Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

8.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/52983

⸱

7 juillet 2015

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La microglie peut influencer les neurones et autres glies en culture par divers mécanismes autonomes non cellulaires. Ici, nous présentons un protocole pour appauvrir sélectivement la microglie à partir de cultures neuronales primaires. Cette méthode a le potentiel d’élucider le rôle des interactions microgliales-neuronales, avec des implications pour les maladies neurodégénératives où la neuroinflammation est une caractéristique caractéristique.

Résumé

Les microglies, les cellules immunocompétentes résidentes du SNC, jouent des rôles multidimensionnels dans la modulation et le contrôle de la fonction neuronale, ainsi que dans la médiation de l’immunité innée. Les modèles de culture cellulaire primaire de rongeurs ont considérablement fait progresser notre compréhension des interactions neuronales-gliales, mais ce n’est que récemment que des méthodes permettant d’éliminer spécifiquement la microglie des cultures mixtes ont été utilisées. L’une de ces techniques – décrite ici – est l’utilisation de l’ester méthylique de L-leucine, un agent lysomotrope qui est internalisé par les macrophages et la microglie, dans lequel il provoque une perturbation lysosomale et une apoptose ultérieure13,14. Les expériences utilisant l’ester méthylique de L-leucine ont le pouvoir d’identifier la contribution de la microglie à l’environnement cellulaire environnant dans diverses conditions de culture. À l’aide d’un protocole optimisé dans notre laboratoire, nous décrivons comment éliminer la microglie de la culture cellulaire de granules cérébelleux de rongeurs P5. Cette approche permet d’évaluer l’impact relatif de la microglie sur les données expérimentales, ainsi que de déterminer si les microglies jouent un rôle neuroprotecteur ou neurotoxique dans des modèles de culture de maladies neurologiques, telles que les accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson.

Introduction

Le cerveau humain comprend environ 85 milliards de neurones et un autre de 85 milliards de cellules non-neuronales, y compris les cellules gliales 1. Pour la plus grande partie des 100 dernières années, les neuroscientifiques ont porté principalement sur la population de cellules neuronales, croyant cellules gliales d'être un peu plus de cellules de soutien passives qui ont fourni un soutien structurel pour les neurones - d'où l'étymologie grecque de «cellules gliales» traduit en anglais «colle». Récemment, cependant, il est devenu de plus en plus évident que les interactions neuronales-gliales peuvent être beaucoup plus fondamentale pour les aspects fondamentaux de la neurobiologie, neurophysiologie, et de la genèse et la progression de nombreuses maladies neurodégénératives. Cellules granulaires du cervelet (SCGC), la population neuronale homogène le plus abondant dans le cerveau humain, dominent le cervelet et représentent plus de 90% de ses constituants cellulaires. En conséquence, ces cellules ont été largement utilisées in vitro comme un système modèle pour til étude du développement neuronal, la fonction et la pathologie 2-6.

Cependant, les cultures de la CCG contiennent encore microglie et d'autres cellules gliales dans des proportions sans doute importantes. En conséquence, les données de la CCG affichant putative réponses neuronales directs à différents traitements de cellules peuvent en fait se produire - en partie ou en totalité - de la réponse secondaire indirecte des cellules gliales voisines dans la culture. Afin d'évaluer cela, nous avons éliminé sélectivement microgliale de la CCG cultures neuronales à l'aide d'ester méthylique de L-leucine (LME). LME est un agent lysomotropic l'origine utilisé pour détruire sélectivement les macrophages 7, et a depuis été utilisé pour épuiser aussi sélectivement la microglie de neurones, des astrocytes, et les cultures mixtes gliales 8,9,10. LME est intériorisée par les macrophages et les microglies, dans laquelle il provoque des perturbations lysosomale et l'apoptose subséquente 13,14. Les macrophages et les cellules microgliales sont caractéristiquement riche dans les lysosomes, les obligeant à être particulièremenrly vulnérables lors de l'exposition à un traitement LME. Ce protocole fournit un moyen puissant, pourtant simple et facile de déterminer la contribution de la microglie dans des expériences utilisant d'autres systèmes de culture neuronales / gliales CGC et.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec le Royaume-Uni Animaux (Scientific Procedures) la loi de 1986.

