Heterotopic col de l'utérus chez la souris Transplantation cardiaque

Résumé

La technique du brassard raccourcit et facilite le modèle de transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris en évitant les anastomoses de suture techniquement difficiles des petits vaisseaux. Les détails techniques présentés dans cet article vidéo devraient permettre aux chercheurs d’établir ce modèle dans leurs laboratoires.

Résumé

La transplantation cardiaque cervicale hétérotopique chez la souris est un outil précieux dans la transplantation et la recherche cardiovasculaire. La technique du brassard simplifie considérablement ce modèle en évitant les anastomoses de suture difficiles des petits vaisseaux, réduisant ainsi le temps d’ischémie à chaud. Par rapport à l’implantation d’une greffe abdominale, le modèle cervical est moins invasif et le greffon implanté est facilement accessible pour des examens de suivi ultérieurs. Les anastomoses sont réalisées en tirant l’aorte ascendante du greffon sur le ballonnet avec l’artère carotide commune du receveur et en tirant l’artère pulmonaire principale sur le ballonnet avec la veine jugulaire externe. Le choix de la taille de brassard appropriée et la mobilisation complète des vaisseaux sont importants pour une revascularisation réussie. Les lésions d’ischémie-reperfusion (I/R) peuvent être minimisées en perfusant le greffon avec une solution cardioplégique et par hypothermie. Dans cet article, nous fournissons les détails techniques d’une technique de brassard simplifiée et améliorée, qui devrait permettre aux chirurgiens ayant des compétences microchirurgicales de base d’effectuer l’intervention avec un taux de réussite élevé.

Introduction

Le modèle de la transplantation cardiaque est fréquemment utilisé pour enquêter sur I / R-blessure, le rejet d'allogreffe, la vasculopathie post-transplantation et l'efficacité des agents immunomodulateurs. Des modèles de souris combinent de nombreux avantages comme le immunologique connu et origines génétiques, la disponibilité de nombreuses souches consanguines et transgéniques expérimentales et les coûts relativement faibles.

En 1973, une technique de abdominale transplantation cardiaque chez la souris a été décrite par Corry et al ^1. Dans ce modèle greffons sont revascularisés par anastomoses de l'aorte ascendante à l'aorte abdominale du destinataire et de l'artère pulmonaire principale à la veine cave inférieure end-to-côté. En 1991, une technique de suture du col pour une transplantation cardiaque chez la souris a été décrit par Chen et al ^deux. Dans ce modèle, une perfusion de l'artère coronaire rétrograde est établie par anastomose de l'artère carotide du bénéficiaire de l'aorte ascendante du grarrière. Les drains veineux via le sinus coronaire de sang dans l'oreillette droite, le ventricule droit et est éjecté par l'artère pulmonaire dans le receveur veine jugulaire externe (Figure 1). Par rapport à la greffe implantation abdominale le modèle col de l'utérus est moins invasive et l'emplacement superficiel de la greffe permet une accessibilité très facile pour les examens de suivi supplémentaires (par exemple, la palpation, l'échocardiographie, la microscopie à fluorescence intravitale) ^3,4.

Malgré les améliorations techniques ^5,6, une utilisation plus généralisée de ce modèle a été limitée en raison de difficultés techniques pour réaliser des anastomoses suturées de petits navires avec une incidence élevée de fuite de l'anastomose et la thrombose. En 1991, Matsuura et al. introduit la technique de manchon dans lequel la paroi du vaisseau est éversée sur un cylindre synthétique, ce qui facilite grandement le modèle de transplantation cardiaque du col ^7. La technique était fucomplémen adopté pour différents modèles de transplantation expérimentales dont ⁸ rénale, pancréatique ^9, branche ^{10, 11,12} hépatique, du poumon et de la transplantation ^13,14 vasculaire ^15. Par rapport à la technique de suture de la durée requise pour anastomoses et, par conséquent, le temps d'ischémie chaude est plus courte et il ya des complications vasculaires beaucoup moins en utilisant la technique de la coiffe ^16. En outre, il permet aux chirurgiens avec peu de formation en microchirurgie pour effectuer l'opération avec un taux de réussite élevé. Un inconvénient de la technique du brassard est la ligature préalable de l'artère carotide commune, ce qui peut modifier la perfusion cérébrale.

