes de gènes associés est potentiellement une étape clé dans la prédiction de l'émergence de nouveaux pathogènes opportunistes, suivi des voies pour les agents pathogènes dans la chaîne alimentaire humaine, et l'identification de nouvelles résistances et de la virulence déterminants 8,21,26. Le but de cet article était de décrire une approche rationalisée pour le dépistage des échantillons pour intégrons de classe 1, caractérisant leurs tableaux de cas...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien de pertinent de divulguer.

Remerciements

Merci à Michaela Hall, Larissa Bispo et Gustavo Tavares pour l'assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GoTaq Colourless MastermixPromegaM7132Utilisé dans toutes les PCR
ARNse (ribonucléase A du pancréas bovin)SigmaR6513-10MGUtilisé dans toutes les PCR Enzyme de
restriction HinFIPromegaR6201Utilisé pour digérer les produits PCR 16S rDNA. L’enzyme est livrée avec un tampon optimal et une échelle BSA
100 pbGE Healthcare27400701Utilisé comme norme de taille sur tous les gels d’agarose
GelRed DNA stainBiotium41003ATTENTION : Une protection individuelle doit être portée lors de la manipulation de ce matériau
Guanidinium thiocyanateLife TechnologiesAM9422ATTENTION : Une protection individuelle doit être portée lors de la manipulation de ce matériau
CLS-TC SolutionMP Biomedicals6540409Solution de resuspension utilisée au début de l’extraction de l’ADN génomique
Lysing Matrix E Tubes FastPrepMP Biomedicals116914500Tube nécessaire pour la rupture mécanique des parois cellulaires bactériennes. Ce code est utilisé pour les packs de 500 tubes, de plus petites quantités sont disponibles.
Matrice de liaisonMP Biomedicals116540408Diluée 1:5 avec du thiocyanate de guanidinium 6 M et utilisée dans la méthode d’extraction de l’ADN génomique.
Machine Fast PrepMP BiomedicalsNombre d’options disponibles MPBiomedicals a un certain nombre de machines FastPrep disponibles à l’achat. Pour plus d’informations, rendez-vous sur http://www.mpbio.com

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