1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats

  1. Préparer deux ciseaux laboratoire en acier inoxydable de dissection et deux pinces de laboratoire en acier inoxydable. Autoclave tous les instruments et les placer dans une culture hotte O / N sous la lumière ultraviolette (UV) pour la stérilisation.
  2. Ajouter 500 ml de (MEM) du milieu de culture de médias essentiel minimum (10% Foetal Bovine Serum [FBS], 20 mM de KCl, 25 mM de NaHCO 3, 30 mM de D-glucose, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 6 pg / ml d'ampicilline) et stériliser par filtration. Stocker à 4 ° C pendant des mois.
  3. Préparer 24 plaques de culture puits contenant 14 mm, numéro 1 épaisseur lamelles. Autoclaver les lamelles et manteau à 100 mg / L poly-d-lysine (PDL) comme décrit précédemment 3. la lumière UV stériliser O / N.

2. Préparation des solutions CCG Culture

  1. Préparer "solution A '(100 ml) dans l'autoclave, la lumière UV traiter, dH 2 O stérile contenant 250 mg de glucose, 300 mg de sérum-albumine bovine [SAB], 955 mg de solution saline tamponnée au phosphate [PBS] (Ca 2+ et Mg + gratuit), et 1 ml de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
  2. Préparer "solution B" (10 ml) contenant 1 ml de 5 mg / ml de trypsine dilués dans 9 ml de solution A.
  3. Préparer "solution C" (10 ml) contenant 1000 unités de DNase, 0,5 mg d'inhibiteur de trypsine de soja, 100 ul de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, on le dilue à 10 ml avec la solution A.
  4. Préparer "solution D '(20 ml) contenant 3,2 ml de solution C, on le dilue à 20 ml avec la solution A.
  5. Préparer solution saline équilibrée (EBSS) solution de BSA / EBSS contenant Earle, 25 mM de NaHCO 3, 3 mM de MgSO 4 · 7H 2 O, et4% de BSA, pH 7,4, comme décrit précédemment 3.
  6. Préparer LME en ajoutant pur LME dans 5 ml de milieu de culture MEM pour donner une concentration finale de mM LME 150, revenir la solution à pH 7,4 en utilisant un pH-mètre de paillasse, et stériliser par filtration au moyen d'un sulfone de polyéther de 28 mm (PES) de 0,2 um de la seringue filtre.

3. Culture des CGCs

  1. Recueillir cerebella de rats âgés de 4-7 jours comme décrit précédemment 3. Placez immédiatement en boîte de Pétri contenant 5 ml de solution A sur la glace.
  2. Décanter la solution en excès de tissu cerebella et le placer dans le plat couvercle Petri.
  3. Hacher finement le tissu avec une lame de rasoir bien flambé dans au moins trois directions différentes.
  4. Ajouter le tissu haché à la solution B (rincez boîte de Pétri avec une solution pour assurer le tissu limitée est perdue) et placer dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 5 min. Agiter doucement toutes les deux minutes.
  5. Ajouter la solution D (20 ml) au tube de neutraliser la trypsine, et le tremblement centrifuge à 65 g pendant 5 min.
  6. Verser le surnageant.
  7. Remettre en suspension dans 4 ml de solution C. Triturez puits (environ 10 fois chacun) avec trois pipettes en verre flammées de diamètre décroissant, jusqu'à ce que la suspension est aussi homogène que possible.
  8. Lentement et doucement ajouter quelques gouttes de ce homogénat en haut de la BSA / EBSS. Si elle commence à couler à travers la BSA / EBSS, triturer plus et / ou ajouter un peu plus de solution C. Le broyât devrait siéger dans une couche au-dessus de la BSA / EBSS. Ne secouez pas. Tourne à 100 g pendant 5 min.
  9. Retirer le surnageant et remettre le culot (soft) dans 1 ml de milieu MEM.
  10. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque à 800 000 cellules / lamelle dans 500 pi de milieu MEM. Placer dans un incubateur à 37 ° C avec 6% de CO 2.
  11. Changer le support le lendemain (24-36 h après la préparation). Ajouter une solution de milieu MEM contenant 10 uM de l'inhibiteur de cycle cellulaire arabinofuranosyl cytidine (AraC).
    1. Pour chaquelamelle, conserver 250 pi de l'ancien milieu dans une plaque bien fraîche 24, aspirer le reste, ajouter 250 pi de milieu MEM normale et aspirer cette solution pour laver les cellules, puis ajouter les 250 pi de vieux médium vers les cellules et l'appoint avec 250 ul de milieu contenant de l'AraC.
      Remarque: Les cellules peuvent être utilisés à partir de 6 jours in vitro (DIV).