Dans ce papier, nous présentons une vidéo technique de brassard améliorée et simplifiée pour cervicale transplantation cardiaque chez la souris.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvés par l'Allemand Coeur Centre de Munich et le gouvernement de Bavière, Allemagne (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Les animaux ont été logés dans un établissement exempt d'organismes pathogènes spécifiques et ont reçu des soins humaine en conformité avec les «Principes de laboratoire Animal Care" formulées par la Société nationale pour la recherche médicale et le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire" fournies par la National Academy des sciences et publié par les National Institutes of Health (NIH Publication no. 86-23, révisé 1985).
REMARQUE: Un ensemble complet d'instruments de microchirurgie stériles, y compris les deux pinces courbes et dilatateurs des vaisseaux, est nécessaire pour la procédure (Figure 2a). Antibioprophylaxie péri-opératoires ne sont pas systématiquement nécessaire mais peut être indiqué chez les animaux immunodéprimés. Les animaux ont été sacrifiés en utilisant l'inhalation isoflurane terminal.

Préparation des donateurs et des greffons récolte

1. Anesthésier l'animal par voie intrapéritonéale (ip) injection de midazolam (5,0 mg / kg), de médétomidine (0,5 mg / kg) et de fentanyl (0,05 mg / kg de poids corporel). Placez la souris dans une position couchée sur le champ opératoire et de confirmer la tolérance chirurgicale par le réflexe de retrait de la pédale.
2. Désinfectez la peau trois fois avec de la chlorhexidine et effectuer une incision abdominale médiane. Rentrer les intestins avec gaze humide vers la gauche pour exposer la veine cave inférieure.
3. Injecter 50 UI d'héparine dilué dans 0,4 ml de solution saline à travers la veine cave inférieure pour l'anticoagulation. Inciser la cuve 1 min après héparinisation.
4. Ouvrez le diaphragme et effectuer une thoracotomie bilatérale pour exposer le coeur. La paroi thoracique antérieure se reflète supérieurement et maintenu en place avec une pince.
5. Retirez le thymus et carrément disséquer le tissu conjonctif entre l'aorte et l'artère pulmonaire. Inciser le droit veine cave supérieure.
6. Piquer l'aorte ascendante mobilisées au niveau de latronc brachiocéphalique avec une aiguille 30 G monté sur une seringue de 5 ml et perfuser lentement le coeur retrogradually sans pression excessive avec 3 ml de 4 ° C à froid solution cardioplégique. Éviter l'entrée d'air dans la circulation coronaire. Déposez une solution saline glacée sur la greffe pour améliorer encore un arrêt cardiaque.
7. Transect l'aorte proximale à l'origine du tronc brachiocéphalique.
8. Ligaturer les veines caves inférieure et supérieure à la fois à proximité du cœur avec 8-0 soie et sectionner les distale pour les ligatures.
9. Disséquer gratuitement le tronc pulmonaire distale que possible. Ligaturer les artères pulmonaires à proximité de la bifurcation avec 8-0 soie et sectionner les distale.
10. Ligaturer les veines pulmonaires tous ensemble avec une seule ligature 8-0 de soie et transect eux.
11. Retirer le cœur du donneur et de le stocker dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à l'implantation.

2. Bénéficiaire Préparation

1. Préparerles poignets pour anastomoses en coupant le tube de polyimide avec un scalpel n ° 11 ou une paire de ciseaux au microscope. La coiffe est constituée d'un corps cylindrique et un prolongement _{^(1/3 de la} circonférence) pour la mise en place de la pince vasculaire, chacune d'une longueur de 1 mm (figure 2b).
2. Anesthésier l'animal et confirmer la tolérance chirurgical comme décrit ci-dessus. Injecter 0,25 ml solution saline chaude voie sous-cutanée (sc) pour le remplacement des liquides.
3. Enlever les poils de la région cervicale droite en utilisant un rasoir électrique et placer l'animal dans une position couchée sur un bloc chaud. Fixez les pieds avec des brins de bande tout en évitant surexploiter les membres antérieurs, car cela peut compromettre la respiration. Couvrir les yeux à l'aide pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse. Désinfecter le site chirurgical à trois reprises avec de la chlorhexidine.
4. Faire une incision de la peau transversale de l'angle mandibulaire droit à la veine jugulaire.
5. Carrément mobiliser la posteveine jugulaire ernal. Cauterize branches latérales avec une pince bipolaire et transect eux.
6. Divisez la veine jugulaire externe entre ligatures au niveau de la confluence avec la veine de la glande sous-maxillaire.
7. Tirer la veine jugulaire externe par l'intermédiaire du manchon et de manière proximale occlure le vaisseau en plaçant une pince vasculaire sur le prolongement de la manchette. Retirer la ligature et irriguer la lumière du vaisseau avec une solution saline héparinée 01h10.
8. Evert la paroi du vaisseau sur la manchette et le fixer avec un préréglage circonférentielle 8-0 ligature de soie.
9. Retirer la partie superficielle du muscle sterno.
10. Mobiliser le droit artère carotide commune et sectionner le navire entre ligatures en dessous de la bifurcation carotidienne.
11. Tirer la carotide par l'intermédiaire du manchon et de manière proximale occlure le vaisseau en plaçant une pince Yasargil sur le prolongement de la manchette. Retirer la ligature et irriguer la lumière du vaisseau avec une solution saline héparinée 01h10.
12. Doucement Dilate la lumière artérielle avec un dilatateur des vaisseaux, Evert la paroi du vaisseau sur la manchette et le fixer avec un préréglage circonférentielle 8-0 ligature de soie.
13. Pour gagner assez d'espace pour implantation du greffon, enlever le lobe droit de la glande sous-maxillaire.
14. Gardez le champ opératoire humide jusqu'à l'implantation.

