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Article de méthode

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DOI :

10.3791/52969

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6 octobre 2015

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1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

Dans cet article

Résumé

La co-infection humaine est difficile à reproduire in vitro. Cependant, les parasites humains du paludisme peuvent facilement être cultivés in vitro, tout comme les cellules mononucléées du sang périphérique humain fraîchement isolées naturellement infectées par le VIH. Il s’agit d’un excellent modèle pour l’étude des réponses immunitaires précoces aux parasites du paludisme dans le contexte de la co-infection par le VIH.

Résumé

La co-infection par le paludisme et le VIH est une priorité croissante en matière de santé. Cependant, la plupart des recherches sur le paludisme ou le VIH se concentrent actuellement sur chaque infection individuellement. Bien qu’il soit essentiel de comprendre la dynamique de la maladie pour chacun de ces agents pathogènes indépendamment, il est également important que les interactions entre ces agents pathogènes soient étudiées et comprises.

Nous avons développé un modèle in vitro polyvalent de co-infection VIH-paludisme pour étudier les réponses immunitaires de l’hôte au paludisme dans le contexte de l’infection par le VIH. Notre modèle permet d’étudier les facteurs sécrétés dans les surnageants cellulaires, les marqueurs de protéines de surface cellulaire et intracellulaires, ainsi que les niveaux d’expression de l’ARN. La conception expérimentale et les méthodes utilisées limitent la variabilité et favorisent la fiabilité et la reproductibilité des données.

Tous les agents pathogènes utilisés dans ce modèle sont des agents pathogènes naturels pour l’homme (Plasmodium falciparum et VIH-1), et toutes les cellules infectées sont naturellement infectées et utilisées fraîches. Nous utilisons des érythrocytes humains parasités par P. falciparum et maintenus en culture in vitro continue. Nous obtenons des cellules mononucléées du sang périphérique fraîchement isolées à partir de volontaires infectés par le VIH de manière chronique. Chaque affection utilisée fait l’objet d’un contrôle approprié (P. falciparum parasité par rapport aux érythrocytes normaux), et chaque donneur infecté par le VIH a un témoin non infecté par le VIH, à partir duquel les cellules sont prélevées le même jour. Ce modèle fournit un environnement réaliste pour étudier les interactions entre les parasites du paludisme et les cellules immunitaires humaines dans le contexte de l’infection par le VIH.

Introduction

Co-infection, l'infection par de multiples infections simultanées, est la norme dans les milieux naturels. Co-infection peut avoir un impact majeur sur la pathologie de la maladie et sur la prise en charge clinique de chaque infection. Dans le cadre de la co-infection, le vaccin et l'efficacité des médicaments, ainsi que des tests de diagnostic, peut être eu une incidence négative (revue en 1). Cependant, malgré son importance, la majorité des recherches de l'agent pathogène considère seulement les infections simples.

Le paludisme et le VIH-1 (VIH) sont les principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les zones de paludisme endémique et VIH partagent un large chevauchement géographique, en mettant des millions de personnes à risque de co-infection et par conséquent un risque de maladie clinique plus sévère 2 - 10. Les deux maladies interagissent négativement. Chez les personnes infectées par le VIH, la hausse des charges virales de VIH et des diminutions temporaires de CD4 + lymphocytes T peut être vu lors d'une infection par le paludisme, tandis quepaludisme charges parasitaires et risque de paludisme clinique et grave sont plus élevés dans les individus co-infectés 2,3,5,7,8,10. Les mécanismes par lesquels le VIH augmente la gravité du paludisme ne sont pas entièrement comprises et justifient une enquête plus approfondie.

