Kupffer cellule d'isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

Résumé

Les macrophages hépatiques, appelés cellules de Kupffer, sont responsables de la capture des nanoparticules circulantes. Nous décrivons ici une méthode, d’une pureté cellulaire et d’un rendement élevés, pour l’isolement des cellules de Kupffer. Le test LDH modifié est utilisé ici pour mesurer la toxicité induite par les nanotubes de carbone dans les cellules de Kupffer.

Résumé

La grande majorité des études in vitro de nanotoxicological ont utilisé des lignées cellulaires immortalisées pour leur praticité. Cependant, les résultats des tests de toxicité des nanoparticules dans des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires ont montré des anomalies, en soulignant la nécessité d'étendre l'utilisation de cellules primaires pour les essais in vitro. Ce protocole décrit l'isolement de macrophages hépatiques de souris, les cellules de Kupffer Nom de famille, ainsi que leur utilisation pour étudier la toxicité des nanoparticules. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et constituent une partie du système réticulo-endothélial (RES), responsable de la capture des nanoparticules de circulation. La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. La méthode, basée sur la digestion de collagénase et une centrifugation de densité, est une adaptation du protocole d'origine développé par Smedsrød et al. conçu pour les cellules du foie de rat isolation et fournit un rendement élevé (jusqu'à 14 x 10 ⁶ cellules par souris) et de haute pureté (> 95%) des cellules de Kupffer. Cette méthode d'isolement ne nécessite pas d'équipements sophistiqués et coûteux ou représente donc un compromis idéal entre la complexité et le rendement de la cellule. L'utilisation de souris plus lourds (35 à 45 g) permet d'améliorer le rendement du procédé d'isolation, mais aussi facilite remarquablement le mode opératoire de canulation de la veine porte. La toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés f -CNTs a été mesuré dans ce modèle par le dosage de la LDH modifié. Cette méthode évalue la viabilité des cellules en mesurant le manque d'intégrité structurelle de la membrane des cellules de Kupffer après incubation avec -CNTs f. Toxicité induite par -CNTs f peut être mesurée en utilisant systématiquement ce test, soulignant que les cellules de Kupffer isolées sont utiles pour les tests de toxicité des nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace.

Introduction

Le domaine de la recherche de la nanotoxicologie vise à caractériser l'effet biologique des nanoparticules. Les études toxicologiques basées sur des investigations in vivo restent les méthodes les plus précises. Toutefois, leur utilisation est limitée par leur coût, travail et temps exigences ^1. Comme essais alternatives, in vitro ont été utilisées en raison de leur simplicité et de la possibilité de développer à haut débit dans les plateformes de test in vitro ² - étendant ainsi le nombre de conditions testées. La plupart des études sont effectuées en utilisant nanotoxicological dans des essais in vitro sur des lignées de cellules immortalisées. Cependant, il ya des préoccupations concernant l'extrapolation de ces résultats expérimentaux à des effets toxicologiques in vivo ^3. En effet, les propriétés des lignées cellulaires immortalisées peuvent être significativement différents de tissus ils ont été dérivés à partir, par exemple, la transformation génétique ^4, la détérioration des caractéristiques morphologiques clés5, la perte de la polarité cellulaire ⁶ et altérations fonctionnelles telles que la réglementation des médiateurs inflammatoires ^7.

Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et sont directement en contact avec le sang en alignant la paroi de sinusoïdes hépatiques. Dans le cadre du système réticulo-endothélial (RES), les macrophages sont responsables de la capture des nanoparticules de circulation et, par conséquent, constituent un modèle très approprié pour étudier la toxicité des nanoparticules. In vivo ⁸ et in vitro ⁹ études de réponses inflammatoires associées à des cellules de Kupffer exposés à des nanoparticules ont été publiés ailleurs. Les cellules de Kupffer ont également été impliqués dans la pathogenèse des maladies du foie telles que la maladie alcoolique du foie ^10, la fibrose hépatique ou hépatite virale ^{11 12.} Il a été rapporté que les cellules de Kupffer isolés donnent un aperçu utile de décrire les mécanismes cellulaires involved dans la perturbation du foie ^13,14.

