Article de méthode

Enregistrement Potentiel évoqué visuel dans un modèle de rat of Experimental Optic Nerve démyélinisation

DOI :

10.3791/52934

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29 juillet 2015

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1Department of Ophthalmology, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2Save Sight Institute, The University of Sydney

Dans cet article

Résumé

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La démyélinisation focale est induite dans le nerf optique par micro-injection de lysolécithine. Les potentiels évoqués visuels sont enregistrés via des électrodes crâniennes implantées sur le cortex visuel pour examiner la conduction du signal le long de la voie visuelle in vivo. Ce protocole détaille les procédures chirurgicales sous-jacentes à l’implantation d’électrodes et à la micro-injection de nerf optique.

Résumé

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L’enregistrement du potentiel évoqué visuel (VEP) est largement utilisé dans la pratique clinique pour évaluer la gravité de la névrite optique dans sa phase aiguë et pour surveiller l’évolution de la maladie pendant la période de suivi. Les modifications des paramètres VEP sont étroitement corrélées avec des lésions pathologiques du nerf optique. Ce protocole fournit une description détaillée du modèle de rongeur de micro-injection du nerf optique, dans lequel une lésion de démyélinisation partielle est produite dans le nerf optique. Les techniques d’enregistrement VEP sont également abordées. À l’aide d’électrodes implantées dans le crâne, nous sommes en mesure d’acquérir des traces VEP reproductibles intra-session et inter-session. Les VEP peuvent être enregistrés sur des animaux individuels sur une période de temps pour évaluer les changements fonctionnels du nerf optique longitudinalement. Le modèle de démyélinisation du nerf optique, en conjonction avec le protocole d’enregistrement VEP, fournit un outil pour étudier les processus pathologiques associés à la démyélinisation et à la remyélinisation, et peut potentiellement être utilisé pour évaluer les effets de nouveaux médicaments remyélinisants ou de thérapies neuroprotectrices.

Introduction

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La névrite optique est l’une des formes les plus courantes de neuropathie optique, entraînant une perte totale ou partielle de la vision1. Histologiquement, elle se caractérise par une démyélinisation inflammatoire, une perte axonale des cellules ganglionnaires rétiniennes et divers degrés de remyélinisation du nerf optique2. La névrite optique est généralement le début manifeste de la sclérose en plaques. Le potentiel évoqué visuel (VEP) est un outil non invasif pour étudier le fonctionnement du système visuel. Il reflète la fonction post-rétinienne de la rétine au cortex visuel primaire et est affecté dans de nombreuses maladies du nerf optique3. Le VEP a été principalement utilisé chez les patients atteints de névrite optique pour évaluer l’intégrité de la voie visuelle4.

La latence de la VEP, qui reflète la vitesse de conduction du signal le long de la voie visuelle, est considérée comme une mesure précise du niveau de myéline associée aux changements dans le nerf optique5 ; tandis que l’amplitude de la VEP est considérée comme étroitement corrélée avec les lésions axonales des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC)6. Cette hypothèse a été assez bien établie en utilisant le modèle de rat de démyélinisation du nerf optique induite par la lysolécithine5.

Ici, nous expliquons un protocole complet de technique de micro-injection de nerf optique chez les rongeurs, qui peut minimiser les dommages liés à la manipulation chirurgicale au nerf en soi ainsi qu’aux tissus adjacents tels que les muscles extraoculaires et les vaisseaux sanguins. De plus, la chirurgie d’implantation d’électrodes crâniennes a été décrite pour l’enregistrement VEP chez les animaux7. Les enregistrements VEP peuvent être effectués de manière répétée sur des animaux sur une période de temps pour évaluer les changements liés à la démyélinisation/remyélinisation ainsi que l’impact sur l’intégrité axonale du nerf optique.

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Protocole

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Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec le Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques et les lignes directrices de la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research, et ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Université de Macquarie.

