L’utilisation d’un dispositif simple pour couper et « rouler » des intestins de souris afin de préparer rapidement des préparations entières est décrite.
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Article de méthode
Un dispositif simple d'élaborer rapidement entiers Monts de l'intestin de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Préparation montures entières de l'intestin grêle et le côlon de la souris pour l'analyse ou la quantification ultérieure peut être longue et difficile. Nous décrivons l'utilisation d'un dispositif simple de couper et les intestins 'roll' de la souris pour préparer rapidement les préparatifs entiers de montage de qualité supérieure et uniforme à ce qui peut être réalisé à la main. Le dispositif comprend une base qui contient 4 tiges en acier inoxydable et une partie supérieure, qui sert de guide de coupe. Les tiges sont insérés dans le lumen de l'intestin grêle [divisé en tiers] et le côlon. Les tiges et les échantillons sont ensuite placés sur un morceau de papier ou de carton filtre dans les fentes de retenue dans la base de l'appareil. La partie supérieure du dispositif est alors positionné et sert de guide de coupe. Les deux sections inclinées dans le centre de la pièce supérieure sont utilisés pour guider un couteau ou un scalpel et les intestins coupés longitudinalement sur la partie supérieure des tiges. Une fois les sections intestinales ont été coupés, le supérieur est retiré et la carte, tissue et les tiges délicatement retiré de l'appareil et placé sur le banc. Les tiges sont ensuite roulées délicatement sur le côté pour aplatir et coller les segments intestinaux sur la pièce sous-jacente de papier ou de carton filtre. La préparation finale peut ensuite être examinée et fixée ou stockée pour une analyse ultérieure. Les préparatifs sont très précieux pour l'étude des changements dans les modèles intestinales normales ou génétiquement modifiées souris. Les préparations ont été utilisées pour l'étude et la quantification des effets de l'inflammation (colite), des dommages, des lésions pré-cancéreuses (foyers de cryptes aberrantes (ACF) et mucine foyers (MDF) appauvri) et des polypes ou des tumeurs.
Introduction
La souris et la souris génétiquement modifiée 1-3 sont un modèle inestimable pour l'étude de diverses pathologies cancéreuses en particulier et de sa relation à l'inflammation dans le tractus gastro-intestinal. Cela nécessite souvent la préparation de supports entiers de l'intestin grêle et / ou du côlon.
La préparation des montures entières peut être fait avec une paire de ciseaux de décalage de précision, mais il peut prendre environ 20 minutes par souris 4. Ce ne sont pas très pratique pour des études comparatives, qui nécessitent une quantité importante de souris (disons 10 par groupe soumis à une analyse statistique). En outre, la longueur de temps nécessaire augmente le risque de dégradation tissulaire. Une tentative pour atténuer ce problème a conduit à l'essai de diverses aides à la préparation de coupe. Le premier a été basé sur une série de plaques de métal, avec des bosquets de coupe, mais les plaques occulté les tissus et la coupe était donc difficile à contrôler.
Un conventional crayon à six faces finalement fourni l'inspiration pour le dispositif de coupe, comme nous pourrions alors voir comment une forme de demi-crayon ferait un bon guide pour un scalpel (Figure 1). Cela a abouti à la conception d'un cadre avec quatre guides de coupe 5. L'efficacité de ce dispositif a été spectaculaire que les préparatifs de la figure 4 démontrent la différence entre la préparation de ciseaux et de la préparation de l'appareil.
Les sommets des dispositifs original a été construit à partir de plusieurs morceaux de métal, mais ceux plus tard, et le modèle actuel a été usiné sur un morceau solide de duralumin. La base a été usinée en résine haute densité plus haute qualité.
Le dispositif est avéré être d'une grande utilité pour la préparation de supports entiers de intestin de la souris car il accélère grandement et améliore la qualité et la cohérence des préparatifs, qui ont un large éventail d'applications.
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Protocole
Les différentes procédures expérimentales et l'euthanasie sont approuvés par le comité d'éthique institutions d'accueil et par les organismes de réglementation appropriés. L'euthanasie est normalement effectuée en utilisant CO 2 asphyxie suivie par dislocation cervicale.
1. Dispositif
- Machine de la partie principale de la base de l'appareil à partir d'un bloc solide de résine acétyl-haute densité, tel que décrit dans ce manuscrit. A chaque extrémité de créer 3 mm de haut-élevé bandes, et une partie machine hors de ces 2,5 mm bosquets de prendre les tiges (voir la figure 2 et la figure 3).
- Assurez-barres de l'acier inoxydable d'un diamètre de 2,4 mm avec des extrémités arrondies.
REMARQUE: Le cadre principal du couvercle a été usiné sur plaque de Duralumin. Un nombre limité de dispositifs finis sont disponibles à partir de Dr. Goodlad.
2. Utilisation du dispositif
- Disséquer l'intestin grêle et le côlon à partir de la cavité abdominale à l'aide de ciseauxet doigts gantés. Retirez le mésentère en le tenant avec des pinces courbes et en tirant doucement à l'écart de l'intestin.
- Rincer les intestins avec du phosphate froide saline tamponnée (PBS, pH 7,4) à l'aide d'une pipette de type Gilson, qui avait été coupé à son extrémité la plus large de sorte qu'il puisse tenir sur un raccord seringue en plastique de 10 ou 20 ml luer.
- Disposez l'intestin grêle (SB) sur une feuille de papier absorbant et diviser en trois parties égales en longueur (proximale, moyenne et distale - SB1, SB2 et SB3) en utilisant des ciseaux. Retirer le caecum et de jeter le côlon.
