Les techniques présentées pour le prélèvement du foie, la canulation et la perfusion à l’aide de notre dispositif exclusif permettent des configurations de perfusion sophistiquées pour améliorer les expériences de décellularisation et de recellularisation dans les foies de rats.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Procédure pour Décellularisation du Rat Livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression
Dans cet article
Résumé
Résumé
La décellularisation et la recellularisation des organes parenchymateux peuvent permettre la génération d’organes fonctionnels in vitro, et plusieurs protocoles de décellularisation du foie de rongeurs ont déjà été publiés. Nous avons cherché à améliorer le processus de décellularisation en construisant un dispositif de perfusion exclusif permettant une perfusion sélective via la veine porte et/ou l’artère hépatique. De plus, nous avons cherché à effectuer une perfusion dans des conditions de pression environnante oscillante pour améliorer l’homogénéité de la décellularisation. L’homogénéité de la décellularisation par perfusion a été un facteur sous-estimé jusqu’à présent. Pendant la décellularisation, les zones de l’organe qui sont mal perfusées peuvent encore contenir des cellules, tandis que la matrice extracellulaire (MEC) dans les zones bien irfusées peut déjà être affectée par les détergents alcalins. Les changements de pression oscillatoires peuvent imiter les changements de pression intra-abdominale qui se produisent pendant la respiration pour optimiser la microperfusion à l’intérieur du foie. Dans l’étude présentée ici, des matrices hépatiques de rat décellularisées ont été analysées par coloration histologique, analyse du contenu en ADN et moulage par corrosion. La perfusion via l’artère hépatique a montré des résultats plus homogènes que la perfusion veineuse porte. L’application de conditions de pression oscillante a amélioré l’efficacité de la décellularisation par perfusion. Les foies perfusés par l’artère hépatique et dans des conditions de pression oscillante ont montré les meilleurs résultats. Les techniques présentées pour le prélèvement du foie, la canulation et la perfusion à l’aide de notre dispositif exclusif permettent des configurations de perfusion sophistiquées pour améliorer les expériences de décellularisation et de recellularisation dans les foies de rats.
Introduction
Décellularisation et recellularization peuvent permettre la génération d'organes transplantables, fonctionnels in vitro 1. En éliminant les cellules et du matériel antigénique (par ex., ADN, des epitopes a-Gal) à partir d'un organe, la matrice extracellulaire non immunogène ou moins (ECM) peut être obtenu. Cette matrice conserve la microanatomie trois dimensions d'un organe et peut servir de biomatrice idéal pour le repeuplement de cellules d'une autre, l'origine xénogénique peut-être deux. Ainsi, une matrice de foie de rat décellularisé peut être repeuplée avec des cellules de foie humain. Ce micro-foie hum....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Les animaux ont été maintenus à la Facilité pour la médecine expérimentale (FEM, Charité, Berlin, Allemagne), et tous les protocoles expérimentaux ont été examinées et approuvées par l'Office d'Etat de la Santé et des Affaires locales (LAGeSo, Berlin, Allemagne;. Reg n ° O 0365 / 11).
1. Foie récolte
- Préparation pré-opératoire
- Utilisez une plaque de liège pour la fixation. Mettez un drap médicale sur la plaque. En utilisant quatre aiguilles, fixer un masque d'inhalation sur la plaque de liège pour peropératoire inhalation narcose.
- Prédisposition du Portail veineuse canule
- Connec....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
L'homogénéité et donc l'efficacité des différents protocoles de décellularisation ont été évalués par observation macroscopique, l'analyse histologique et l'analyse de la teneur en ADN restant à l'intérieur des matrices de foie décellularisés. En outre, la corrosion coulée a été effectuée pour visualiser le microanatomie intacte du foie après décellularisation.
Macroscopie
Pendant décellularisation, foies deviennent lucent, indiquant le retrai.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Bien que la technique présentée pour la récolte de foie de rat et décellularisation est facilement reproductible, il ya certaines étapes critiques à prendre en considération:
Lors de la préparation pour la récolte du foie, il est important d'éviter une hémorragie sévère, car il va activer la coagulation du sang et peut conduire à la formation d'un caillot sanguin dans le foie. À notre avis, il est avantageux d'inciser l'aorte abdominale directement devant une canule dans la v.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier chaleureusement Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens et Katharina Struecker pour leur aide au cours de ce projet.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Canule artérielle auto-construite | |||
| ; Portex Tube en polyéthylène non stérile | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28 mm ID 0,61 mm OD |
| ; Portex Tube en polyéthylène non stérile | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58 mm ID 0,96 mm OD |
| Venodrop Safe Cathéter papillon | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| canule veineuse porte | |||
| Cathéter veineux | périphérique BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| Robinet d’arrêt à trois voies | smiths medical | 888-101RE | |
| Bâtonnets de coton | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotons ; | Shaoxing Zhengde Pansement chirurgical | 13H118-03 | |
| Bandage de gaze | Hubei Haige ; Instruments Médicaux | 14388 | |
| ; Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000 ml |
| 10 ml Seringue | Braun | 4606108V | 10 ml/ Luer Solo |
| 5 ml Seringue | Braun | 4606061V | 5 ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| champ médical | Shaoxing Zhengde Pansement chirurgical | D0613011 | |
| chirurgical porte-aiguilles pour instruments | |||
| Geuder | 17570 | ||
| micro-pince | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-ciseaux | Martin | 11-740-11 | |
| micro-pince | S& T ; | ||
| Pince | Aesculap | BH111R | |
| ciseaux | F S T ; | 14501-14 | |
| pince chirurgicale | Aesculap | BD 557 | |
| Respirateur | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Dispositif de perfusion | Charite, laboratoire de génie médical | dispositif sur mesure | décellularisation |
| pompe péristaltique ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 ; | 4 canaux |
| Hélidelberger rallonge 75 cm ; | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA segment | de pompe IDEX | IS 3510 ; | MS/CA/click’n’go/POM-C |
| CA Tube à 2 bouchons | Piège | BPT NSF-51 | |
| ; | article | ||
| Raccord de tuyau Luer Lock | Neolab | n° 02-1887 | |
| Détergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth ; | CN30.4 ; | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth ; | 3051.1 ; | 10 L |
| PBS ; | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| coloration | |||
| Eosin 1 % | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hématoxyline | AppliChem | A4840 | |
| coloration gomori | Morphisto | 11104 | |
| coloration AlcainBlue-PAS | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 ; | Sigma Aldrich | 365548 |
Références
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