Nous décrivons ici une méthode par laquelle le paludisme et la co-infection VIH peut être étudiée in vitro. Plus précisément, cette méthode permet à l'examen des réponses immunitaires spécifiques contre le paludisme dans le contexte de l'infection à VIH. Notre protocole décrit un système polyvalent de co-culture en utilisant des cellules mononucléaires de sang périphérique fraîchement isolées (PBMC) isolées de donneurs infectés chroniquement par le VIH in vitro et en culture P. falciparum parasité érythrocytes (PfRBC). L'impact du traitement antirétroviral sur ces réponses peut également être examiné en utilisant PBMC recueillies de façon prospective du VIH (+) donateurs pré- et post-traitement.

Nous avons utilisé ce système pour étudier l'impact de l'infection à VIHsur les réponses immunitaires innées spécifiques au paludisme 11,12, et ont pu déterminer que IFN-y et TNF réponses spécifiques au paludisme sont altérées dans les cellules NK, les cellules NKT, yô cellules du VIH (+) donateurs pré- et post-traitement antirétroviral VIH T . En outre, nous avons été en mesure d'utiliser ce système pour déterminer que les fonctions monocytaires sont également affaiblies par le VIH (+) les bailleurs de fonds, mais récupérer post-VIH thérapie antirétrovirale.

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Protocole

Ce protocole exige le recrutement de donateurs pour le sérum et RBC à être utilisés pour la culture du parasite, et le VIH (+) et non infectés donateurs pour CMSP isolement. Institutional Review Board doivent approuver toutes les études et tous les donateurs doivent fournir un consentement éclairé avant le prélèvement de sang.

ATTENTION: Travailler avec des échantillons de sang humain et parasites du paludisme humain nécessite des mesures de précaution. Toujours porter une blouse, des gants, et le travail dans une armoire de biosécurité de niveau 2. En cas d'exposition percutanée accidentelle au paludisme humain, un rapport à la santé et la sécurité pour le traitement prophylactique. Facteur de sécurité supplémentaire devrait également être mis en place pour travailler avec (+) VIH dans le sang. Porter une blouse de laboratoire dos fermeture. Double gant (en haut gant doit être latex). Effectuer toutes les manipulations dans une armoire de biosécurité de niveau 2. Ne pas utiliser de verre ou des objets pointus. Ne pas utiliser l'aspirateur. Placez tous les objets contaminés dans une solution de Virox ou eau de Javel pour un minimum de 1 heure avant de les jeter.Lavez toutes les surfaces avec Virox et UV pendant 1 heure après leur utilisation. Notez que chaque institution auront leurs propres réglementations de biosécurité spécifiques qui doivent être suivies. Signaler toutes les expositions accidentelles au sang infecté par le VIH à la santé et la sécurité pour l'évaluation et l'examen de la prophylaxie post-exposition possibles.

Remarque: Différentes souches de P. parasites de la malaria falciparum existent. ITG a été utilisé pour ces expériences, mais différentes souches peut être utilisé. Excellentes instructions sur la congélation et la décongélation Plasmodium falciparum parasites sont disponibles sur le site MR4 13.

1. Faire RPMI-A pour Parasite du paludisme Culture

  1. Ajouter RPMI-0 en mélangeant 950 ml d'ddH 2 O, 1 paquet de poudre RPMI-1640, 6 g d'HEPES, 2 g de bicarbonate de sodium et 1,35 mg d'hypoxanthine.
  2. La chaleur Thaw inactivé sérum humain provenant de deux donneurs différents. AB donateurs sont mieux, mais tout peut être utilisé si les parasites sont cultivés dans de type Oles globules rouges (RBC). Inversez tubes pour mélanger. Si le sérum contient des particules ou est épaisse rotation à 2000 tpm, puis filtrer partie liquide en utilisant une unité de 0,45 um filtre.
  3. L'utilisation d'un filtre de 0,2 pm de l'unité de filtre 180 ml de RPMI-0, 20 ml de sérum humain (10 ml de chaque donneur) et 0,5 ml de 10 mg / ml de gentamycine.
    Remarque: le sérum humain peut obstruer le filtre de façon plus d'une unité de filtrage peut être nécessaire.
  4. Marquer la bouteille moyenne avec RPMI-A, la date et la source du sérum. Réfrigérer jusqu'au moment requis. RPMI-A peut devenir trouble lorsque réfrigéré. Ceci est normal, mais augmentation de la nébulosité est un signe de contamination.
    Note: La croissance Parasite peut varier dans le sérum de donneur différent. Il est une bonne idée de tester tous les lots de sérum humain pour une bonne croissance du parasite avant d'utiliser.