Plusieurs procédés ont été rapportés pour isoler et purifier des cellules de Kupffer. l'isolement cellulaire peut causer de la dissociation mécanique ou enzymatique ^15. Digestion collagénase montre l'intérêt de la conservation de l'intégrité fonctionnelle des cellules de Kupffer, tout en conduisant à haute Kupffer rendement de la cellule ^16. De nombreuses approches expérimentales différentes, la complexité et les coûts, ont été utilisées pour séparer les cellules de Kupffer les autres populations de cellules du foie. Par exemple, des cellules de Kupffer pureté peut être obtenue par immunoaffinite ^17, le flux ¹⁸ électrophorèse, l'adhérence sélective ¹⁶ ou par des techniques d'épandage ^16, qui sélectionnent les cellules selon leur taille et leur densité. Une combinaison de ces méthodes peut être choisie pour augmenter la pureté de la population ^16. Il n'y a pas de consensus sur la méthode idéale pour l'isolation des cellules de Kupffer, car elle dépend principalement sur les applications disponibles et équipemt. Toutefois, dans le cas des essais de toxicité de nanoparticules, la simplicité et un rendement élevé de la technique associée à la conservation fonctionnelle des cellules de Kupffer ont semblé être plus approprié pour cette application.

La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. Le procédé a été modifié par rapport au protocole initial développé par Smedsrød et al. ¹⁶ conçus pour l'isolement des cellules de foie de rat. La plupart des études ont rapporté et décrit l'isolement de cellules de Kupffer du foie de rat. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules de Kupffer du foie de la souris, avec un rendement élevé et de pureté. L'utilisation de souris réduit le coût de l'expérimentation et permet le traitement de plusieurs foies d'obtenir de grandes quantités de cellules de Kupffer pour les tests de toxicité des nanoparticules.

Dans le protocole suivant, les cellules de Kupffer ont été incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés (f -CNTs). Les propriétés physico-chimiques uniques de NTC - c.-à-haute rapport de longueur à diamètre et grande surface, ont fait NTC candidats intéressants comme vecteurs pour des fins de thérapie et de diagnostic. Toutefois, des préoccupations ont été soulevées concernant la toxicité des nanotubes de carbone ^19, et le développement de nouveaux tests in vitro vise à accroître la compréhension des effets biologiques CNT. Toxicité chez les cellules de Kupffer est associé à un manque d'intégrité structurelle de la membrane cellulaire. Elle est mesurée par la perte de l'enzyme LDH cytoplasmique de la cellule dans le surnageant. Le principe de cette méthode est donc de supprimer tout LDH libérée et de mesurer ce qui reste dans les cellules ^20. Ceci est réalisé de préférence à la mesure de la LDH libérée dans le surnageant parce que la présence de nanotubes de carbone dans le surnageant interfère avec l'essai ^21.

Nous vous proposons l'utilisation de ce métho d'isolement des cellules de Kupffer efficace simple et économiqued pour isoler nombre élevé de cellules fonctionnelles Kupffer. Ceci permet le criblage de la toxicité d'une gamme de nanoparticules, dans un modèle de macrophage primaire pertinente.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole en démonstration a été réalisée sous la direction et l'approbation de la réglementation de bureau au Royaume-Uni Accueil

1. Perfusion et Cell Collection (Figure 1)

Figure 1:. Foie Perfusion Après l'anesthésie de la souris, le tube digestif est déplacé latéralement vers la gauche de l'abdomen afin de rendre la veine porte (PV) accessible. Le PV est pourvue d'une canule en utilisant une faible vitesse d'écoulement (3.1 ml / min) de la solution d'EGTA / HBSS et la Veina cave inférieure (VCI) est rompue immédiatement pour éviter toute surpression à l'intérieur du foie. Au sein de la première minute de la perfusion, le débit est progressivement augmentée à 7 ml / min. La solution la collagénase est ensuite perfusé à 10 ml / min jusqu'à ce que sa digestion complète est obtenue.

