Procédure pour Décellularisation du Rat Livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression

Résumé

Les techniques présentées pour le prélèvement du foie, la canulation et la perfusion à l’aide de notre dispositif exclusif permettent des configurations de perfusion sophistiquées pour améliorer les expériences de décellularisation et de recellularisation dans les foies de rats.

Résumé

La décellularisation et la recellularisation des organes parenchymateux peuvent permettre la génération d’organes fonctionnels in vitro, et plusieurs protocoles de décellularisation du foie de rongeurs ont déjà été publiés. Nous avons cherché à améliorer le processus de décellularisation en construisant un dispositif de perfusion exclusif permettant une perfusion sélective via la veine porte et/ou l’artère hépatique. De plus, nous avons cherché à effectuer une perfusion dans des conditions de pression environnante oscillante pour améliorer l’homogénéité de la décellularisation. L’homogénéité de la décellularisation par perfusion a été un facteur sous-estimé jusqu’à présent. Pendant la décellularisation, les zones de l’organe qui sont mal perfusées peuvent encore contenir des cellules, tandis que la matrice extracellulaire (MEC) dans les zones bien irfusées peut déjà être affectée par les détergents alcalins. Les changements de pression oscillatoires peuvent imiter les changements de pression intra-abdominale qui se produisent pendant la respiration pour optimiser la microperfusion à l’intérieur du foie. Dans l’étude présentée ici, des matrices hépatiques de rat décellularisées ont été analysées par coloration histologique, analyse du contenu en ADN et moulage par corrosion. La perfusion via l’artère hépatique a montré des résultats plus homogènes que la perfusion veineuse porte. L’application de conditions de pression oscillante a amélioré l’efficacité de la décellularisation par perfusion. Les foies perfusés par l’artère hépatique et dans des conditions de pression oscillante ont montré les meilleurs résultats. Les techniques présentées pour le prélèvement du foie, la canulation et la perfusion à l’aide de notre dispositif exclusif permettent des configurations de perfusion sophistiquées pour améliorer les expériences de décellularisation et de recellularisation dans les foies de rats.

Introduction

Décellularisation et recellularization peuvent permettre la génération d'organes transplantables, fonctionnels in vitro ^1. En éliminant les cellules et du matériel antigénique (par ex., ADN, des epitopes a-Gal) à partir d'un organe, la matrice extracellulaire non immunogène ou moins (ECM) peut être obtenu. Cette matrice conserve la microanatomie trois dimensions d'un organe et peut servir de biomatrice idéal pour le repeuplement de cellules d'une autre, l'origine xénogénique peut-être ^deux. Ainsi, une matrice de foie de rat décellularisé peut être repeuplée avec des cellules de foie humain. Ce micro-foie humanisé pourrait servir de modèle ex vivo pour la recherche sur les maladies (par exemple, des maladies métaboliques. Innées, les maladies virales ou malignes) ou pour les tests pharmaceutique préclinique ^3.

Plusieurs protocoles différents pour le foie de rat perfusion décellularisation ont déjà été publiés ^4-13. Dans tous les protocoles, decellularsation a été réalisée par perfusion de détergents ioniques ou non ioniques alcalins via la veine canulée. Pour le meilleur de nos connaissances, nous étions le premier groupe à signaler rat décellularisation du foie par perfusion sélective via la veine porte et / ou le rat de l'artère hépatique ^14. Activation de la perfusion sélective des différents systèmes vasculaires dans le foie peut permettre de meilleurs résultats de décellularisation et, en outre, peut jouer un rôle important dans repeuplement cellulaire.

Dans l'étude détaillée ici, foies ont été perfusés dans un dispositif de perfusion exclusive sur mesure, permettant perfusion dans des conditions de pression oscillants. Ces conditions de pression imitent la perfusion respiratoire dépendant physiologique du foie: in situ, le foie se suspend sous la copule de la membrane, dont le mouvement lors de la respiration a un impact direct sur ​​la perfusion du foie. Inspiration conduit spécifiquement à l'abaissement du diaphragme et pressant du foie, en optimisanthépato-veineuse sortie, tandis expiration conduit à l'élévation du foie et de l'abaissement de la pression intra-abdominale d'optimiser afflux portail ^15-veineuse.