2. Préparation des globules rouges du sang humain pour Parasite Culture

Note: Les donneurs de sang doivent être de type O.

  1. Recueillir 7-10 ml de sang en acide cit-(ACD) tubes de taux-dextrose. Donnez votre ID et la date de la collecte sur l'étiquette du donateur.
  2. Le sang de magasin à 4 o C jusqu'à ce que nécessaire. Utilisez le sang pour les cultures de parasites délai de 1 mois.
  3. Nettoyez le dessus du tube avec 70% d'éthanol. Retirez délicatement le bouchon et le jeter. Transférer le sang dans un tube de 15 ml. Spin 3 min à 1000 x g. Retirer plasma par aspiration.
  4. Suspendre RBC avec un volume égal d'eau tiède RPMI-0. Spin pendant 5 min à 1000 x g. Retirer la couche leucocytaire par aspiration, remettre en suspension dans 5 ml de RPMI-0 et répéter le lavage 2 fois plus.
  5. Eliminer le surnageant et ajouter suffisamment RPMI-A pour produire un mélange qui est de 50% en volume de RBC.
  6. Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

3. Maintenir Cultures Parasite

  1. Préchauffer RPMI-A à 37 o C.
  2. Placer parasites décongelées (voir protocole MR4 traité selon la procédure de décongélation) dans une fiole T25 avec 5 ml de RPMI-A et de 75 ul de RBC humain lavé pour un hématocrite de ~ 3%.Remarque: hématocrite mesure le volume des globules rouges par rapport au volume total. Pour calculer l'hématocrite mesurer le volume de culot globulaire au volume total de milieu plus RBC. Supposons que les parasites décongelés contribueront 75 pi de RBC. En ajoutant 150 pi de RBC stock (ce qui est équivalent à l'ajout de 75 pi de culot globulaire) dans le ballon, il ya un total de 150 pi de RBC dans 5 ml de milieu, ce qui équivaut à un hématocrite de 3% (150 pl / 5000 pi x 100% = 3%).
  3. Gaz, le flacon pendant 30 secondes avec mélange de gaz parasite (1% de O 2, CO 3 2%, l'équilibre de N 2). Sceller et placer le côté large du flacon vers le bas dans un incubateur 37 ° C pour permettre à la plus grande aire de surface pour l'échange de gaz.
  4. Pour changer le moyen et vérifier la parasitémie (qui doit être fait tous les jours), déplacer le ballon avec précaution pour ne pas perturber la couche de RBC. En utilisant une pipette Pasteur stérile débranché soutirer le milieu de culture sans déranger la couche de sang.
  5. Pour vérifier parasitemia, supprimer un échantillon de 10 pi de la couche de sang, le placer sur une lame de verre et en utilisant une deuxième lame de verre créer un frottis sanguin. Laisser lame sécher.
  6. Placez 4 ml de RPMI frais-A dans le flacon, mélanger délicatement, de gaz pendant 30 secondes, et le lieu dans un incubateur à 37 ° C.
  7. Colorer la lame en utilisant le kit de coloration Hema3 selon le protocole du fabricant.
    1. Pour la coloration optimale, Tremper les lames dans la solution de fixation pendant 10 secondes, la solution I pendant 10 sec, et la solution II pendant 30 sec. Rincer à l'eau et laissez sécher diapositives.
  8. Calculer la parasitémie en comptant le nombre de PfRBC (teinté violet foncé) par rapport au nombre total de RBC (de rose teinté). Comptez un total de 300 cellules pour assurer l'exactitude.
  9. Lorsque parasites ont atteint une parasitémie de 5%, accroître la culture dans un flacon T75, en utilisant 40 ml de RPMI-A, et 500 ul de RBC.

