Planar Gradient système de diffusion d'enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

Résumé

La migration cellulaire est une partie importante du développement humain et de la vie. Afin de comprendre les mécanismes qui peuvent modifier la migration cellulaire, nous présentons un système de diffusion à gradient planaire pour étudier la chimiotaxie dans une matrice de collagène 3D, ce qui permet de surmonter les limites de la chambre de diffusion moderne des tests existants.

Résumé

L’importance de la migration cellulaire peut être vue à travers le développement de la vie humaine. Lorsque les cellules migrent, elles génèrent des forces et transfèrent ces forces à leur environnement, ce qui entraîne le mouvement et la migration des cellules. Afin de comprendre les mécanismes qui peuvent modifier et/ou affecter la migration cellulaire, on peut étudier ces forces. En théorie, la compréhension des mécanismes fondamentaux et des forces sous-jacentes à la migration cellulaire promet des approches efficaces pour traiter les maladies et promouvoir la transplantation cellulaire. Malheureusement, les chambres de chimiotaxie modernes qui ont été développées sont généralement limitées à deux dimensions (2D) et ont des gradients de diffusion complexes qui rendent l’expérience difficile à interpréter. À cette fin, nous avons développé, et décrivis dans cet article, une chambre à vision directe pour les études de chimiotaxie, qui permet de surmonter les obstacles de la chambre de chimiotaxie moderne capable de mesurer les forces cellulaires et la concentration spécifique dans la chambre dans un environnement 3D pour étudier la migration 3D des cellules. Plus convaincante, cette approche permet de modéliser avec succès la diffusion à travers des matrices de collagène 3D et de calculer le coefficient de diffusion d’un chimioattractant à travers plusieurs concentrations différentes de collagène, tout en gardant le système simple et convivial pour la microscopie à force de traction (TFM) et l’analyse de corrélation de volume numérique (DVC).

Introduction

Le mouvement préféré de cellules vers un gradient de concentration, connu comme le chimiotactisme, joue un rôle important dans les processus physiologiques et pathologiques dans le corps. De tels exemples sont la peau et les muqueuses ^une cicatrisation des plaies, la morphogenèse ^{2, 3} inflammation, et ^4,5 de la croissance tumorale. Il a également été montré que les cellules cancéreuses peuvent migrer à travers les deux stratégies de migration de cellule ⁶ individuels et collectifs. En outre, des mécanismes d'instabilité diffusionnels peuvent induire la séparation des cellules individuelles ou groupées d'un corps / o....

Protocole

1. 3D Mold Design et pièces de rechange

1. Moule
   1. Avant de travailler, obtenir une trousse d'élastomère de silicone, une chambre d'imagerie des cellules vivantes, une lamelle de verre de 22 mm, et un cube de métal aluminium usiné avec des dimensions de 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Préparer la chambre d'imagerie des cellules vivantes pour le moulage en plaçant la lamelle couvre-objet dans le support inférieur et l'assemblage du reste de la chambre comme indiqué par le fournisseur.
   2. Ensuite, en utilisant une pince, placez le cube en aluminium usiné de métal dans le milieu de la imagerie cellulaire logements en direct de la chambre et sur le de....

Résultats

La capacité de cet essai pour évaluer avec précision la migration de la cellule repose sur un bon réglage du système. Par conséquent, il est essentiel pour Assurez-vous de concevoir le moule du système de diffusion précise et prendre grand soin de placer des lamelles à la fois hydrophobes et hydrophiles, comme illustré sur la figure 1. Si le système est bien conçu et pendant la phase de modélisation de la diffusion assurer de trouver un très bonne ligne de départ linéaire, on est en mesure d'atteindre b.......

Discussion

Les étapes les plus critiques pour les expériences réussies de diffusion avec ou sans cellules sont: configurer correctement l'ensemble de moule; le développement de la dextérité manuelle nécessaire pour empêcher des dommages lors de l'extraction des lamelles hydrophobes; assurer de trouver une très bonne ligne de départ linéaire pour calculer correctement le coefficient de diffusion; corriger les calculs expérimentaux de collagène et chimioattractive; utiliser correctement de système d'imagerie de cellules .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit élastomère de silicone	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	une misture en deux parties avec un mélange 10:1
Chambre d’imagerie de cellules vivantes	Instrument de cellules vivantes	CM-B18-1	CMB pour 18  ; lamelles rondes mm
22  ; mm Lamelle de protection en verre	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. 22  ; mm 1.5
			métallique en aluminium usiné
Hobby Utility	knife X-Acto	X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc	00216A-10	Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube	Fisher Scientific	14-432-22	Sol standard modèle et centrifugeuses de table Boîte
de Pétri en verre	Fisher Scientific	08-747A	Boîtes de Pétri réutilisables : Complète (60 x 15  ; mm)
Pince	Fisher Scientific	22-327-379	Pince à pointe fine
Lunettes de protection	Fisher Scientific	12-518-105A	Rectangle ; 30 x 22  ; mm; Epaisseur n° 1
Tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyle	Gelest	SIT8174.0
Acide acétique	Sigma-Aldrich	320099	Acide acétique Réactif ACS, &ge ; 99,7 %
Hexane	Sigma-Aldrich	296090	anhydre, 95 %
Alcool éthylique	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, pour la biologie moléculaire
Outil de traçage en diamant de haute précision	Lunzer	PV-081-3	Pointe allongée droite, .020" (.50  ; mm) de diamètre de 0,200" (5,0 mm) longueur de l’embout
Graisse sous vide	Dow Corning	14-635-5C	Graisse sous vide poussé
Tube de 15 ml	Fisher Scientific	14-959-49D	Tubes à centrifuger coniques de 15 ml avec surface hydrophobe et biologiquement inerte
Solution tamponnée au phosphate 10x	Fisher Scientific	BP399-500	1,37 M de chlorure de sodium, 0,027 M de chlorure de potassium et 0,119 M de tampon de phosphate
1  ; N hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	38215	Concentré d’hydroxyde de sodium
Collagène I, queue de rat	BD Biosciences	354236	queue de rat  ;
Micro tube à centrifuger	Fisher Scientific	02-681-332	Contenance : 2,0 ml ; O.D. x L : 13  ; x  ; 40  ; mm; stérile ; single-wrapped
[en-tête]
Microsphères modifiées au carboxylate	Invitrogen	; F-8813	Microsphères modifiées au carboxylate, 0,5 & micro ; m, jaune-vert fluorescent (505/515), 2 % de solides
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamine B pour fluorescence