Notre objectif était d'évaluer si oscillant conditions de pression ont un impact sur ​​l'homogénéité de foie de rat perfusion décellularisation en imitant les conditions intra-abdominales ex vivo. L'homogénéité du processus de décellularisation peut être un facteur sous-estimé dans la perfusion décellularisation. Tous les agents connus utilisés pour décellularisation de provoquer des altérations du foie à l'ECM. Les cellules dans les zones mal perfusés restent dans l'ECM, alors que d'autres zones sont déjà complètement décellularisée. Pour dissoudre les cellules restantes, la durée de perfusion ou de pression doivent être élevés, causant plus de modifications dans les zones bien irrigués. Ainsi, les détergents pour décellularisation devraient être distribués de manière homogène au sein de l'organe.

Protocole

Les animaux ont été maintenus à la Facilité pour la médecine expérimentale (FEM, Charité, Berlin, Allemagne), et tous les protocoles expérimentaux ont été examinées et approuvées par l'Office d'Etat de la Santé et des Affaires locales (LAGeSo, Berlin, Allemagne;. Reg n ° O 0365 / 11).

1. Foie récolte

1. Préparation pré-opératoire
   1. Utilisez une plaque de liège pour la fixation. Mettez un drap médicale sur la plaque. En utilisant quatre aiguilles, fixer un masque d'inhalation sur la plaque de liège pour peropératoire inhalation narcose.
2. Prédisposition du Portail veineuse canule
   1. Connecter un cathéter veineux périphérique (G 20) pour un robinet d'arrêt à trois voies. Cathéter veineux doit être coupé obliquement, avec une longueur d'env. 1,5 cm.
   2. De l'air le système en utilisant une seringue de 10 ml remplie de solution de Ringer. Il est très important de bien désaérer parce embolie gazeuse peut affecter négativement la décellularisation de perfusion.
3. Prédispositionde la canule artérielle
   1. Utilisez une canule papillon et couper l'aiguille à une longueur de 5 mm. Monter un tube de 5 cm (ID 0,58 mm; OD 0,96 mm) à l'aiguille de 5 mm et la fixer avec de la colle. Insérez un tube de 2 cm de long (ID 0,28 mm; OD 0,61 mm) dans le plus grand tube et le fixer avec de la colle.
   2. Glissez un autre tube sur cette construction comme une butée et le fixer avec de la colle. De l'air de la canule artérielle avec une seringue de 5 ml rempli d'une solution de Ringer.
4. Anesthésie et l'analgésie
   1. Induire une narcose du rat dans la chambre d'induction de l'anesthésie par 3,5% d'isoflurane dans de l'oxygène à un débit de 1,5 L / min.
   2. Pour assurer une analgésie sécuritaire pendant l'opération, injecter metamizol (100 mg / kg de masse corporelle) et la kétamine à faible dose / médétomidine (10 mg / 0,1 mg par kg de masse corporelle) par voie intrapéritonéale.
   3. Fournir 1,5% d'isoflurane dans 1 L / min d'oxygène via le masque d'inhalation pour l'entretien ultérieur de l'anesthésie chirurgicale.
5. Arrangements préopératoires
   1. Raser l'abdomen généreusement avec une cisaille électrique. Humidifier le site de l'incision de l'abdomen rasé de l'éthanol à 70% pour la désinfection.
   2. Placez l'animal dans la position couchée sur la plaque préparée, insérer la tête dans le masque d'inhalation et de fixer les branches avec du ruban adhésif médical et broches. Enlever l'excès de l'éthanol et de la fourrure avec une compresse de gaze.
6. Évaluation de l'anesthésie
   1. Évaluer la profondeur de l'anesthésie en observant la fréquence respiratoire. Lorsque l'anesthésie semble assez profond (40-60 respirations / min), vérifier si l'analgésie est suffisante en essayant de déclencher le réflexe orteil pincée aide de pinces chirurgicales de pincer la peau entre les orteils des deux membres postérieurs.
7. Approche abdominale
   1. Faire une incision médiane dans la paroi abdominale caudale dessus de la vessie. Couper de ce point à deux arches latérales côtières dans une forme de V. Prenez soin de ne pas couper dans le diaphragme. Tirez sur la paroi abdominale couper sur la poitrine.
   Fixer la pointe du sternum avec une pince de Overholt, tirez-crânienne et le fixer avec une bande de caoutchouc. Utilisez des cotons-tiges humides d'évacuer l'intestin. Enveloppez l'intestin dans un bandage de gaze humide. En outre, couvrir toutes les marges abdominaux avec une compresse humide.