4. Parasite Synchronisation

Remarque: Le jour avant til expérimenter, de synchroniser la culture du parasite par traitement avec l'alanine. Les parasites au stade anneau seulement et non infecté RBC survivent à ce traitement. La synchronisation d'Alanine vous donnera une culture trophozoïte le lendemain pur qui peut être utilisé dans les expériences de co-culture. Assurez-vous de commencer par une culture de parasites qui contient la majorité des parasites au stade anneau.

  1. Préparer une solution d'alanine en mélangeant 8,01 g d'alanine (300 mM) et 0,365 g de Tris (10 mM) dans 300 ml d'ddH 2 O. Apportez pH à 7,4. Stériliser par filtration en utilisant une unité de filtre de 0,2 um.
  2. Préchauffer la solution de l'alanine à 37 o C.
  3. Isoler la culture du parasite (5 min x 1 000 x g), et éliminer le milieu.
  4. Remettre en suspension le culot dans 19 volumes d'une solution d'alanine (1 ml emballés RBC 19 ml de solution alanine). Incuber pendant 15 min à température ambiante.
  5. Spin 5 min x 1000 x g. Aspirer surnageant. Laver dans du RPMI-0 fois. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans RPMI-A et ajuster hématocrite à ~ 3%. gcomme ballon et retour à 37 o C.
    Remarque: Pour les expériences de co-culture une parasitémie minimum de 5% trophozoïtes est nécessaire, avec 10% de parasitémie considéré comme optimal.

5. Parasite et RBC Préparation pour les expériences de co-culture

  1. Utiliser un ratio de 3 PfRBC par PBMC dans des expériences de co-culture pour induire une réponse inflammatoire. Pour calculer le total PfRBC, de quantifier la parasitémie en faisant un frottis mince de sang comme décrit dans 3.5, et de l'hématocrite en comptant le nombre de RBC par ml de culture de parasites en utilisant un hémocytomètre.
    Nombre de PfRBC =% de parasitémie x Total de RBC / ml x ml de culture. Par exemple: 10 ml de culture à 10 x 10 6 RBC / ml et 10% de parasitémie est égale à 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC.
  2. Faites tourner la culture de parasites pendant 5 min à 1000 xg (RT). Aspirer le milieu et remettre en suspension à 6 x 10 6 par ml PfRBC dans du RPMI-S + (500 ml de RPMI-1640 additionné de L-glutamine et HEPES, 10% de la chaleurFBS inactivé, 1,5 ml de gentamicine, 5 ml de pyruvate de sodium 100 mM, 5 ml de 10 mM MEM acides aminés non essentiels, 5 ml de 5 mM de β-mercaptoéthanol).
  3. Prenez sang témoin (non infectés RBC provenant du même donneur utilisé pour le maintien de la culture de parasites), calculer l'hématocrite et de remettre en suspension dans RPMI-S + au même nombre de RBC par ml que la culture de parasites.

6. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC)

