Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

Résumé

Un protocole de génération de vecteurs adénoviraux de grande capacité dépourvus de toutes séquences codantes virales est présenté. Le clonage des transgènes contenus dans le génome du vecteur est basé sur des endonucléases à tête chercheuse. L’amplification virale dans les cellules productrices cultivées en tant que cellules adhérentes et en suspension repose sur un virus auxiliaire fournissant des gènes viraux chez trans.

Résumé

Les vecteurs adénoviraux de grande capacité (HCAdV) dépourvus de toute séquence codante virale représentent l’un des vecteurs de délivrance de gènes les plus avancés en raison de leur grande capacité de conditionnement (jusqu’à 35 kb), de leur faible immunogénicité et de leur faible toxicité. Cependant, pour de nombreux laboratoires, l’utilisation de HCAdV est entravée par la procédure compliquée de construction du génome vectoriel et de production de virus. Ici, un protocole détaillé pour un clonage et une production efficaces de HCAdV basé sur le plasmide pAdFTC contenant le génome HCAdV est décrit. La construction des génomes de HCAdV est basée sur un système de vecteurs de clonage utilisant des endonucléases à tête chercheuse (I-CeuI et PI-SceI). Tout gène d’intérêt d’une taille maximale de 14 kb peut être sous-cloné dans le vecteur navette pHM5, qui contient un site de clonage multiple flanqué de I-CeuI et PI-SceI. Après la libération du transgène par I-CeuI et PI-SceI, le transgène peut être inséré dans le vecteur de clonage HCAdV pAdFTC. En raison de la grande taille du plasmide pAdFTC et des longs sites de reconnaissance des enzymes utilisées associés à une forte liaison à l’ADN, une manipulation soigneuse des fragments de clonage est nécessaire. Pour la production de virus, le génome de HCAdV est libéré par la digestion NotI et transfecté dans une lignée cellulaire productrice basée sur HEK293 exprimant de manière stable la Cre recombinase. Pour fournir tous les gènes adénoviraux pour l’amplification de l’adénovirus, une co-infection avec un virus auxiliaire contenant un signal d’emballage flanqué de sites loxP est nécessaire. La préamplification du vecteur est effectuée dans des cellules productrices cultivées sur des surfaces et l’amplification à grande échelle du vecteur est effectuée dans des fioles tournantes avec des cellules productrices cultivées en suspension. Pour la purification du virus, deux étapes d’ultracentrifugation basées sur des gradients de chlorure de césium sont effectuées, suivies d’une dialyse. Ici, des conseils, des astuces et des raccourcis développés au cours des dernières années en travaillant avec ce système vectoriel HCAdV sont présentés.

Introduction

Pour les applications de thérapie génique, il est d'une grande importance pour éviter des effets secondaires cytotoxiques et immunogènes causées par expression de protéines virales, le transgène lui-même ou par des protéines virales entrants. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont largement utilisés pour introduire un ADN étranger dans une grande variété de cellules pour étudier l'impact de l'expression du transgène ^1,2. La version la plus avancée de AdV est représentée par des vecteurs adénoviraux à grande capacité (HCAdV) dépourvues de toutes les séquences virales codantes ^3,4 et offrant ainsi une capacité de conditionnement jusqu'....

Protocole

1. Construction d'recombinant HCAdV génomes basée sur le plasmide pAdFTC

Remarque: Tous les plasmides ont été décrits précédemment ^11,12 et sont disponibles sur demande. La procédure de clonage est représentée schématiquement sur ​​la figure 1.

1. Cloner un gène d'intérêt (GOI) y compris le promoteur et signal de polyadénylation (pA) dans le plasmide navette PHM5, en utilisant une stratégie de clonage de choix, pour générer PHM5-GOI.
   Remarque: Comme pAdFTC est relativement grand plasmide, les protocoles de préparation de plasmide classique est recommandé d'éviter la t....

Résultats

Voici des exemples représentatifs pour le clonage, l'amplification et la purification des préparations de HCAdV sont présentés. Un aperçu de la stratégie de clonage (Figure 1) et des exemples représentatifs pour le clonage et la libération du génome de HCAdV par digestion de restriction enzyme sont fournis (Figure 2). Un motif de restriction typique après la libération de la cassette GOI-expression de PHM5 par PI Sce I et I-Ceu je d.......

Discussion

Le protocole présenté ici permet la purification de vecteurs de HCAdV basés sur l'adénovirus humain de type 5 sur la base de procédures précédemment décrites ^4,12. Le génome du plasmide à l'intérieur HCAdV pAdFTC est dépourvu de tous les gènes adénoviraux et ne porte les 5 'et 3' ITR et le signal d'encapsidation. Dans cette stratégie, le HV AdNG163R-2 ⁴ fournit tous les gènes nécessaires à la production de virus efficace en trans. Cette offre une capacité de conditionne.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	digest
Phosphatase alcaline intestinale de veau (CIP)	New England Biolabs	M0290S	déphosphorylation des plasmides digérés
Hygromycine B	PAN Biotech	P02-015	sélection de l’ERC exprimant 116 cellules
DMEM	PAN Biotech	P04-03590  ;   ;   ;	Milieu de culture cellulaire Hek293T
Milieu Essentiel Minimal (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 milieu de culture cellulaire  ;   ;
Dulbecco' s tampon phosphate salin (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	lavage des cellules, remise en suspension des cellules
Flacon de stockage de 250 ml	Sigma	CLS430281-24EA	infection de 116 cellules cultivées en suspension
500 ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sédimentation des cellules de la culture
en suspension Fiole tournante	Bellco	1965-61030	croissance de 116 cellules en suspension
Tubes ultracentrifuges ultra-clairs	Beckmann Coulter	344059	centrifugation à gradient de densité
Ultracentrifuge Beckmann	Coulter		Centrifugation à gradient de densité
SW-41 rotor Beckmann	Coulter		Centrifugation à gradient de densité
Spectrum Laboratories Spectrum Membrane	VWR	132129	tube de dialyse
Cassettes de dialyse prêtes à l’emploi  ;	Thermo	66383	dialyse
one shot DH10B électrocompétente E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation des réactions de ligature
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  ;	Peqlab	12-3396-02	isolement de l’ADN génomique
Réactif de transfection SuperFect	Qiagen	301305	transfection de 116 cellules
opti MEM (10 % FBS)	Gibco	31985-062	transfection de 116 cellules
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	; 170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 tactile  ;	Biorad		qPCR
Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique  ;	Carl Roth	A156.1	purification de l’ADN
Chlorure de césium	Carl Roth	8627.1	gradient de densité centrifugation acétate
de sodium 99 %	Carl Roth	6773.2	précipitation de l’ADN
LB moyen  ;	Carl Roth	X968.3	milieu de croissance bactérienne
éthanol  ; 99.8 % pur	Carl Roth	9065.5  ;	Précipitation et lavage de l’ADN
FS 99.5 %	Carl Roth	2326.2	tampon de lyse
EDTA	Carl Roth	8043.2	tampon de lyse  ;
Tris-HCl 99 %	Carl Roth	9090.3	tampon de dialyse/lyse  ; tampon
glycérol 99.5 %	Carl Roth	3783.1	tampon de dialyse
MgCl2 98.5 %	Carl Roth	KK36.2	tampon de dialyse
NaCl	Carl Roth	3957.1	tampon de dialyse en option
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	tampon de dialyse en option
saccharose	Carl Roth	9286.1	tampon de dialyse en option
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	Tampon de dialyse en option
Tubes de 1,5 ml	Sarstedt	72,730,005	Stockage des préparations virales à -80 ° ; L

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