1. Prepare fraîchement tous les réactifs décrits dans la table des matières.
2. Réchauffez la EGTA (Ethylene Glycol Tetra-acétique) / HBSS (solution saline équilibrée de Hank) Solution (50 ml par souris) et la solution la collagénase (100 ml par souris) pendant 30 min à 40 ° C.
3. Rincer le tube flexible de la pompe d'abord avec 70% d'éthanol. Verser 40 ml d'EGTA / HBSS Solution dans un tube de centrifugeuse immergé dans le bain d'eau et rincer le tube flexible de la pompe avec / HBSS Solution EGTA préchauffé.
4. Effectuer anesthésie terminale en utilisant un barbiturique à produire de manière fiable l'inconscience avant la dépression respiratoire et la mort. Injecter phénobarbital à 1 mg / kg, ip dans une souris CD1 femelle ou mâle (35-45 g). Confirmez l'anesthésie par pincement orteil.
5. Raser les poils abdominaux et stériliser la surface abdominale en utilisant une solution d'éthanol à 70%.
6. Couper à travers la cavité abdominale et exposer la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant latéralement l'intestin à la gauche de l'abdomen.
7. Étoilet la pompe à une vitesse de 1-3 ml / min avec la solution EGTA / HBSS et cathétériser la veine porte en utilisant une aiguille 23 g de papillon (ailes coupées). Fixer la section de la veine porte canule avec l'aiguille de 23 G et puis retournez les forceps serrefine à la surface de l'abdomen de la souris ouvert. Le foie devrait rapidement pâle dans le 30 premières secondes de la perfusion EGTA / HBSS Solution.
8. Inciser rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter la construction de surpression dans le foie, et ensuite augmenter le débit progressivement à 7 ml / min, au cours de la première minute de la perfusion. L'animal meurt en raison de saignements secondaire à la veine cave ponction veineuse.
9. Lorsque moins de 5 ml de EGTA / HBSS Solution restante dans le tube de la centrifugeuse, le remplir avec Solution collagénase (40-50 ml). Augmenter le débit progressivement à 10 ml / min, 30 sec.
10. Faire la houle du foie en appliquant une pression à la veine cave inférieure, en utilisant des pinces, pour les 5-10 secondes d'intervalle. This peut être fait périodiquement (5-10 fois au cours de la digestion). Cette étape permettra d'améliorer la dissociation des cellules du foie et de réduire le temps de perfusion de collagénase.
11. Lorsque moins de 10 ml de solution de collagénase reste dans le tube de centrifugation, verser 40 à 50 ml de solution de collagénase préchauffé dans le tube de centrifugeuse.
12. Après 10-15 minutes de la perfusion et environ 70-80 ml de collagénase Solution perfusés, appliquer une petite pression sur la surface du foie avec une pince. Une copie de la pression indique que les cellules du foie sont dissociés.
13. Retirer le foie de la cavité abdominale d'une seule pièce et le placer dans un tube de centrifugeuse contenant 20 à 30 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Gardez les cellules du foie sur la glace ou à 4 ° C pendant une période maximale de 3 heures pour éviter d'affecter la viabilité des cellules du foie.
14. Répétez la procédure de perfusion sur plusieurs animaux en cas de besoin, tout en gardant le foie perfusé sur la glace. Piscine de une à trois foies pour la purification et de procéder à l'étape 3.

2. Préparation du gradient de densité de centrifugation (figure 2)

Figure 2:. Préparation du gradient de densité Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. Le protocole SIP est préparée en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice revêtu avec 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP sont mélangés avec 15 ml de PBS pour faire SIP solution 20 ml de 25%. 10 ml de SIP sont mélangés avec 10 ml de PBS pour faire une solution de 20 ml de SIP à 50%. Un tube de centrifugation contenant la solution à 50% de SIP (20 ml) est inclinée et la solution SIP à 25% (20 ml) est lentement ajouté en utilisant une pipette sérologique de 25 ml.

