Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

Résumé

La microglie peut influencer les neurones et autres glies en culture par divers mécanismes autonomes non cellulaires. Ici, nous présentons un protocole pour appauvrir sélectivement la microglie à partir de cultures neuronales primaires. Cette méthode a le potentiel d’élucider le rôle des interactions microgliales-neuronales, avec des implications pour les maladies neurodégénératives où la neuroinflammation est une caractéristique caractéristique.

Résumé

Les microglies, les cellules immunocompétentes résidentes du SNC, jouent des rôles multidimensionnels dans la modulation et le contrôle de la fonction neuronale, ainsi que dans la médiation de l’immunité innée. Les modèles de culture cellulaire primaire de rongeurs ont considérablement fait progresser notre compréhension des interactions neuronales-gliales, mais ce n’est que récemment que des méthodes permettant d’éliminer spécifiquement la microglie des cultures mixtes ont été utilisées. L’une de ces techniques – décrite ici – est l’utilisation de l’ester méthylique de L-leucine, un agent lysomotrope qui est internalisé par les macrophages et la microglie, dans lequel il provoque une perturbation lysosomale et une apoptose ultérieure^13,14. Les expériences utilisant l’ester méthylique de L-leucine ont le pouvoir d’identifier la contribution de la microglie à l’environnement cellulaire environnant dans diverses conditions de culture. À l’aide d’un protocole optimisé dans notre laboratoire, nous décrivons comment éliminer la microglie de la culture cellulaire de granules cérébelleux de rongeurs P5. Cette approche permet d’évaluer l’impact relatif de la microglie sur les données expérimentales, ainsi que de déterminer si les microglies jouent un rôle neuroprotecteur ou neurotoxique dans des modèles de culture de maladies neurologiques, telles que les accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson.

Introduction

Le cerveau humain comprend environ 85 milliards de neurones et un autre de 85 milliards de cellules non-neuronales, y compris les cellules gliales ^1. Pour la plus grande partie des 100 dernières années, les neuroscientifiques ont porté principalement sur la population de cellules neuronales, croyant cellules gliales d'être un peu plus de cellules de soutien passives qui ont fourni un soutien structurel pour les neurones - d'où l'étymologie grecque de «cellules gliales» traduit en anglais «colle». Récemment, cependant, il est devenu de plus en plus évident que les interactions neuronales-gliales peuvent être beaucoup plus fondamentale pour les a....

Protocole

Toutes les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec le Royaume-Uni Animaux (Scientific Procedures) la loi de 1986.

1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats

1. Préparer deux ciseaux laboratoire en acier inoxydable de dissection et deux pinces de laboratoire en acier inoxydable. Autoclave tous les instruments et les placer dans une culture hotte O / N sous la lumière ultraviolette (UV) pour la stérilisation.
2. Ajouter 500 ml de (MEM) du milieu de culture de médias essentiel minimum (10% Foetal Bovine Serum [FBS], 20 mM de KCl, 25 mM de NaHCO _3, 30 mM de D-glucose, 2 mM de L-glu....

Résultats

La capacité de cette technique à éliminer sélectivement la microglie à partir de cultures mixtes CCG et / ou repose sur la capacité ultérieure de l'investigateur d'identifier avec précision la microglie et différencier à partir de leurs cellules voisines. Ceci peut être réalisé en utilisant une cellule fabricant spécifique de la microglie, comme isolectine-B4, comme illustré sur la figure 1. Comme le montre la figure 2, aucun changement observable à des astrocytes et de la densi.......

Discussion

Les étapes les plus importantes pour assurer l'élimination sélective de succès de la microglie du CCG et / ou des cultures mixtes sont: 1) le maintien d'une culture de la CCG stérile et en bonne santé; 2) le filtre de stérilisation contenant un milieu LME et renvoyer la solution à pH 7,4; 3) en gardant les médias CCG non répartis et LME contenant les médias à 37 ° C pour éviter un choc thermique; et 4) travaillant rapidement pour réduire le temps cellules sont maintenues à l'extérieur de l'i.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Forceps  ;	Sigma-Aldrich	F4142	L’extrémité incurvée facilite l’ablation du cervelet
Ciseaux de micro-dissection	Sigma-Aldrich	S3146	La pointe droite et acérée facilite la dissection des rongeurs P4-7.
Chlorhydrate d’ester méthylique de L-leucine	Sigma-Aldrich	7517-19-3
solution EBSS  ;	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Couvre-couche 1 jour avant l’utilisation
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Inhibiteur de la trypsine de soja  ;	Sigma-Aldrich	T6414
Anticorps anti-ED1 de la souris  ;	Abcam	ab31630