8. Préparation du foie
   1. Disséquer le ligament falciforme. Utilisez un pansement de gaze humide pour maintenir les lobes du foie médiales et gauche crânialement sous le dôme du diaphragme. Exposer le pédicule hépatique et l'omental lobe du foie supérieure.
   2. Utilisez deux microforceps et ciseaux à ressort à disséquer soigneusement le ligament attaché au lobe omental supérieure jusqu'à ce que le lobe est mobile. Déplacez le lobe utilisant des cotons-tiges humides sous la compresse de gaze, tenant les lobes médian et gauche en place.
   3. Après la mobilisation de l'omental lobe hépatique supérieure, déplacer l'estomac vers la gauche. Fixer l'estomac avec une pince et de disséquer l'épiploon mineur avec microforceps et les ciseaux à ressort.
   4. Mobiliser l'omenta inférieurel de lobe de foie jusqu'à ce qu'il est mobile et se déplacer ensuite le lobe de retour dans sa cavité. Utilisez une pince Backhaus de conserver le duodénum. Déplacez le duodénum vers la gauche pour étirer et exposer le pédicule hépatique. Circonscrire le canal cholédoque dans le ligament hépato étiré.
   5. On dissèque la voie biliaire principale du tissu adipeux et du pancréas. Couper le canal biliaire 1,5 cm de la bifurcation de la voie biliaire. Disséquer la veine porte du tissu adipeux environnant. Exposer la veine gastro-duodénale.
   6. Ligaturer la veine gastro deux fois avec de la soie 6-0 et diviser la veine entre les deux ligatures. Disséquer le tronc coeliaque et l'artère hépatique commune du tissu environnant jusqu'à ce que tous rami artérielle sont révélés.
   7. Libérer l'artère gastro-duodénale du tissu environnant. Attachez l'artère gastro-duodénale deux fois avec de la soie 6-0, avec les liens éloignés les uns des autres. Disséquer l'artère gastro-duodénale entre les deux ligatures.
   8. Libérer l'artère spléniquedu tissu environnant. Attachez l'artère splénique deux fois avec de la soie 6-0, avec les liens éloignées l'une de l'autre. Disséquer l'artère splénique entre les deux ligatures.
   9. Libérer l'artère gastrique gauche du tissu environnant. Attachez l'artère gastrique gauche deux fois avec de la soie 6-0, avec les liens éloignés les uns des autres. Disséquer l'artère entre les deux ligatures.
   10. Circonscrire la veine cave inférieure entre le rein droit et le lobe droit du foie latérale. Disséquer la veine de l'espace rétro-péritonéal. Exposer l'aorte en suivant le tronc cœliaque.
   11. Disséquer le tissu adipeux rétropéritonéale. Injecter 1,000 IE héparine dans 1 ml de sérum physiologique dans la veine cave inférieure. Rétracter la canule et fermer l'incision avec un tampon de coton. Attendez 1-2 min de l'effet systémique de l'héparine.
   12. Circonscrire l'aorte avec une pince. Disséquer l'aorte et être exsangue le rat. En outre, disséquer la veine cave inférieure de manière distale depuis le rein.
9. Portail veineuse Canulation (utilisation de la canule préparé dans la section 1.2)
   1. Faire une incision poissons-bouche dans la veine distale. Ouvrez l'incision avec une pince et cathétériser la veine porte. Rincez le foie avec 20 ml de solution de Ringer jusqu'à ce que les décolore hépatiques et fixer la canule avec ligatures (soie 6-0).
10. Arterial Canulation (utilisation de la canule préparé dans la section 1.3)
    1. Disséquer l'aorte au-dessus du tronc cœliaque. Libérer le segment de l'aorte de l'espace rétro-péritonéal. Couper le segment de l'aorte longitudinalement pour générer un correctif aortique. Insérez la canule construit soi-même dans un support statique.
    2. Utilisez 2 pinces à glisser le patch aortique au cours de la canule. Ligaturer l'artère hépatique avec de la soie 6-0 sur la canule et fixer le patch à la butée.
11. Foie explantation
    1. Ouvrez le diaphragme, faire une incision circulaire et de disséquer le foie contre les structures environnantes.
12. Stockage
    1. Store le foie dans un réservoir de 500 ml stérile rempli de 350 ml de solution de Ringer jusqu'à utilisation.