4. appauvrissant sélectivement les cellules microgliales (effectuée à 6 DIV)

  1. Ajouter LME pur à 5 ml d'une aliquote distincte de milieu MEM pour donner une concentration finale de 150 mM LME.
  2. Retourner la solution à pH 7,4 et stériliser par filtration au moyen d'un sulfone de polyéther de 28 mm (PES) de filtre seringue de 0,2 um.
  3. Diluer la solution à une concentration de 50 mM (2 x LME) dans du milieu MEM et placer dans un bain d'eau à 37 o C pendant 10 min avec du milieu MEM normale pour les cultures témoins.
  4. Retirer la moitié (250 pi), le milieu MEM à partir de cultures de la CCG et de conserver à 37 ° C.
  5. Traiter les cellulesavec du milieu MEM contenant 2 x LME (250 pi), soit dilué à 1: 1 pour obtenir une concentration de 25 mM de puits, ou avec un milieu préchauffé MEM sans LME (250 pi) pour les cultures témoins.
  6. Incuber les cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 6% de CO 2 pendant 1 heure.
  7. Laver les cellules deux fois dans un milieu frais préchauffé MEM pour supprimer les médias LME contenant, puis remplacer le milieu de culture conservé et un volume égal de milieu frais préchauffé MEM dans les puits correspondants.
  8. Cultures Retour à l'incubateur (humidifié avec 6% de CO 2 à 37 ° C) et laisser reposer pendant 24 heures avant toute nouvelle administration.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La capacité de cette technique à éliminer sélectivement la microglie à partir de cultures mixtes CCG et / ou repose sur la capacité ultérieure de l'investigateur d'identifier avec précision la microglie et différencier à partir de leurs cellules voisines. Ceci peut être réalisé en utilisant une cellule fabricant spécifique de la microglie, comme isolectine-B4, comme illustré sur la figure 1. Comme le montre la figure 2, aucun changement observable à des astrocytes et de la densi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les étapes les plus importantes pour assurer l'élimination sélective de succès de la microglie du CCG et / ou des cultures mixtes sont: 1) le maintien d'une culture de la CCG stérile et en bonne santé; 2) le filtre de stérilisation contenant un milieu LME et renvoyer la solution à pH 7,4; 3) en gardant les médias CCG non répartis et LME contenant les médias à 37 ° C pour éviter un choc thermique; et 4) travaillant rapidement pour réduire le temps cellules sont maintenues à l'extérieur de l'i...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par une bourse de doctorat d’Aims2Cure, Royaume-Uni, et une bourse de doctorat UCL Impact Award à JMP et une bourse de doctorat en renforcement des capacités du MRC en démence à JMP.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Forceps  ;Sigma-AldrichF4142L’extrémité incurvée facilite l’ablation du cervelet
Ciseaux de micro-dissectionSigma-AldrichS3146La pointe droite et acérée facilite la dissection des rongeurs P4-7.
Chlorhydrate d’ester méthylique de L-leucineSigma-Aldrich7517-19-3
solution EBSS  ;Sigma-AldrichE7510-500 ml
Poly-D-lysineSigma-Aldrich27964-99-4Couvre-couche 1 jour avant l’utilisation
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA9418
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichP4417
DNaseSigma-AldrichD5025
Inhibiteur de la trypsine de soja  ;Sigma-AldrichT6414
Anticorps anti-ED1 de la souris  ;Abcamab31630

Références

  1. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
  2. Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
  3. Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
  4. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  5. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  6. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
  7. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  8. Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
  9. Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
  10. Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
  11. Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
  12. Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
  13. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
  15. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116(2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

puisement de la microglieCulture de cellules granuleuses du cerveletCulture primaire de rongeurMicroscopie fluorescence immunochimiqueComptage cellulaire au h mocytom treProtocole de digestion tissulairetapes de lavage par centrifugationMod les de maladies neurod g n rativesQuantification de l apoptose
Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.