- Faire plusieurs très petites coupures dans les segments intestinaux avec des ciseaux pour permettre au fluide d'échapper et de placer une feuille de serviette en papier sur les intestins et doucement courir un doigt sur les préparatifs pour faire sortir le fluide et le sécher.
- Soulever les sections et insérer les tiges en acier inoxydable qui ont été précédemment mouillés par trempage dans un bêcher de solution saline tamponnée au phosphate.
NOTE: L'intestin peut être enconverti si désiré (tourné à l'envers). - Étiqueter un morceau de carton ou de papier filtre coupe à la taille pour tenir dans la base de l'appareil. Crayon est la meilleure, car elle est affectée par la quasi-totalité des solutions. Date de l'autopsie, code expérimental et le numéro d'identification des animaux sont suggérées.
- Placez la carte ou papier filtre dans la base de l'appareil. Insérer les tiges et les intestins dans les fentes de la base de l'appareil. Assurez-vous que l'extrémité proximale des segments est positionné de manière standardisée. Les extrémités proximales devraient être près les étiquettes de cartes.
- Placez la partie supérieure de l'appareil sur la base. Utilisez les barres obliques pour guider une lame de scalpel pour couper longitudinalement les sections.
NOTE: Il aide si le tissu est doucement et soigneusement tenue avec un doigt pour veiller à ce qu'il ne se déplace pas avec le couteau. - Retirer la partie supérieure de l'appareil. Retirez délicatement le papier et tissus filtre (toujours sur leurs tiges).
REMARQUE: Un morceau de carton rigide placés sous le filpapier ter aidera levage. - Légèrement humide (avec un doigt ganté trempé dans PBS) les segments. Rouler la tige, côté à l'autre d'ouvrir l'intestin et l'étaler à plat. Le tissu sera ensuite adhérer au papier filtre.
- Examiner visuellement les préparatifs pour des lésions macroscopiques.
- Transférer le tissu adhéré au papier filtre pour un bain peu profond (ou boîte à sandwich) contenant fixateur.
NOTE: Après le tissu adhère à la papier filtre ou à la carte, il restera fermement attaché. Une large gamme de fixateurs peut être utilisé pour conserver la préparation. Il est recommandé que le liquide de Carnoy doit être utilisé pour l'étude des proliférations cellulaires intestinales 6, ce qui est idéal pour la fixation des meilleures méthodes de prolifération cellulaire; cependant la formaline ou d'autres fixateurs peuvent également être utilisés si d'autres paramètres sont nécessaires. - Après fixation (généralement 3 h), transférer les préparatifs dans 70% d'éthanol. Les échantillons peuvent ensuite être stockés jusqu'à utilisation. Les préparations cun être étudié en visage et / ou utilisés pour la préparation des échantillons histologiques pour H & E ou d'autres techniques de coloration histologique, immunohistochimique et / ou hybridation in situ.
REMARQUE: fixation prolongée peut réduire la réactivité immunohistochimique et / ou l'hybridation in situ réactivité. Boîtes à sandwich polypropylène sont idéales pour stocker un grand nombre de préparations. - Si nécessaire les tissus fixés à partir des différents segments intestinaux peut être transformé en «roulés» et colorées avec toute la gamme des méthodes histologiques 6, y compris ceux décrits ci-dessus. Pour faire un 'roll suisse »les segments intestinaux sont retirés du papier filtre, enroulé autour d'un bâtonnet à cocktail ou un cure-dent, fixé avec une broche entomologique et traitée pour la cire intégrant 6.
- Si nécessaire, tacher le tissu en vrac avec du bleu de méthylène pour visualiser foyers de cryptes aberrantes 7.
- Note les préparations fixées auloisirs.
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Résultats
Les polypes sont faciles à identifier sous un stéréomicroscope avec une source de lumière froide à l'autre illuminer le tissu (Figure 4). Il est utile de marquer la carte avec les marques de crayon quand un polype est observée afin que la notation peut être discuté plus tard et différents opérateurs peut parvenir à un accord. Le tissu peut également être teinté vrac [au bleu de méthylène] pour identifier les foyers de cryptes aberrantes 8 ou mucine foyers appauvri (MDF) 9 par l...
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Discussion
Le dispositif accélère grandement le processus de sorte que deux opérateurs peuvent autopsie complète d'une souris dans 6 min. Cela inclura un contrôle visuel pour les lésions macroscopiques évidentes et de pesage et fixant les principaux organes. Il permettra également aux opérateurs de rincer, Blot et pèsent l'estomac, le caecum, l'intestin grêle et du côlon et de préparer l'ensemble des supports. Le tissu aplati peut être fixé très rapidement et ainsi éviter des artefacts de dégradation.
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
L’évolution du dispositif a commencé avec un prototype de coupe quelque peu différent présenté au club de souris de l’Imperial Cancer Research Fund (ICRF) par Bass Hassan, à la suite de cela, il y a eu plusieurs discussions avec Rob Rudling et Nikki Mandir dans l’installation de confinement de l’ICRF Clare Hall. Jo Kitau de l’atelier mécanique de l’ICRF a construit les versions initiales et Andy Lucas a conçu et perfectionné le modèle final dans l’atelier CRUK à Oxford.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, Royaume-Uni | Un matériau similaire à la résine acétal haute densité suffirait à la | |
| plaque de Duralumin | Metal Supplies Ltd, Park Road, Dukinfield. SK16 5LP UK | Aluminium permet de dater de 1909 afin que des fournisseurs alternatifs soient disponibles. | |
| Dispositif(s) fini(s) prêt à l’emploi | Contactez le Dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk r.goodlad@imperial.ac.uk | pour plus de détails sur l’approvisionnement |
Références
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
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