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Dans cet article
Résumé
Résumé
La co-infection par le paludisme et le VIH est une priorité croissante en matière de santé. Cependant, la plupart des recherches sur le paludisme ou le VIH se concentrent actuellement sur chaque infection individuellement. Bien qu’il soit essentiel de comprendre la dynamique de la maladie pour chacun de ces agents pathogènes indépendamment, il est également important que les interactions entre ces agents pathogènes soient étudiées et comprises.
Nous avons développé un modèle in vitro polyvalent de co-infection VIH-paludisme pour étudier les réponses immunitaires de l’hôte au paludisme dans le contexte de l’infection par le VIH. Notre modèle permet d’étudier les facteurs sécrétés dans les surnageants cellulaires, les marqueurs de protéines de surface cellulaire et intracellulaires, ainsi que les niveaux d’expression de l’ARN. La conception expérimentale et les méthodes utilisées limitent la variabilité et favorisent la fiabilité et la reproductibilité des données.
Tous les agents pathogènes utilisés dans ce modèle sont des agents pathogènes naturels pour l’homme (Plasmodium falciparum et VIH-1), et toutes les cellules infectées sont naturellement infectées et utilisées fraîches. Nous utilisons des érythrocytes humains parasités par P. falciparum et maintenus en culture in vitro continue. Nous obtenons des cellules mononucléées du sang périphérique fraîchement isolées à partir de volontaires infectés par le VIH de manière chronique. Chaque affection utilisée fait l’objet d’un contrôle approprié (P. falciparum parasité par rapport aux érythrocytes normaux), et chaque donneur infecté par le VIH a un témoin non infecté par le VIH, à partir duquel les cellules sont prélevées le même jour. Ce modèle fournit un environnement réaliste pour étudier les interactions entre les parasites du paludisme et les cellules immunitaires humaines dans le contexte de l’infection par le VIH.
Introduction
Co-infection, l'infection par de multiples infections simultanées, est la norme dans les milieux naturels. Co-infection peut avoir un impact majeur sur la pathologie de la maladie et sur la prise en charge clinique de chaque infection. Dans le cadre de la co-infection, le vaccin et l'efficacité des médicaments, ainsi que des tests de diagnostic, peut être eu une incidence négative (revue en 1). Cependant, malgré son importance, la majorité des recherches de l'agent pathogène considère seulement les infections simples.
Le paludisme et le VIH-1 (VIH) sont les principales causes de morbidité et de mortalité dans le mon....
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Protocole
Ce protocole exige le recrutement de donateurs pour le sérum et RBC à être utilisés pour la culture du parasite, et le VIH (+) et non infectés donateurs pour CMSP isolement. Institutional Review Board doivent approuver toutes les études et tous les donateurs doivent fournir un consentement éclairé avant le prélèvement de sang.
ATTENTION: Travailler avec des échantillons de sang humain et parasites du paludisme humain nécessite des mesures de précaution. Toujours porter une blouse, des gants, et le travail dans une armoire de biosécurité de niveau 2. En cas d'exposition percutanée accidentelle au paludisme humain, un rapport à la santé....
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Résultats
Les graphiques représentent les niveaux de la production d'IFNy par les cellules NKT (figure 2), en utilisant CD56 + CD3 + γδ- portes pour obtenir la population de cellules NKT (données non présentées). Les cellules ont été cultivées pendant 72 heures avant la coloration. Une fois colorées, 100.000 cellules CD3 + ont été acquis sur le cytomètre de flux pour obtenir une population suffisamment large de NK, NKT et les cellules yô (cellules d'intérêt). Un minimum de 5600 cellules NKT sont affichés .......
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Discussion
Notre protocole a été optimisé afin d'étudier plus réaliste la co-infection VIH-de paludisme in vitro. Tout d'abord, les globules rouges humains frais et le sérum sont nécessaires pour la culture du parasite du paludisme. Ceci est essentiel pour obtenir une population saine des parasites du paludisme. Lysats parasite ne peut pas être remplacé par des parasites vivants que la production de cytokines est beaucoup plus rapide et intense lors de l'utilisation en direct P. falciparum infecté RBC.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
C.A.M.F. et L.S. ont participé à la conception du protocole, à l’acquisition et à l’analyse des données, et à la rédaction de l’article.
Les auteurs souhaitent remercier le Dr Kain, le Dr Loutfy, le Dr Wasmuth et le Dr Ayi pour leurs contributions.
C.F. a été soutenu par une bourse postdoctorale du CTN/Réseau ontarien de traitement du VIH (OHTN). L.S. est soutenu par une bourse de développement de chercheur junior de l’OHTN. Les travaux ont été financés par une subvention de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (MOP-13721 et 115160) et une subvention catalyseur de nouveau chercheur....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| anticorps anti-alanine | Sigma | A7377 | |
| (voir autre tableau) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm avec BD GolgiPlug | BD | 555028 | comprend la brefeldine A, le tampon cytofix/cytoperm et le tampon perm/wash |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparine | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (sans calcium, sans magnésium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | inactivation par la chaleur avant utilisation |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycine (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycine | Sigma | I3909 | |
| MEM acides aminés non essentiels (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 poudre | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 avec L-glutamine et HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| Bicarbonate de sodium (poudre, culture cellulaire) | Sigma | S5761 | |
| Pyruvate de sodium (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (base Trizma) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0,4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | dépend des anticorps utilisés |
| Mélange de gaz parasitaire Sur | commande | 3 % CO2, 1 % O2, équilibre N2 | |
| >Equipment | |||
| 0.2 μ ; Unité | |||
| Lames | |||
| Fioles | |||
| Fioles T75 Tubes | |||
| 50 ml Plaques | |||
| de culture 24 puits | |||
| débouchées Pipettes | |||
| Pasteur | bouchées | ||
| pipettes de transfert stériles | |||
| hémocytomètre | |||
| en flux cytomètre (laser 3) | |||
| Anticorps utilisés pour la cytométrie en flux | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μ ; l |
| Anti-IFNγ ; | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μ ; l |
| Biolegend anti-CD8 | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μ ; l | |
| Biolégende anti-CD14 | ; BD Biosciences | 325624 ; 551487 | Biotine (fluorophore) 0,5 μ ; l Streptavine PE-TR (fluorophore) 0,1 μ ; l |
| Biolegend anti-CD56 | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μ ; l | |
| Anti-γ ; δ ; | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μ ; l |
| Biolegend anti-CD3 | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μ ; l | |
| Biolegend anti-CD4 | 317424 | Bleu Pacifique (fluorophore) 1 μ ; l |
Références
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
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