Kupffer cellule d'isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

Résumé

Les macrophages hépatiques, appelés cellules de Kupffer, sont responsables de la capture des nanoparticules circulantes. Nous décrivons ici une méthode, d’une pureté cellulaire et d’un rendement élevés, pour l’isolement des cellules de Kupffer. Le test LDH modifié est utilisé ici pour mesurer la toxicité induite par les nanotubes de carbone dans les cellules de Kupffer.

Résumé

La grande majorité des études in vitro de nanotoxicological ont utilisé des lignées cellulaires immortalisées pour leur praticité. Cependant, les résultats des tests de toxicité des nanoparticules dans des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires ont montré des anomalies, en soulignant la nécessité d'étendre l'utilisation de cellules primaires pour les essais in vitro. Ce protocole décrit l'isolement de macrophages hépatiques de souris, les cellules de Kupffer Nom de famille, ainsi que leur utilisation pour étudier la toxicité des nanoparticules. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et constituent une partie du système réticulo-endothélial (RES), responsable de la capture des nanoparticules de circulation. La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. La méthode, basée sur la digestion de collagénase et une centrifugation de densité, est une adaptation du protocole d'origine développé par Smedsrød et al. conçu pour les cellules du foie de rat isolation et fournit un rendement élevé (jusqu'à 14 x 10 ⁶ cellules par souris) et de haute pureté (> 95%) des cellules de Kupffer. Cette méthode d'isolement ne nécessite pas d'équipements sophistiqués et coûteux ou représente donc un compromis idéal entre la complexité et le rendement de la cellule. L'utilisation de souris plus lourds (35 à 45 g) permet d'améliorer le rendement du procédé d'isolation, mais aussi facilite remarquablement le mode opératoire de canulation de la veine porte. La toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés f -CNTs a été mesuré dans ce modèle par le dosage de la LDH modifié. Cette méthode évalue la viabilité des cellules en mesurant le manque d'intégrité structurelle de la membrane des cellules de Kupffer après incubation avec -CNTs f. Toxicité induite par -CNTs f peut être mesurée en utilisant systématiquement ce test, soulignant que les cellules de Kupffer isolées sont utiles pour les tests de toxicité des nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace.

Introduction

Le domaine de la recherche de la nanotoxicologie vise à caractériser l'effet biologique des nanoparticules. Les études toxicologiques basées sur des investigations in vivo restent les méthodes les plus précises. Toutefois, leur utilisation est limitée par leur coût, travail et temps exigences ^1. Comme essais alternatives, in vitro ont été utilisées en raison de leur simplicité et de la possibilité de développer à haut débit dans les plateformes de test in vitro ² - étendant ainsi le nombre de conditions testées. La plupart des études sont effectuées en utilisant nanotoxicological dans des essais <....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole en démonstration a été réalisée sous la direction et l'approbation de la réglementation de bureau au Royaume-Uni Accueil

1. Perfusion et Cell Collection (Figure 1)

Figure 1:. Foie Perfusion Après l'anesthésie de la souris, le tube digestif est déplacé latéralement vers la gauche de l'abdomen afin de rendre la veine porte (PV) accessib....

Résultats

Le nombre de cellules parenchymateuses non purifiées était conforme et a varié entre 8 et 14 x 10 ⁶ cellules par souris (17 isolements ont été réalisées). Chaque isolement de la souris était suffisante à la plaque 16 à 28 puits. La viabilité des cellules par coloration au bleu trypan a montré la viabilité des cellules ~ 95%. Les cellules de Kupffer ont montré une forme ronde dans les 30 minutes d'incubation à 37 ° C, liée à leur morphologie adhérente incomplètes (figure 4A). À 4 h d'incubatio.......

Discussion

Les étapes suivantes sont essentielles pour atteindre un rendement élevé et une haute viabilité des cellules de Kupffer. Des conditions d'asepsie doivent être utilisés pour limiter le risque de contamination bactérienne et fongique. Tous les instruments doivent être stérilisés avant utilisation. Les réactifs doivent être fraîchement préparées avant d'effectuer la procédure d'isolement.