1. Suivez les étapes suivantes (section 2., 3. et 5.) dans des conditions stériles et garder les cellules sur la glace ou à 4 ° C. Préparer le SIP (solution de particules de silice revêtues isotonique) en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice enrobée avec 1,7 ml de 10 x PBS.
Pour faire 20 ml de solution SIP 25%, mélanger 5 ml de SIP avec 15 ml de PBS. Pour 20 ml de solution de SIP à 50%, mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de PBS.
2. Remplir un tube à centrifuger de 20 ml de la solution de SIP à 50%. Incliner le tube de centrifugeuse à un angle proche de 90 ° et ajouter lentement la solution de SIP à 25% (20 ml) sur la paroi latérale du tube en utilisant une 25 ml pipette sérologique, sans toucher la surface de la couche de protocole SIP à 50%. Lors de l'ajout de la solution SIP de 25%, réduire progressivement l'angle du tube. Gardez le gradient de densité sur la glace jusqu'à utilisation.

3. cellules de Kupffer Purification (Figure 3)

Figure 3:. Purification des cellules de Kupffer par gradient de densité centrifugation et l'adhésion cellulaire Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. (A) Après rupture de la capsule de Glisson la, les cellules du foie sont filtrés à travers un 100 um crépine. La suspension est centrifugée à 50 x g à jeter hépatocytes (pellets) et recueillir la fraction de cellules non parenchymateuses (surnageant). Cette étape est répétée trois fois. Les cellules non-parenchymales sont ajoutés au-dessus d'un gradient discontinu isotonique et centrifugées à 800 xg pendant 15 min. Les cellules de Kupffer recueillies à partir du SIP coussin de 25% sont purifiés en outre par la sélection de l'adhésion cellulaire. (B) Les cellules sont étalées dans une plaque à 24 puits et incubées à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 30 minutes. Les cellules non adhérentes sont lavées une fois avec 500 ul de HBSS. Les cellules de Kupffer afficher leur adhérente morphologie 4 heures après l'étalement, lorsque -CNTs f peuvent être ajoutés aux cellules. La barre d'échelle représente 25 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Mettez un foie perfusé dans une boîte de Petri avec 15 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. La rupture de la capsule de Glisson la (membrane du foie) en utilisant des ciseaux et libérer toutes les cellules du foie dans le milieu d'isolement des cellules de Kupffer. Filtrer la solution à une cellule si tamis 100 um pour être recueilli dans un tube de centrifugation. Répétez la procédure de perfusion sur foies perfusés supplémentaires et mettre en commun les cellules dans le même tube de centrifugeuse (15 ml à partir d'une souris, jusqu'à 45 ml de trois souris).
2. Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 2 min à 4 ° C. Les cellules parenchymateuses (hépatocytes) seront dans le culot et les cellules non-parenchymales (y compris les cellules de Kupffer) seront dans le surnageant.
3. Récupérer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et centrifuger à 50 x g pendant 2 min chacun. Répétez cette étape trois fois de plus.
4. Centrifuger à 1350 xg pendant 15 min pour sédimenter les cellules non parenchymateuses. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne.
5. Ajouter la solution de cellules non parenchymateuses du gradient isotonique discontinue 25/50% comme décrit dans 2.3. Centrifuge à 850 g pendant 15 min sans accélération ni pause.
6. Localiser la fraction des cellules de Kupffer enrichi trouble apparaissant à l'intérieur de la fraction SIP à 25% près de l'interface SIP 25/50% de (Figure 3). En utilisant une pipette 10 ml sérologique, aspirer environ 12 ml de la fraction enrichie en cellules de Kupffer. Transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse contenant 35-40 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Mélanger doucement et centrifuger à 1350 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules.
7. Jeter les cellules surnageant et remettre en 5-10 ml de pré-chauffé cellules Kupffer milieu de culture. Compter les cellules (Hémocytomètre) et de mesurer la viabilité en utilisant une coloration au bleu trypan.
8. Plaque les cellules parenchymateuses non purifiés dans des plaques à 24 puits à une densité de 5 x 10 ⁵ cellules / puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO ₂ (Figure 3). Après 30 min, retirez délicatement le milieu, laver avec préchauffé solution saline équilibrée de Hank (HBSS) une fois puis remplacezavec 500 pi de frais et préchauffé cellules Kupffer milieu de culture (par puits).
9. Donner des cellules de Kupffer pendant au moins 4 heures à 37 ° C et 5% de CO ₂ avant le traitement avec des nanoparticules, à leur permettre d'acquérir leur morphologie adhérente.