  1. Prélever le sang veineux dans des tubes d'héparine de sodium (en haut vert) à la fois du VIH (+) donneur chronique et un VIH (-) contrôle. Ne pas utiliser de l'EDTA comme anticoagulant chélatant le calcium en tant que l'action de l'EDTA affecte la fonction cellulaire. En moyenne, attendre entre 5-10 x 10 6 PBMC par 10 ml de sang. Pour une expérience typique de recueillir 30 ml de sang de chaque donneur. Le volume de sang devra être ajustée en fonction des exigences expérimentales.
  2. Aussi rapidement que possible et certainement moins d'une heure de sang sont recueillis,retirer le sang dans les tubes et les placer dans un tube de 50 ml en plastique. Monocytes en particulier seront activés et collent au verre, il est donc important que les cellules si les tubes de collecte de sang de verre sont utilisés sont retirés le plus rapidement possible.
  3. Spin le sang à 1000 g pendant 15 minutes et recueillir le plasma (ce qui peut être utilisé pour d'autres études si nécessaire - sinon cette étape peut être sautée). Diluer le sang dans un volume égal de DPBS froid.
  4. Placer 15 ml de Ficoll RT dans un tube de 50 ml. Lentement, en utilisant un transfert en plastique pipette stérile, la couche la solution / DPBS de sang sur le Ficoll sans mélange. Un maximum de 25 ml de solution de sang / DPBS peut être posés au-dessus de chacune 15 ml de Ficoll.
  5. Faites tourner les gradients pendant 30 min à température ambiante à 600 x g. Assurez-vous que le paramètre «sans frein» sur.
  6. Une fois que les cellules ont filé, regardez pour l'interface entre les deux phases. Ceci est où le CMSP sont. En utilisant une pipette de transfert en plastique stérile recueillir les PBMC de l'interface (voirFigure 1). Minimiser la contamination par RBC.
  7. Placer les cellules recueillies dans des tubes de 50 ml, avec pas plus de 20 ml par tube. Le tube supérieur jusqu'à 50 ml avec du DPBS froid stériles.
  8. Faites tourner les cellules pendant 10 min à 4 o C à 300 x g.
  9. Rejeter le surnageant, remettre le culot dans 5 ml DPBS froid stériles et mettre en commun toutes les cellules d'un même donneur dans un tube. Haut up à 50 ml avec DPBS stériles, et répétez les étapes du lavage 2 fois plus.
  10. Resuspendre les cellules dans 10 ml de RPMI-S + milieu.
  11. Retirer une aliquote de 20 pi et mélanger avec 20 pi de bleu trypan. Pipette 10 ul dans un hémocytomètre et compter les cellules vivantes (cellules qui ne sont pas prises le colorant bleu - toutes les cellules bleues sont morts). Utiliser un hémocytomètre pour calculer le nombre de cellules dans une solution de la façon suivante.
    Remarque: un hémocytomètre a une grille de dimensions spécifiées de telle sorte que la zone couverte par les lignes est connue.
    1. Assurez-vous que l'hémocytomètre est propre. Placer la lamelle couvre-objet sur la Countizone ng. Charge 10 pi de solution de cellules en plaçant la pointe de la pipette dans l'un des puits en forme de V. L'aire sous la lamelle va remplir par capillarité.
    2. Placez le chargé hémocytomètre sous un microscope. La grille complète de l'hémocytomètre contient 9 carrés de 1 mm 2 chacune. Comptez toutes les cellules au sein de chaque grand carré. Si trop de cellules sont présentes, diluer la solution encore et recomptage.
    3. Calculer la concentration cellulaire de la façon suivante: les cellules totales / ml = (nombre total de cellules comptées / # de carrés) x facteur de dilution x 10000 cellules / ml, par exemple, (500 cellules / 5 carrés) x facteur de dilution de 20 x 10000 cellules / ml = 20 x 10 6 cellules au total.
  12. Ajuster milieu à une concentration finale de 10 x 10 6 par ml (RPMI-S + milieu).