1. VEP implantation d'électrodes

  1. Anesthésier les animaux par une injection intraperitoneale de kétamine (75 mg / kg) et la médétomidine (0,5 mg / kg).
    Remarque: Après l'induction de l'anesthésie, observer les réflexes de retrait (test de pincement, réflexe cornéen et palpébrale, etc.) et leur absence comme une indication pour commencer la chirurgie. Surveiller continuellement les animaux tout au long de la chirurgie et administrer anesthésique supplémentaire (10% de la dose de kétamine initial par top-up) si les réflexes sont présents. Des rats adultes (> 12 semaines) sont utilisés dans les expériences.
  2. Raser la peau de la zone chirurgicale.Placez l'animal sur un coussin chauffant (37 ° C) afin de maintenir la température du corps pendant l'intervention chirurgicale. Préparer la peau grâce à l'application topique de povidone-iode. Appliquer drapage chirurgical. Appliquer une pommade ophtalmique topique pour prévenir la sécheresse de la cornée sous anesthésie générale. Maintenir l'asepsie en utilisant des instruments stériles.
  3. Faire une incision longitudinale de la peau sur la ligne médiane de la peau de la tête. Désactivez le tissu conjonctif pour obtenir une bonne exposition du crâne.
  4. Soigneusement, percer de petits trous de bavures manuellement à l'aide d'une perceuse à main micro à 7 mm derrière le bregma et 3 mm latéralement de la ligne médiane.
  5. Implant à vis des électrodes à travers le crâne dans le cortex (zone 17), pénétrant dans le cortex à une profondeur d'environ 0,5 mm. Implanter une électrode de vis de référence sur la ligne médiane 3 mm rostral au bregma. Appliquer ciment dentaire pour envelopper et fixer les vis (pas toujours nécessaire).
  6. Suturer la peau de la tête, administrer une pommade antibiotique sur la peau et permettre aux animaux de recover de l'anesthésie sur un coussin chauffant.
    Remarque: vous pouvez électrodes peuvent être laissés exposés, de sorte que la peau n'a pas besoin d'être rouvert dans chaque enregistrement. Immédiatement après la cessation de la chirurgie, mais avant la récupération anesthésique, administrer un médicament non-stéroïdiens anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) (si pas administré en pré-opératoire) ou un analgésique opioïde. Surveiller les animaux constamment jusqu'à ce que le rétablissement complet de l'anesthésie et entièrement ambulatoire.
  7. Prévoyez au moins 1 semaine pour les animaux de récupérer de la chirurgie avant l'enregistrement VEP.

2. Optic Nerve Injection

  1. Anesthésier l'animal, préparer la peau et appliquer drapage comme ci-dessus (1.1 et 1.2).
  2. Ajouter un 1- à 1,5 cm incision dans la peau au-dessus de l'orbite de l'oeil choisi de façon aléatoire. Ouvrez le tissu sous-cutané pour atteindre la cavité orbitaire en utilisant l'iris ciseaux fins. Ouvrir la conjonctive et de la partie antérieure de la capsule de Tenon sous le microscope opératoire.
  3. Rétracter le extraoculaireles muscles et les glandes lacrymales intraobital pour exposer environ 3 mm de longueur du nerf optique. Ouvrez la dure-mère et l'arachnoïde matière couches autour du nerf optique en utilisant une lame longitudinalement ophtalmique.
  4. Insérez la pipette en verre dans le nerf optique à une distance de 2 mm en arrière du globe. La micropipette en verre est fixée à une seringue Hamilton.
  5. Injecter 1% lysolécithine (0,4 à 1,0 pi, avec 0,02% de bleu d'Evan qui n'a pas d'effets sur la myélinisation) lentement dans le nerf environ sur une période de 30 sec.
  6. Suturer l'incision de la peau. Appliquer une pommade antibiotique pour prévenir l'infection. Compagnons yeux peuvent être servis que des contrôles internes pour les enregistrements électrophysiologiques.
  7. Placez les animaux sur un coussin chauffant pour récupérer de l'anesthésie.

3. VEP Enregistrement

  1. Anesthésier l'animal et de préparer la peau en tant que 1,1 et 1,2.
    Remarque: Une dose réduite d'anesthésiques peut être utilisé pour reco électrophysiologiquerding (kétamine à 40 mg / kg de médétomidine et 0,25 mg / kg).
  2. Placez le rat dans une pièce sombre et lui permettre d'adapter à l'obscurité pendant 5 - 30 min. Dans certains cas, les rats peuvent être respectivement O adapté foncé / N pour scotopique ou de lumière adapté pour les enregistrements photopique de VEP 8.
  3. Maintenir la température du corps à 37 ± 0,5 ° C par le système de couverture homéothermes avec une sonde de thermomètre rectal.
  4. Dilater les pupilles avec 1,0% tropicamide gouttes oculaires. Ouvrir la peau sur le crâne pour accéder à la pré-électrodes placés dans de vis situ.
  5. Connectez la vis sur le cortex visuel de l'oeil controlatéral stimulée et la vis de référence à l'amplificateur. Insérez une électrode de l'aiguille dans la queue que le sol. Mesurer et maintenir l'impédance de l'électrode en dessous de 5 kQ.
  6. Placer un stimulateur mini-Ganzfeld directement sur ​​la peau autour des paupières pour assurer une isolation supérieure 7 de l'oeil. L'illumination du stimulateur doit être étalonné au préalablepar un photomètre.
  7. Livrer la stimulation lumineuse à travers clignote 100 fois à une fréquence de 1 Hz, avec des réglages de filtre passe-bande basse et haute de 1 et 100 Hz, respectivement. Le taux d'échantillonnage du signal est à 5 kHz.
    Remarque: Les signaux doivent être échantillonnés au moins à environ 250 à 300 Hz pour assurer que plus de deux échantillons sont prélevés au cours de chaque cycle.
  8. Suturer la peau du dos et de garder les animaux sur un coussin chauffant pour récupérer de l'anesthésie. L'enregistrement peut être enregistrée de façon répétée sur des animaux individuels pour surveiller les changements fonctionnels sur une période de temps.
  9. À la fin du point, administrer une injection surdose de pentobarbital de sodium (100 mg / kg, ip) pour euthanasier l'animal. Confirmez l'euthanasie par arrêt cardiaque, arrêt respiratoire et la diminution de la température du corps.