4. Caractérisation

1. Kupffer cellules Pureté
   1. Préparer une solution fraîche PBS / BSA utilisé pour maintenir la viabilité des cellules de Kupffer. Laver les cellules une fois avec 500 ul de solution PBS / BSA. Retirer la solution de PBS / BSA et détacher les cellules de Kupffer dans 500 pi de solution fraîche PBS / BSA en utilisant grattant délicatement. Lorsque les cellules sont étalées dans des plaques à 24 puits, de raccourcir les extrémités des lames de raclage avec des ciseaux pour faire le détachement facile de procéder. Transfert cellules dans des tubes de cytométrie en flux.
   2. Compter les cellules de Kupffer utilisant un hémocytomètre et centrifuger 1 x 10 ⁵ cellules à 1350 x g. Remettre en suspension les cellules de Kupffer dans 30 ul de F4 / 80 anticorps (sans solvant). Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Gardez les cellules non colorées (non incubées avec l'anticorps) sur de la glace.
   3. Ajouter 2 ml de solution de PBS / BSA dans les cellules colorées, centrifuger à 1350 g pendant 5 minutes et jeter le surnageant résultant. Remettre en suspension les cellules colorées dans 200 ul de PBS / BSA.
   4. Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l'avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-1 canal.
   5. Répétez la procédure pour les cellules de Kupffer colorées en gardant les mêmes paramètres utilisés pour la cytométrie de flux des cellules de Kupffer non colorées. Sélectionner et quantifier la fluorescence des cellules colorées pour évaluer la pureté des cellules de Kupffer.
2. Kupffer cellules phagocytaires activité
   1. Remplacez le support avec 0,5% (v / v) des billes fluorescentes dans Kupffer milieu de culture cellulaire et incuber pendant 4 heures à 37 ° C et 5% de CO _2.
   2. Afin d'éliminer les billes non intériorisées, les cellules de Kupffer de centrifugeuses à 1350 xg, diSCard les cellules surnageant et remettre en suspension dans 500 pi de PBS / BSA Solution. Répétez cette étape deux fois plus.
   3. Grattez les cellules de Kupffer dans 500 pi de cellules de solutions et de transfert PBS / BSA dans un tube de cytométrie en flux.
   4. Centrifugeuse cellules Kupffer à 1350 xg, jeter les cellules surnageant et remettre dans 200 pi de PBS / BSA Solution.
   5. Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l'avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-2 canaux.

5. Incubation chimiquement fonctionnalisés nanotubes de carbone (f -CNTs)

1. Préparer une dispersion de -CNTs f (1 mg / ml) dans de l'eau par traitement aux ultrasons pendant 15 minutes avant utilisation. -CNTs F sont préparés en interne ^22.
2. Préparer 2x NTC f- concentrés dispersion dans Kupffer milieu de culture cellulaire. NTC f- Soniquer dispersées dans le milieu pour2 min avant de passer à l'étape 5.3).
3. Pour chaque puits, 250 pi de remplacer les anciens médias avec 250 ul de 2x -CNTs f dispersion. Puits non traités (250 pi de milieu conditionné + 250 pl de cellules fraîches Kupffer milieu de culture) et des puits traités avec 10% de DMSO sont utilisées comme contrôle négatif et positif, respectivement.
4. Incuber les cellules de Kupffer à 37 ° C et 5% de _CO2 pendant 24 ou 72 heures.