Le choix de la collagénase IV, avec une faible activité tryptique, est crucial. Différents lots.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Euthatal (pentobarbital sodique)	Merial
CD1 souris	Charles River  ;   ;	-	Le poids de la souris doit varier de 35 à 45 g. Nous conseillons l’utilisation de souris CD1 mâles car leur poids augmente rapidement ( par exemple une souris CD1 mâle de 7 semaines dépasse 35 g de poids). Il est également conseillé de contacter le fournisseur d’animaux à l’avance pour organiser la livraison des animaux plus âgés. Alternativement, les animaux peuvent être à l’intérieur de la maison pour atteindre le poids souhaité.
HBSS (sans <>2 /supet Mg2+ sup, avec bicarbonate)  ;   ;	Technologies de la vie  ;   ;	14175-053	HBSS doit être  ; Ca2+ gratuit.  ;
Sel tétrasodique de l’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA)	Sigma-Aldrich  ;   ;	E8145  ;   ;	L’EDTA peut également être utilisé, mais l’EGTA a l’avantage de chélater le Ca2+ supsélective.
HEPES (1 M)  ;	Technologies de la vie  ;   ;	15630-056  ;	100 ml  ;
Collagénase de type IV  ;	Worthington  ;	CSL-4  ;	Il est conseillé de tester différents lots de collagénase ou au moins de mentionner au fournisseur que le produit doit être adapté à l’isolement des cellules hépatiques.
; Faible teneur en glucose DMEM  ;	Sigma-Aldrich  ;   ;	D5523  ;	500 ml  ;
RPMI (avec pyruvate de sodium et Glutamax)  ;	Technologies de la vie  ;   ;	12633-012  ;	500 ml
Pénicilline/Steptomycine  ;	Technologies de la vie  ;   ;	15140-122	100 ml
Sérum fœtal de bovin  ;	Premier-Lien  ;   ;	60-00-850  ;	500 ml  ;
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich  ;	T8154  ;	100 ml  ;
Solution de particules de silice enrobée (Percoll)	GE Healtcare  ;   ;	17-0891-02  ;	Percoll® ; est très stable et peut être conservé plusieurs années.
1x solution saline tamponnée au phosphate  ;   ;	Technologies de la vie  ;   ;	10010-023	500 ml  ;
10x solution saline tamponnée au phosphate  ;   ;	Technologies de la vie  ;   ;	70011-036	500 ml
de sulfoxyde de diméthyle  ;	Fisher  ;	D/4120/PB08  ;	500 ml  ;
Kit LDH (CytoTox 96)  ;	Promega  ;	G1781  ;	Conserver à l’abri de la lumière  ;
DMEM phénol rouge sans Life	Technologies  ;   ;	31053-028  ;	500 ml  ;
Anticorps F4/80 (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Ne pas diluer, utilisé pur pour la cytométrie en flux
Perles fluorescentes	Sigma	L2778	Perles de latex, polystyrène modifié aux amines, rouge fluorescent. 1 ml
Nom du matériau	Entreprise  ;	Numéro de catalogue  ;	Commentaires/Description  ;
Kit de prélèvement de sang de papillon (tube de 23 G/305 mm de long)   ;	BD  ;
filtres à seringue (0,22 &mu ; m Blue Rim)  ;	Minisart  ;	16534-K  ;
Tubes à centrifuger (50 ml Blue Cap)  ;	BD Biosciences, Falcon	35 2070  ;
Boîte de Pétri (90 x 15 mm)  ;	Thermo Fisher Scientific  ;   ;	BSN 101VR20  ;
100 &mu ; crépine à cellules M  ;   ;	BD  ;   ;	352360
Pompe péristaltique  ;	Watson Marlow  ;	SciQ 300°   ;	Rincez la tubulure avant et après chaque utilisation avec du PBS stérile et de l’éthanol à 70 %.
Plaques à 24 puits	Corning  ;   ;	3526
Plaques à 96 puits  ;	Corning  ;   ;	3595
Centrifugeuse  ;	Eppendorf	5810R
Lecteur de plaques	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine forceps	Hammacher GmbH  ;	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	La pince serrefine permet de clamper le vaisseau canulé avec l’aiguille 23 G sans qu’il soit nécessaire de tenir la pince pendant la procédure de perfusion. Lien : (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)  ;
Tubes de cytométrie en flux	BD Biosciences, Falcon  ;
Tubes de microcentrifugation (1,5 ml)	Elkay	; 000-MICR-150
Racleur de cellules	BD Biosciences, Falcon	353086	Coupez les extrémités des lames avec une paire de ciseaux pour gratter les cellules dans des plaques de 24 puits.
Nom de la société de réactifs	;	Numéro de catalogue  ;	Commentaires/Description  ;
; Solution EGTA (acide tétraacétique d’éthylène glycol)/HBSS (solution saline équilibrée de Hank)  ;			HBSS contenant 0,5 mM d’EGTA et 25 mM d’HEPES. Ajustez le pH à 7,4. Préparez 50 ml pour chaque foie à perfuser.   ;
Solution de collagénase  ;			DMEM à faible teneur en glucose contenant de la collagénase de type IV à 100 UI/ml, 15 mM HEPES et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Ajustez le pH à 7,4. Préparez 100 ml pour chaque foie à perfuser. Après avoir ajouté la collagénase, il est conseillé de réchauffer la solution pendant 30 min avant utilisation. Cela permet à l’activité de la collagénase d’être optimale.
Milieu d’isolement cellulaire de Kupffer  ;			RPMI contenant, 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax® ; (v/v) et 1 % de péniclline/streptomycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies.   ;
Milieu de culture cellulaire Kupffer  ;			RPMI contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax® ; (v/v) et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies.   ;
SIP (solution de particules de silice enrobées isotoniques)			Mélanger 1,7 ml de solution saline tamponnée 10x phosphate avec 15,3 ml de Percoll® ; pour obtenir 17 ml de SIP.
Solution SIP à 25 %s  ;			Mélanger 5 ml de SIP avec 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate.   ;
Solution 50 % SIP  ;			Mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate
Tampon de lyse Média			DMEM avec 0,9 %
		PBS/BSA	Préparez une solution saline fraîche tamponnée au phosphate pH 7,4 avec 1 % d’albumine sérique bovine.