7. Paludisme / Co-infection par le VIH Culture

  1. Plaque 100 pi de CMSP isolées et 400 pi de RPMI-S + support à une plaque de 24 puits (1 x 10 6 PBMC par puits). Assurerque les puits sont mis en place en trois exemplaires: 3 puits pour non infecté RBC, 3 puits avec PfRBC, 3 puits avec du milieu, et 3 puits avec PMA / ionomycine. Ceci est à la fois pour le VIH (+) et le VIH (-) de l'échantillon.
  2. Pour la PfRBC puits, placer 3 x 10 6 PfRBC dans chacun des puits (500 ul de la culture de parasite préparés 5,2).
  3. Pour les puits non infectés RBC, placer 500 ul de la culture non infectée RBC préparé en 5.3 dans chacun des puits.
  4. Pour les moyennes des puits, 500 ul de placer RPMI-S + milieu dans chacun des puits.
  5. Pour PMA / ionomycine puits, préparer la solution de PMA / ionomycine (2,5 pg / ml, 250 pg / ml respectivement). Placez 500 pi de cette solution dans chaque puits.
    Remarque: Comme stimulateurs puissants de cytokine des cellules T sécrétion, PMA et ionomycine sont utilisés comme témoin positif pour assurer les cellules sont fonctionnels.
  6. Placer la plaque à 37 o C dans un incubateur à CO 2 de 5%.
  7. En option: utiliser des cellules en excès pour l'analyse phénotypique par cytométrie en flux ou entreposer dans un RNUne solution de stabilisation à l'avenir analyse de l'expression de l'ARNm.

8. Détection des réponses immunitaires contre le paludisme

Remarque: Effectuez des expériences de co-culture aussi longtemps que 4 jours. Aucun changement moyen est nécessaire pendant cette période. Le moment optimal dépendra du type de cellule d'intérêt et la question posée. Une incubation de 12-48 heures est optimal pour les réponses monocytiques à PfRBCs, tandis que les réponses des lymphocytes ont été mieux observé à 72-96 h. Les points de temps devront être optimisé basé sur la question expérimentale. Des périodes plus courtes (2-4 hr) peuvent être utilisés si l'interaction entre intacte PfRBC et CMSP est d'intérêt.

  1. Plaque de Spin à 300 g pendant 3 min au culot de cellules. Recueillir 700 pi de surnageant de culture de chaque puits.
  2. Spin surnageant à 1000 g pendant 5 min à claire de tous les débris.
  3. Aliquote effacé surnageant au besoin, l'étiquette, et le gel au-dessous de -20 ° C jusqu'à l'analyse des facteurs sécrétés est d'être performée.
  4. Analyser les réponses des cytokines / chimiokines par ELISA ou par réseau de billes (suivre les protocoles suggérés par le fabricant).
  5. Recueillir les cellules restantes dans la plaque dans une solution de stabilisation de l'ARN et à utiliser pour l'analyse de l'expression des ARNm par PCR 14 à 16 quantitative en temps réel.

9. intracellulaire de cytométrie en flux de réponses de Ccytokine spécifiques aux cellules utilisant PBMC co-cultivées avec P. falciparum Infected RBC

Remarque: Comme mentionné ci-dessus la longueur de la co-culture dépendra du type cellulaire d'intérêt. Si vous êtes intéressé dans les réponses à monocytiques PfRBC une période d'incubation plus courte est nécessaire. Fois sera plus longue pour les réponses des lymphocytes T innées yô cellules, les cellules NK, les cellules NKT), et plus encore pour les cellules T CD4 et CD8. Optimisation sera nécessaire.