6. Évaluation de la toxicité des -CNTs f dans les cellules de Kupffer par la lactate déshydrogénase (LDH) Dosage modification

1. Jeter le surnageant.
2. Ajouter 200 pi (par puits de plaque de 24 puits) de tampon de lyse et incuber à 37 ° C pendant 30 min-1 heure.
3. Après avoir procédé à un pipetage vigoureux, collecter lysé les cellules de Kupffer dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 40 000 xg pendant 10 min pour former un culot -CNTs f qui ont été prises par les cellules et les débris cellulaires.
4. Recueillir les surnageants (gratuit ƒ-CNT) dansmicrotubes et conserver à -20 ° C ou passez à l'étape 6.5).
5. Transférer 50 ul dans une plaque de 96 puits et ajouter un volume égal de la solution substrat de mélange (kit LDH) à chaque puits. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 min avant d'ajouter 50 ul de la solution d'arrêt (kit LDH). Ajouter triple de puits à blanc contenant 50 ul de tampon de lyse, 50 pi de solution substrat de mélange et 50 ul de solution d'arrêt.
6. Lire l'absorbance à 490 nm dans un lecteur de microplaques et utiliser la formule suivante pour calculer la (%) viabilité cellulaire.

Résultats

Le nombre de cellules parenchymateuses non purifiées était conforme et a varié entre 8 et 14 x 10 ⁶ cellules par souris (17 isolements ont été réalisées). Chaque isolement de la souris était suffisante à la plaque 16 à 28 puits. La viabilité des cellules par coloration au bleu trypan a montré la viabilité des cellules ~ 95%. Les cellules de Kupffer ont montré une forme ronde dans les 30 minutes d'incubation à 37 ° C, liée à leur morphologie adhérente incomplètes (figure 4A). À 4 h d'incubatio...

Discussion

Les étapes suivantes sont essentielles pour atteindre un rendement élevé et une haute viabilité des cellules de Kupffer. Des conditions d'asepsie doivent être utilisés pour limiter le risque de contamination bactérienne et fongique. Tous les instruments doivent être stérilisés avant utilisation. Les réactifs doivent être fraîchement préparées avant d'effectuer la procédure d'isolement.