2. détergents Solutions

1. Solution à 10% de Triton X-100 actions
   1. Remplissez une bouteille de 1000 ml avec 900 ml d'eau distillée. et ajouter 100 ml de Triton X-100 (99,9%). Utilisation d'un agitateur pour dissoudre le Triton X-100. Remplir la bouteille avec de l'eau distillée. jusqu'à un volume total de 1000 ml soit atteinte.
2. 1% de Triton X-100
   1. Ajouter 100 ml de la solution mère (10%) pour une bouteille de 1000 ml. Ajouter 900 ml d'eau distillée. et secouer deux fois la bouteille. Filtrer la solution à 1% de Triton X-100 à travers un filtre stérile.
3. 10% de SDS Stock Solution
   1. Remplissez une bouteille de 1000 ml avec 900 ml d'eau distillée. et d'ajouter 66,99 g SDS (99,9%, la densité de 0,67). Utiliser un agitateur pour dissoudre le SDS. Remplir la bouteille avec de l'eau distillée. jusqu'à un volume total de 1000 ml soit atteinte.
4. 1% de SDS
   1. Ajouter 100 ml de la solution mère (10%) à un 1000 ml botTLE. Ajouter 900 ml d'eau distillée. et secouer deux fois la bouteille. Filtrer la solution à 1% de SDS à travers un filtre stérile.

3. Décellularisation

1. Set-up de perfusion périphérique

Figure 1:. Schéma de l'appareil de perfusion pour l'artériopathie sélective et Portal veineuse perfusion des Quatre Rat Livers sous oscillants Conditions de pression (. Modifié depuis Struecker et al ¹⁴⁾

1. Relier le drain à un robinet à trois voies et une extension Heidelberger pour réguler le niveau de remplissage et remplir le réacteur avec 500 ml de NaCl 0,9%.
   

Figure 2:. Schéma de la perfusion set-up Lier la chambre de perfusion (1400 cm ³⁾ (1) à l'extrémité distale (4) du piège à bulles (5) via l'accès veineux portal (2) ou via l'ac artérielleprocessus (3). Le piège à bulles (5) doit être équipé d'une obturation (4) à l'extrémité distale et un évent (6). Branchez le piège à bulles (5) à une extension Heidelberger (7). Liez l'extension Heidelberger au segment de pompe (8). En outre, connecter le segment de pompe (8) à un autre poste Heidelberger (9). Insérez la dernière prorogation Heidelberger (9) dans le flacon de solution de détergent (10). Connecter le respirateur (11) à la chambre de perfusion (ou de la distribution de pression dans le cas des perfusions multiples). Pour drainer les fluides de réacteurs, connectez la sortie à la bouteille de déchets (12).