  1. 6-8 heures avant l'analyse ajouter 1 pl de 1,000x brefeldine A à tous les puits. Retourner la plaque à 37 o C incubateur. Après 6-8 h Incubation, placez la plaque sur la glace pendant 15 min.
  2. Éliminer les cellules des puits en utilisant pipetage vigoureux et les placer dans des tubes de microcentifuge étiquetés. Grattage peut être nécessaire pour éliminer les monocytes.
  3. Spin cellules pendant 5 min à 1000 x g. Retirer surnageants. Resuspendre les cellules dans 500 pi cytométrie en flux tampon (1x DPBS, 2% de FBS inactivé à la chaleur, de l'azoture de sodium à 0,02%).
  4. Cellules de diviser afin que chaque échantillon a: un tube pour la coloration d'anticorps pleine (240 pi), et un tube de coloration fluorescente moins un (FMO) d'anticorps de contrôle (240 pi). En commun une petite quantité de chaque échantillon (20 pi) pour l'écoulement des souillures cytométrie de contrôle (ce qui sera utilisé dans la mise en place du cytomètre de flux).
  5. Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
  6. Incuber les cellules avec CD16 non conjugué anti-humain / CD32 (5 ug / ml) dans 50 ul de cytométrie en flux de tampon pendant 15 min à 4 ° C pour bloquer les récepteurs Fc.
  7. Ajouter 1 ml de tampon de cytométrie de flux à chaque tube. Spin CElls pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
  8. Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon de cytométrie flux avec une concentration pré-titré d'anticorps conjugué à un fluorophore à des marqueurs de surface de cellules désirées. Solution assez anticorps pré-mélange pour tous les échantillons à colorer. Incuber les cellules à 4 ° C pendant 20 min. Protéger de light.Note: Montant de chaque anticorps devra être optimisé. Nous régulièrement tache pour CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Volumes titrée pour ces anticorps sont présentés dans le tableau 1.
  9. Ajouter 1 ml de tampon de cytométrie de flux à chaque tube. Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
  10. Ajouter 100 ul de solution Cytofix / Cytoperm de chaque tube. Incuber les cellules pendant 20 min à 4 ° C Protéger de la lumière.
  11. Ajouter 1 ml de tampon Perm / lavage (10x concentré comme prévu - diluer à 1x utilisant ddH 2 O) à chaque tube. Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
  12. Ajouter 100 μl de Perm / tampon de lavage aux tubes anticorps de coloration de contrôle FMO et mélanger pour remettre en suspension les cellules.
  13. Ajouter 100 ul de tampon Perm / cycle de lavage avec une concentration pré-titré d'anticorps conjugué à un fluorophore de marqueurs intracellulaires souhaités (par exemple, des cytokines / chimiokines) à tubes pleins anticorps de coloration.
    Remarque: Quantité de chaque anticorps devra être optimisée. Nous régulièrement tache avec des anti-IFN-y des anticorps anti-TNF et. Volumes titrée pour ces anticorps sont présentés dans le tableau 1.
  14. Incuber tous les tubes pendant 30 minutes à 4 ° C Protéger de la lumière.
  15. Ajouter 1 ml de tampon Perm / Wash à chaque tube. Spin cellules pendant 5 min à 500 x g. Retirer surnageants.
  16. Resuspendre les cellules dans 300 ul de tampon cytométrie de flux avec 1% de paraformaldehyde. Laisser reposer pendant un minimum de 15 min pour neutraliser le VIH.
  17. Préparer anticorps à un seul échantillons colorés en utilisant des billes de rémunération, être utilisé pour la compensation mis en place sur le cytomètre de flux. Le type de compensationperles dépendront des anticorps utilisés (par exemple., Ig anti-souris, anti-rat / Ig de hamster). Perles de vortex. Ajouter une goutte de perles par anticorps. Ajouter des quantités égales de anticorps utilisés pour la coloration. Ajouter 200 pi de cytométrie en flux tampon. Ceux-ci sont maintenant prêts à l'emploi. Il n'y a pas besoin de laver les billes.
  18. Acquérir des échantillons sur un cytomètre de flux dès que possible et dans les 24 heures pour de meilleurs résultats. Tandem colorants sont sensibles à la dissociation avec le stockage de sorte que nous recommandons l'acquisition immédiate si possible.

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Résultats

Les graphiques représentent les niveaux de la production d'IFNy par les cellules NKT (figure 2), en utilisant CD56 + CD3 + γδ- portes pour obtenir la population de cellules NKT (données non présentées). Les cellules ont été cultivées pendant 72 heures avant la coloration. Une fois colorées, 100.000 cellules CD3 + ont été acquis sur le cytomètre de flux pour obtenir une population suffisamment large de NK, NKT et les cellules yô (cellules d'intérêt). Un minimum de 5600 cellules NKT sont affichés ...