3. implantation du greffon

1. Placez la greffe chez le receveur région cervicale à l'envers avec l'aorte orienté médiane et l'artère pulmonaire latéralement.
2. Tirez l'aorte de la greffe sur le brassard avec l'artère carotide et sécuriser l'anastomose avec un périphérique 8-0 ligature de soie.
3. Inciser le tronc pulmonaire sur sa face antérieure et le tirer sur le brassard avec la veine jugulaire externe. Encore une fois sécuriser l'anastomose avec un périphérique 8-0 ligature de soie.
4. Retirer la pince sur la veine jugulaire externe, à la suite par le desserrage de l'artère carotide. Les cœurs se remplit immédiatement avec du sang. Pour améliorer reperfusion baisse de 37 ° C une solution saline chaude sur la greffe. Normalement, le coeur se développe rythme sinusal en une minute. Retirez l'extension du brassard sur le site veineux.
5. Veiller à la position correcte de la greffe, anastomoses doit être exempte de tensions et de navires sans torsion. Ne pas les navires cautérisées de la peau, car cela pourrait nuire à la cicatrisation des plaies. Habituellement, l'hémorragie arrête spontanément. Fermez la peau avec un seul 8-0 suture continue.

4. Soins postopératoires

1. Injecter 0,25 ml chaude sc de solution saline pour le remplacement des liquides.
2. Pour contrer les stupéfiants injectent naloxone (1,2 mg / kg), le flumazénil (0,5 mg / kg) et atipamezol (2,5 mg / kg de poids corporel) sc laissé les animaux sur le pavé chaud jusqu'à ce qu'il ait repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Observez l'animal pendant au moins une heure supplémentaire pour enregistrer tout comportement anormal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à leur entière Recoverouge.
3. Fournir l'analgésie préventive de la buprénorphine (0,05 mg / kg sc trois fois par jour) ou une analgésie alternatif selon un protocole institutionnel local pour une durée minimale de 72 heures après l'intervention.
4. Le chirurgien et un vétérinaire devraient voir des animaux régulièrement. En cas de perte de poids> 15%, de l'apathie, de l'enflure ou chirurgicales animaux d'infection de côté sont euthanasiés en utilisant l'inhalation isoflurane terminal.

Résultats

Notre équipe pourrait effectuer avec succès la technique décrite après environ 20 chirurgies de formation. La partie la plus difficile est de retourner la paroi de la cuve de l'artère carotide sur le brassard, parce qu'il retourne facilement en arrière et de multiples tentatives peut conduire à la déchirure de la paroi. Après la période de formation, le temps opératoire total moyen était de 60 ± 8 min. Environ 20 minutes sont nécessaires pour la récolte des donateurs, 25 min pour la préparation des vaisseaux cer...

Discussion

Nous avons réalisé plus de 200 greffes cardiaques avec un taux de réussite de plus de 90% dans divers paramètres expérimentaux. Avec la technique décrite ici, la procédure complète peut être effectuée dans les 60 minutes par un chirurgien expérimenté. En préparant les vaisseaux cervicaux avant le prélèvement d'organes, le temps total greffon ischémie peut être limité à 20 min. Le temps d'implantation (temps d'ischémie chaude) est significativement plus courte en utilisant la technique de la coiffe par rappor...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince JFC-7.2	S& T	P-00036	Embout incurvé 0,20 mm
Dilatateur de cuve D-5a	S& T	S-00124
Ciseaux Adventita	S& T	S-00102
Pince vasculaire B-1V	S& T	S-00396
Yasargil Clip	Peter Lazic	65,097	3,5 mm de longueur
Pince bipolaire	Micromed	148-100-011	pointe 0,25 mm
Tubes en polyimide	River Tech Medical		19-24 calibre
8.0 ligatures en soie	Catgut
Custodiol HTK solution	Essential Pharmaceuticals