1. Insérez le segment de pompe dans la pompe. Démarrer la pompe pour combler le cycle avec du PBS, fermer l'extrémité distale de la piège à bulles et d'ouvrir l'évent. Lorsque le fond de la bulle est bien couvert avec du PBS (2-3 cm), fermez l'évent et ouvrir l'extrémité distale de la piège à bulles.
2. Foie Installation
   1. Liez le robinet à trois voies de la canule de la veine à l'accès du réacteur connexe. Connect la canule artérielle à l'accès artériel. Veillez à ce que l'air ne pénètre dans les systèmes.
3. Application de oscillantes Conditions de pression
   1. Utiliser un respirateur avec une fréquence de 15 battements par minute et une amplitude de 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Connectez le respirateur à la chambre de répartition de la pression et de relier la chambre du réacteur. Lancement de l'application de la pression.
4. Protocole de Décellularisation
   1. Effectuer les étapes de perfusion avec un débit de 5 ml / min de débit. Lancer la décellularisation de la perfusion du foie avec 1% de Triton X-100 pendant 90 min. Autoriser déchets effluents via la sortie du dispositif de perfusion pour maintenir le niveau du liquide à l'intérieur de la constante de la chambre de perfusion et du foie perfusé. Après 90 min, changer le détergent à 1% de SDS.
      
      

Figure 3: Protocole de perfusion pour tous les groupes expérimentaux.

Résultats

L'homogénéité et donc l'efficacité des différents protocoles de décellularisation ont été évalués par observation macroscopique, l'analyse histologique et l'analyse de la teneur en ADN restant à l'intérieur des matrices de foie décellularisés. En outre, la corrosion coulée a été effectuée pour visualiser le microanatomie intacte du foie après décellularisation.

Macroscopie

Pendant décellularisation, foies deviennent lucent, indiquant le retrait de contenu cellula...

Discussion

Bien que la technique présentée pour la récolte de foie de rat et décellularisation est facilement reproductible, il ya certaines étapes critiques à prendre en considération:

Lors de la préparation pour la récolte du foie, il est important d'éviter une hémorragie sévère, car il va activer la coagulation du sang et peut conduire à la formation d'un caillot sanguin dans le foie. À notre avis, il est avantageux d'inciser l'aorte abdominale directement devant une canule dans la v...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Canule artérielle auto-construite
; Portex Tube en polyéthylène non stérile	SIMS Portex	REF 800/110/100	0,28 mm ID 0,61 mm OD
; Portex Tube en polyéthylène non stérile	SIMS Portex	REF 800/110/200	0,58 mm ID 0,96 mm OD
Venodrop Safe Cathéter papillon	Fresenius Kabi	3275851	21 G
canule veineuse porte
Cathéter veineux	périphérique BD	393224	BD Venflon Pro 20G
Robinet d’arrêt à trois voies	smiths medical	888-101RE
Bâtonnets de coton	Hecht-Assistent	4302
Cotons  ;	Shaoxing Zhengde Pansement chirurgical	13H118-03
Bandage de gaze	Hubei Haige  ; Instruments Médicaux	14388
; Ringer Solution	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml Seringue	Braun	4606108V	10 ml/ Luer Solo
5 ml Seringue	Braun	4606061V	5 ml /Luer Solo
Suture (Silk 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
champ médical	Shaoxing Zhengde Pansement chirurgical	D0613011
chirurgical porte-aiguilles pour instruments
	Geuder	17570
micro-pince	Inox-Electronic	91150-20
micro-ciseaux	Martin	11-740-11
micro-pince	S& T  ;
Pince	Aesculap	BH111R
ciseaux	F S T  ;	14501-14
pince chirurgicale	Aesculap	BD 557
Respirateur	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Dispositif de perfusion	Charite, laboratoire de génie médical	dispositif sur mesure	décellularisation
pompe péristaltique ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408  ;	4 canaux
Hélidelberger rallonge 75 cm  ;	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA segment	de pompe IDEX	IS 3510  ;	MS/CA/click’n’go/POM-C
CA Tube à 2 bouchons	Piège	BPT NSF-51
;		article
Raccord de tuyau Luer Lock	Neolab	n° 02-1887
Détergents
SDS pellets	Carl Roth  ;	CN30.4  ;	2,5 kg
Triton X-100	Carl Roth  ;	3051.1  ;	10 L
PBS  ;	Gibco	14190-094	DPBS
coloration
Eosin 1 %	Morphisto	10177
Mayer hématoxyline	AppliChem	A4840
coloration gomori	Morphisto	11104
coloration AlcainBlue-PAS	Morphisto	11388
Direct Red 80  ;	Sigma Aldrich	365548