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Discussion

Notre protocole a été optimisé afin d'étudier plus réaliste la co-infection VIH-de paludisme in vitro. Tout d'abord, les globules rouges humains frais et le sérum sont nécessaires pour la culture du parasite du paludisme. Ceci est essentiel pour obtenir une population saine des parasites du paludisme. Lysats parasite ne peut pas être remplacé par des parasites vivants que la production de cytokines est beaucoup plus rapide et intense lors de l'utilisation en direct P. falciparum infecté RBC...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

C.A.M.F. et L.S. ont participé à la conception du protocole, à l’acquisition et à l’analyse des données, et à la rédaction de l’article.

Les auteurs souhaitent remercier le Dr Kain, le Dr Loutfy, le Dr Wasmuth et le Dr Ayi pour leurs contributions.

C.F. a été soutenu par une bourse postdoctorale du CTN/Réseau ontarien de traitement du VIH (OHTN). L.S. est soutenu par une bourse de développement de chercheur junior de l’OHTN. Les travaux ont été financés par une subvention de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (MOP-13721 et 115160) et une subvention catalyseur de nouveau chercheur des IRSC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
anticorps anti-alanineSigmaA7377
(voir autre tableau)
BD Cytofix/Cytoperm avec BD GolgiPlugBD555028comprend la brefeldine A, le tampon cytofix/cytoperm et le tampon perm/wash
BD Vacutainer ACD Solution ABD364506
BD Vacutainer Sodium HeparineBD17-1440-02
DPBS (sans calcium, sans magnésium)Corning21-031-CV
Fetal Bovine SerumSigmaF1051inactivation par la chaleur avant utilisation
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
gentamycine (10 mg/ml)Gibco15710-064
Hema3 Staining SetFisher122-911
HEPESFisherBP310-500
hypoxanthineSigmaH9636
IonomycineSigmaI3909
MEM acides aminés non essentiels (10 mM)Gibco11140
PMASigmaP8139
RPMI-1640 poudreLife-Technologies31800-022
RPMI-1640 avec L-glutamine et HEPESThermo ScientificSH30255.01
Bicarbonate de sodium (poudre, culture cellulaire)SigmaS5761
Pyruvate de sodium (100 mM)Gibco11360
Tris (base Trizma)SigmaT6066
TrizolAmbion15596018
Trypan Blue (0,4 %)Gibco15250-061
BD CompBeadBD552843, 552845dépend des anticorps utilisés
Mélange de gaz parasitaire Surcommande3 % CO2, 1 % O2, équilibre N2
>Equipment
0.2 μ ; Unité
Lames
Fioles
Fioles T75 Tubes
50 ml Plaques
de culture 24 puits
débouchées Pipettes
Pasteurbouchées
pipettes de transfert stériles
hémocytomètre
en flux cytomètre (laser 3)
Anticorps utilisés pour la cytométrie en flux
Anti-TNFeBiosciences551487FITC (fluorophore) 2 μ ; l
Anti-IFNγ ;Biolegend506507PE (fluorophore) 20 μ ; l
Biolegend anti-CD8300914PE-Cy7 (fluorophore) 1 μ ; l
Biolégende anti-CD14 ; BD Biosciences325624 ; 551487Biotine (fluorophore) 0,5 μ ; l Streptavine PE-TR (fluorophore) 0,1 μ ; l
Biolegend anti-CD56318322PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μ ; l
Anti-γ ; δ ;Biolegend331212APC (fluorophore) 5 μ ; l
Biolegend anti-CD3300426APC-Cy7 (fluorophore) 5 μ ; l
Biolegend anti-CD4317424Bleu Pacifique (fluorophore) 1 μ ; l
spéciale de filtration men verreT25 de

Références

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