Le choix de la collagénase IV, avec une faible activité tryptique, est crucial. Différents lots...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Euthatal (pentobarbital sodique)	Merial
CD1 souris	Charles River  ;   ;	-	Le poids de la souris doit varier de 35 à 45 g. Nous conseillons l’utilisation de souris CD1 mâles car leur poids augmente rapidement ( par exemple une souris CD1 mâle de 7 semaines dépasse 35 g de poids). Il est également conseillé de contacter le fournisseur d’animaux à l’avance pour organiser la livraison des animaux plus âgés. Alternativement, les animaux peuvent être à l’intérieur de la maison pour atteindre le poids souhaité.
HBSS (sans <>2 /supet Mg2+ sup, avec bicarbonate)  ;   ;	Technologies de la vie  ;   ;	14175-053	HBSS doit être  ; Ca2+ gratuit.  ;
Sel tétrasodique de l’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA)	Sigma-Aldrich  ;   ;	E8145  ;   ;	L’EDTA peut également être utilisé, mais l’EGTA a l’avantage de chélater le Ca2+ supsélective.
HEPES (1 M)  ;	Technologies de la vie  ;   ;	15630-056  ;	100 ml  ;
Collagénase de type IV  ;	Worthington  ;	CSL-4  ;	Il est conseillé de tester différents lots de collagénase ou au moins de mentionner au fournisseur que le produit doit être adapté à l’isolement des cellules hépatiques.
; Faible teneur en glucose DMEM  ;	Sigma-Aldrich  ;   ;	D5523  ;	500 ml  ;
RPMI (avec pyruvate de sodium et Glutamax)  ;	Technologies de la vie  ;   ;	12633-012  ;	500 ml
Pénicilline/Steptomycine  ;	Technologies de la vie  ;   ;	15140-122	100 ml
Sérum fœtal de bovin  ;	Premier-Lien  ;   ;	60-00-850  ;	500 ml  ;
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich  ;	T8154  ;	100 ml  ;
Solution de particules de silice enrobée (Percoll)	GE Healtcare  ;   ;	17-0891-02  ;	Percoll® ; est très stable et peut être conservé plusieurs années.
1x solution saline tamponnée au phosphate  ;   ;	Technologies de la vie  ;   ;	10010-023	500 ml  ;
10x solution saline tamponnée au phosphate  ;   ;	Technologies de la vie  ;   ;	70011-036	500 ml
de sulfoxyde de diméthyle  ;	Fisher  ;	D/4120/PB08  ;	500 ml  ;
Kit LDH (CytoTox 96)  ;	Promega  ;	G1781  ;	Conserver à l’abri de la lumière  ;
DMEM phénol rouge sans Life	Technologies  ;   ;	31053-028  ;	500 ml  ;
Anticorps F4/80 (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Ne pas diluer, utilisé pur pour la cytométrie en flux
Perles fluorescentes	Sigma	L2778	Perles de latex, polystyrène modifié aux amines, rouge fluorescent. 1 ml
Nom du matériau	Entreprise  ;	Numéro de catalogue  ;	Commentaires/Description  ;
Kit de prélèvement de sang de papillon (tube de 23 G/305 mm de long)   ;	BD  ;
filtres à seringue (0,22 &mu ; m Blue Rim)  ;	Minisart  ;	16534-K  ;
Tubes à centrifuger (50 ml Blue Cap)  ;	BD Biosciences, Falcon	35 2070  ;
Boîte de Pétri (90 x 15 mm)  ;	Thermo Fisher Scientific  ;   ;	BSN 101VR20  ;
100 &mu ; crépine à cellules M  ;   ;	BD  ;   ;	352360
Pompe péristaltique  ;	Watson Marlow  ;	SciQ 300°   ;	Rincez la tubulure avant et après chaque utilisation avec du PBS stérile et de l’éthanol à 70 %.
Plaques à 24 puits	Corning  ;   ;	3526
Plaques à 96 puits  ;	Corning  ;   ;	3595
Centrifugeuse  ;	Eppendorf	5810R
Lecteur de plaques	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine forceps	Hammacher GmbH  ;	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	La pince serrefine permet de clamper le vaisseau canulé avec l’aiguille 23 G sans qu’il soit nécessaire de tenir la pince pendant la procédure de perfusion. Lien : (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)  ;
Tubes de cytométrie en flux	BD Biosciences, Falcon  ;
Tubes de microcentrifugation (1,5 ml)	Elkay	; 000-MICR-150
Racleur de cellules	BD Biosciences, Falcon	353086	Coupez les extrémités des lames avec une paire de ciseaux pour gratter les cellules dans des plaques de 24 puits.
Nom de la société de réactifs	;	Numéro de catalogue  ;	Commentaires/Description  ;
; Solution EGTA (acide tétraacétique d’éthylène glycol)/HBSS (solution saline équilibrée de Hank)  ;			HBSS contenant 0,5 mM d’EGTA et 25 mM d’HEPES. Ajustez le pH à 7,4. Préparez 50 ml pour chaque foie à perfuser.   ;
Solution de collagénase  ;			DMEM à faible teneur en glucose contenant de la collagénase de type IV à 100 UI/ml, 15 mM HEPES et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Ajustez le pH à 7,4. Préparez 100 ml pour chaque foie à perfuser. Après avoir ajouté la collagénase, il est conseillé de réchauffer la solution pendant 30 min avant utilisation. Cela permet à l’activité de la collagénase d’être optimale.
Milieu d’isolement cellulaire de Kupffer  ;			RPMI contenant, 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax® ; (v/v) et 1 % de péniclline/streptomycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies.   ;
Milieu de culture cellulaire Kupffer  ;			RPMI contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax® ; (v/v) et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies.   ;
SIP (solution de particules de silice enrobées isotoniques)			Mélanger 1,7 ml de solution saline tamponnée 10x phosphate avec 15,3 ml de Percoll® ; pour obtenir 17 ml de SIP.
Solution SIP à 25 %s  ;			Mélanger 5 ml de SIP avec 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate.   ;
Solution 50 % SIP  ;			Mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate
Tampon de lyse Média			DMEM avec 0,9 %
		PBS/BSA	Préparez une solution saline fraîche tamponnée au phosphate pH 7,4 avec 1 % d’albumine sérique bovine.