4. Préparation des tissus et histologie

  1. Retirer les nerfs optiques à partir d'animaux euthanasiés au microscope et fixer le tissu dans 1% de paraformaldehyde O / N.
  2. Laver le tissu à fond avec une solution saline. Traiter le tissu dans un processeur automatique de tissu et l'intégrer dans de la paraffine. sections coupées (5 - 10 um) à l'aide d'un microtome rotatif.
    Remarque: Pour l'étude d'immunohistochimie, fixer le tissu dans 1% de paraformaldehyde, laver avec une solution saline et incuber avec 30% de saccharose O / N. Incluez le tissu dans l'OCT milieu d'inclusion et de faire cryosections l'aide d'un cryostat.
  3. Incuber les coupes dans 0,1% de solution de bleu rapide tels que Luxol (dans 95% d'éthanol) O / N à 56 ° C. Différencier les sections de carbonate de lithium à 0,05% pendant 30 secondes et ensuite éthanol à 70% pendant 30 sec. Enfin, contre-colorer dans une solution de violet de crésyl à 0,1% pendant 30 secondes avant de monter les sections. Utilisez la coloration au bleu rapide pour identifier la myéline dans le nerf optique 5.

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Résultats

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Traces de VEP intrasessions reproductibles sont présentés dans la figure 1 et un retard important dans la latence N1 peuvent être observés après l'injection du nerf optique. Lésions du nerf optique partielles de démyélinisation peuvent être observées sur des coupes histologiques utilisant Luxol coloration au bleu rapide 5. La figure 2 montre une section représentative avec une petite lésion démyélinisée focal dans le centre du nerf optique. Notez que section ne représente pas...

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Discussion

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Le nerf optique est très sensible aux dommages mécaniques. Une lésion par écrasement du nerf optique sur une durée de 1 s peut entraîner une perte d’environ 75 % de RGC sur une période de 2 semaines10. Par conséquent, une prudence extrême est requise lors de l’exécution des procédures chirurgicales. Selon l’expérience des auteurs, il est préférable d’adapter une approche de dissection contondante pour exposer et se frayer un chemin à travers les tissus autour du nerf optique le long de l’orientation du nerf, p...

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Déclarations de divulgation

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Aucun des auteurs n’a d’intérêts concurrents ou conflictuels.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par l'Institut de recherche en ophtalmologie de l'Australie (ORIA). Nous remercions Prof. Algis Vingrys et le Dr Bang Bui, Université de Melbourne, pour d'abord nous aider à développer la technique d'enregistrement VEP.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kétamine 100 mg/ml (Ketamil)Troy LaboratoriesAC 116
Médétomidine 1 mg/ml (Domitor)Pfizersc-204073
Tropicamide 1,0 % (Mydriacyl)Alconsc-202371
Système de couverture homéothermiqueAppareil de HarvardNC9203819
Impédancemètre  ;ÉlectrodesGrass F-EZM5
  ;Micro FixationsM1.0& fois ; 3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Électrodes à aiguille sous-cutanée  ;HerbeF-E3M-72
Réparation Rapide  ;DeguDent GmbH
Diode électroluminescente  ;Bioamplificateur NichiaNSPG300A
CWE, Inc.Système BMA-400
CEDCambridge Electronic Design, Ltd.Power1401
Seringue Hamilton  ;Hamilton87930
LysolécithineSigmaL4129
Evan' s bleu  ;SigmaE2129
à vis

Références

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